張由明，章銀軍，沈雪亮

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

綠咖啡豆中綠原酸的分離純化

張由明，章銀軍，沈雪亮

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

對(duì)未烘焙綠咖啡豆中綠原酸的分離純化進(jìn)行深入研究。采用熱水重復(fù)分批浸提法，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法，獲得了綠咖啡豆中綠原酸的最佳提取條件：溫度79.8℃，溶劑pH值2.8，料液比1∶6，提取時(shí)間3.0 h，綠原酸的最大提取得率為92.0%。比較了多種不同規(guī)格的樹脂對(duì)綠原酸的分離純化效果，最終選用XDA-8大孔樹脂，在優(yōu)化后的最適工藝條件下，綠原酸含量可達(dá)70.9%，回收率達(dá)85.4%。進(jìn)一步采用高效液相制備色譜獲得了高純度（95.2%）的綠原酸。所建立的綠原酸制備工藝操作簡(jiǎn)便、高效環(huán)保，產(chǎn)品功效明確，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

綠原酸；綠咖啡豆；提取；純化；樹脂

綠咖啡豆是茜草科植物咖啡樹的種子，含有豐富的活性物質(zhì)［1］，其中綠原酸及其同系物是咖啡豆主要的多酚類活性成分，在新鮮咖啡豆中含量占2%～8%［2］。綠原酸是植物體有氧呼吸代謝的產(chǎn)物［3］，具有多種生物活性，如心血管保護(hù)作用、抗氧化作用、抗誘變及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫調(diào)節(jié)作用等［4-7］，在醫(yī)藥、化工和食品等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。美國(guó)科學(xué)家最新研究認(rèn)為，綠咖啡豆提取物具有良好的減肥、降血壓功能［8-9］，目前以綠咖啡豆提取物為主要成分的多種保健品已大量推向市場(chǎng)。

目前文獻(xiàn)中用于提取綠原酸的底物主要有金銀花［10-12］和杜仲葉［13-15］，而少有從綠咖啡豆中提取綠原酸并進(jìn)行應(yīng)用性試驗(yàn)的報(bào)道。通過(guò)前期對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：采用醇提取工藝需要消耗大量的乙醇；酶法提取常常由于受到提取溫度和pH值的限制，使綠原酸得率偏低；而水提法既克服了消耗乙醇產(chǎn)生的成本問(wèn)題，又可以通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和溶劑pH值來(lái)提高綠原酸得率。所以實(shí)驗(yàn)是以綠咖啡豆中綠原酸為研究對(duì)象，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化水提工藝條件，進(jìn)一步采用大孔樹脂和高效液相制備色譜分離、純化綠原酸［16-18］，旨在建立一條操作簡(jiǎn)單、得率較高、綠色環(huán)保的綠原酸提取分離純化工藝流程，為綠咖啡豆中綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

綠咖啡豆（Coffee arabica）：未經(jīng)烘焙，由浙江天草生物科技有限公司提供。

大孔樹脂：型號(hào)分別為D101、XDA-8、LSA-10、LSA-21、HZ-806、HZ-816、HZ-818、AB-8、HPD-850、D4020、NKA-9、DM-130。

1.2方法

1.2.1綠原酸提取工藝

按照下述工藝流程，提取次數(shù)為3次，每次2 h，料液比1∶8（W/V），溫度80℃，pH值為3，分別考察溫度（65、70、75、80、85、90℃）、溶劑pH值（2、3、4、5、6、7）、料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）等因素對(duì)綠原酸得率的影響。

工藝流程：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液提取→過(guò)濾→合并提取液→稱量體積→液相檢測(cè)含量

1.2.2響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用響應(yīng)面法，采用Box-Benhnken模型，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以提取得率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平

1.2.3綠咖啡豆提取液中綠原酸的純化

1）不同樹脂對(duì)綠原酸的靜態(tài)吸附和解析性能比較：選取12種不同規(guī)格的大孔樹脂，預(yù)處理后分別準(zhǔn)確稱取1.0 g于50mL錐形瓶中，分別加入20mL已知綠原酸含量的綠咖啡豆提取液，在25℃、200 r/min的恒溫振蕩器中振蕩24 h，吸附完成后過(guò)濾，測(cè)定濾液中綠原酸的含量，計(jì)算各樹脂的吸附量和吸附率；將靜態(tài)吸附飽和的樹脂放入50 mL錐形瓶中，分別加入70%的乙醇20 mL，同上條件下振蕩24 h，待解析完全后過(guò)濾，測(cè)定濾液中綠原酸的含量，計(jì)算各樹脂的解析量和解析率。每種樹脂進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值。

2）大孔樹脂XDA-8對(duì)綠原酸的動(dòng)態(tài)吸附和解析工藝研究：準(zhǔn)確稱取10 g XDA-8大孔樹脂，經(jīng)預(yù)處理后濕法裝入16 mm×300 mm的玻璃層析柱中作為吸附柱，使用前用超純水沖洗至無(wú)醇味，動(dòng)態(tài)上樣吸附，乙醇解析純化綠咖啡豆提取液中的綠原酸，對(duì)不同的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4綠原酸含量測(cè)定

1）色譜條件：綠原酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法（HPLC）。檢測(cè)條件：ODS-C18色譜柱（Welchrom 5μm，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相A：V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=250∶750∶1；流動(dòng)相B：V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=100∶900∶1；采用梯度洗脫（0～2min，保持溶液B 100%不變；2～25min，溶液B 100%～0%；25～28min，溶液B 0%不變；28～30 min，溶液B 0%～100%；30～35 min，溶液B 100%不變）；柱溫：25℃；進(jìn)樣：10μL；流速：1mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品14.4 mg，用50%甲醇稀釋成28.8、57.6、86.4、115.2、144μg/mL梯度濃度標(biāo)樣，HPLC檢測(cè)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：y=29 570x-190 000。

3）綠原酸提取得率計(jì)算：依據(jù)HPLC色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別檢測(cè)綠咖啡豆原料及提取液中綠原酸的含量，按照以下公式計(jì)算綠原酸的提取得率。

1.2.5吸附量和解析量計(jì)算方法

式中：Q為吸附量（mg/g）；a為吸附率（%）；C0為起始濃度（mg/mL）；Cv為濾液濃度（mg/mL）；V1為溶液體積（mL）；W為樹脂質(zhì)量（g）（此計(jì)算方法假設(shè)吸附前后體積不變）；Q2為解析量（mg/g）；C2為解析液濃度（mg/mL）；V2為解析液體積（mL）；b為解析率（%）。

1.2.6高純度綠原酸分離純化

采用ODS-BP-L，SP-120-15柱，以乙腈和0.4%磷酸溶液按體積比12∶88混合成的溶液為流動(dòng)相，控制流速為4 mL/min，進(jìn)樣10 mL濃縮液制備高純度綠原酸。分段收集流出液，并液相檢測(cè)。

2　結(jié)果與討論

2.1綠原酸提取工藝研究

2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)比較了溫度、溶劑pH、料液比和提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1 （a）可知：由于綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫加熱易氧化分解，所以隨著提取溫度的升高，綠原酸提取得率先升后降；由圖1（b）可知：隨著溶劑pH值的上升，綠原酸的提取得率先升高后降低，這是由于綠原酸本身是一種有機(jī)酸，酸性條件有利于綠原酸的提取，而酸性太強(qiáng)會(huì)造成綠原酸的酸解；由圖1（c）可知：隨著料液比的比值降低，綠原酸提取得率逐漸達(dá)到最大值；由圖1（d）可知：由于綠原酸結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使一部分綠原酸分解。綜合考慮溫度、溶劑pH、料液比和提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取得率的影響，確定進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)因素提取條件范圍為：提取溫度75～85℃，溶劑pH值2～4，料液比1∶4～1∶8，提取時(shí)間2～4 h。

2.1.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert軟件，對(duì)綠咖啡豆中綠原酸提取得率顯著性影響進(jìn)行響應(yīng)面分析，Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表2，得到綠咖啡豆中綠原酸提取得率（Y）的多元二次回歸模型：Y= 91.76-1.55A-2.48B+0.16C+0.97D-5.67AB+2.39AC-2.41AD-0.27BC+5.10BD+1.94CD-6.06A2-6.33B2-1.37C2-4.83D2（R2=0.9212）

式中：A為提取溫度；B為溶劑pH值；C為料液比；D為提取時(shí)間；Y為綠原酸提取得率。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差及顯著性分析（表3）的結(jié)果表明：A、B、AB、BD、A2、B2、D2因素影響顯著（p＜ 0.05），即提取溫度與pH、pH與提取時(shí)間交互作用是影響綠咖啡豆中綠原酸提取的顯著因素。

表3　回歸模型方程的方差分析

利用Box-Behnken試驗(yàn)得到的回歸模型對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面及等高線圖可以用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素對(duì)綠咖啡豆中綠原酸提取得率影響的兩兩交互作用以及確定各個(gè)因素的最佳水平范圍。

圖2表明：固定提取溫度，綠原酸提取得率隨著溶劑pH值的變化先增加后降低，pH過(guò)高降低了綠原酸在溶劑中的溶解度，導(dǎo)致提取綠原酸得率降低；固定提取溶劑pH，綠原酸提取得率隨著提取溫度的變化先增加后減小。圖3表明：提取時(shí)間延長(zhǎng)有利于提高綠原酸提取得率，但由于綠原酸結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，長(zhǎng)時(shí)間高溫提取會(huì)使部分綠原酸結(jié)構(gòu)裂解進(jìn)而降低綠原酸的提取率。圖2和圖3的等高線圖均呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明提取溫度與pH、pH與提取時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，影響顯著。

根據(jù)所建立的模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出綠咖啡豆中綠原酸提取得率最高的參數(shù)條件為提取溫度79.8℃，溶劑pH值2.8，料液比1∶6，提取時(shí)間3.0 h，在此條件下綠原酸提取得率預(yù)測(cè)值為92.0%。為方便試驗(yàn)將參數(shù)修改為：提取溫度80℃、pH 3、料液比1∶6、提取時(shí)間3 h，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測(cè)綠原酸提取得率為91.9%，基本與預(yù)測(cè)值保持一致。

2.2綠咖啡豆提取液中綠原酸的分離純化

2.2.1不同樹脂對(duì)綠原酸的靜態(tài)吸附和解析性能比較

12種不同規(guī)格的大孔樹脂，在同等條件下，經(jīng)過(guò)24 h吸附和24 h乙醇解析，過(guò)濾后測(cè)定濾液中綠原酸的含量，每種樹脂3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各樹脂的吸附量和吸附率平均值，以及對(duì)應(yīng)樹脂解析量和解析率的平均值，結(jié)果見表4。

表4　12種大孔樹脂對(duì)綠原酸的靜態(tài)吸附和解析性能的比較分析

由表4可知：上述各種大孔樹脂對(duì)綠原酸都有一定的吸附量，其中XDA-8、AB-8等樹脂的吸附率較大，XDA-8的吸附率達(dá)85.3%，用70%乙醇對(duì)大孔吸附樹脂進(jìn)行解析，XDA-8、LSA-21、D101三種樹脂的解析率均達(dá)到95%以上，其中XDA-8的解析率達(dá)95.2%，評(píng)估12種大孔樹脂吸附和解析性能，XDA-8綜合性能最佳。因此對(duì)于綠咖啡豆提取液中的綠原酸純化工藝而言，大孔樹脂XDA-8較為適宜。

2.2.2大孔樹脂XDA-8對(duì)綠原酸的動(dòng)態(tài)吸附和解析工藝研究

用預(yù)處理過(guò)的10 g XDA-8樹脂，濕法裝入16 mm×300mm的玻璃層析柱作為吸附柱，使用前用超純水沖洗至無(wú)醇味，動(dòng)態(tài)上樣吸附，乙醇解析純化綠咖啡豆提取液中的綠原酸，對(duì)不同的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，選取上柱液濃度（7、8、9、10、11、12 mg/mL）、上柱流速（1、2、3、4 BV/h）、解析用乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、解析用乙醇用量（2、3、4、5、6 BV）、解析乙醇流速（1、2、3、4、5 BV/h）等進(jìn)行考察，結(jié)果如圖4和圖5所示。優(yōu)化后得到最佳動(dòng)態(tài)吸附和解析工藝條件為：上柱液濃度為10 mg/mL，上樣流速2 BV/h，解析用乙醇濃度為70%，解析用乙醇用量5 BV，解析乙醇流速3 BV/h。

在上述動(dòng)態(tài)吸附和解析純化綠原酸的最佳工藝條件下，進(jìn)行了三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：XDA-8大孔樹脂的吸附量平均達(dá)35.5mg/mL，解析率平均可達(dá)95.3%，產(chǎn)品含量平均可達(dá)70.9%，回收率平均可達(dá)85.4%，該工藝重復(fù)穩(wěn)定性好，產(chǎn)品純度和回收率都較高。

2.3高純度綠原酸制備

綠咖啡豆提取液通過(guò)XDA-8樹脂分離純化后，純度為70.9%，為了得到高純度綠原酸，將樹脂分離純化后的綠原酸溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用于高效液相制備色譜進(jìn)樣，結(jié)果如圖6。用高效液相色譜檢測(cè)液相分段收集液，120 min處收集的綠原酸溶液純度達(dá)到95.2%。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)綠咖啡豆中綠原酸提取條件的單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，建立綠原酸提取得率回歸方程，結(jié)果表明提取溫度、溶劑pH值、料液化、提取時(shí)間這4個(gè)因素都對(duì)綠原酸提取得率影響顯著，R2=0.921 2，模型擬合度好。確定出的最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度79.8℃，pH 2.8，料液比1∶6，提取時(shí)間3.0 h。修改試驗(yàn)參數(shù)條件下，實(shí)測(cè)綠原酸提取得率為91.9%，證明優(yōu)化得實(shí)驗(yàn)條件可行。

XDA-8大孔樹脂對(duì)綠咖啡豆提取液中的綠原酸具有良好的吸附性，能較好地分離純化綠原酸，最大吸附量平均可達(dá)35.5 mg/mL。最佳動(dòng)態(tài)吸附和解析工藝條件為上柱液濃度為10mg/mL，上樣流速2 BV/h，解析用乙醇濃度為70%，解析用乙醇用量5 BV，解析乙醇流速3 BV/h，經(jīng)HPLC檢測(cè)，綠原酸含量可達(dá)70.9%，回收率可達(dá)85.4%。XDA-8樹脂吸附解析后，通過(guò)液相制備色譜即可得純度為95.2%的綠原酸，冷凍干燥得高純度綠原酸晶體，確為綠原酸純品。

綜上所述，本文建立一條操作簡(jiǎn)單、得率較高、綠色環(huán)保的綠原酸提取分離純化工藝流程。

［1］龍文靜.咖啡豆中咖啡因與綠原酸的研究進(jìn)展［J］.廣西輕工業(yè)，2010（1）：1-2.

［2］杜延兵，裘愛泳.綠原酸生物活性、資源及其提取純化［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22（2）：250-252.

［3］LALLEMAND L A，MCCARTHY JG，MCSWEENEY S，et al. Purification，crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase（HCT）from Coffea canephora involved in chlorogenic acid biosynthesis［J］.Genetics，2008，178 （4）：2315-2326.

［4］KANG Juan，LIU Yuan，XIE Mengxia，et al.Interactions of human serum albumin with chlorogenic acid and ferulic acid［J］. Biochimica et biophysica acta（BBA）-general subjects，2004，1674（2）：205-214.

［5］SATO Y，ITAGAKI S，KUROKAWA T，et al.In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid ［J］.International journal of pharmaceutics，2011，403（s 1/2）：136-138.

［6］WOOSANG S，DONGGUN L，BAIFW，et al.Antifungal action of chlorogenic acid against pathogenic fungi，mediated by membrane disruption［J］.Pure and applied chemistry，2010，82 （1）：219-226.

［7］ONG KW，HSU A，TAN B K H.Anti-diabetic and anti-lipidemic effects of chlorogenic acid are mediated by ampk activation［J］. Biochemicalpharmacology，2013，85（9）：1341-1351.

［8］AIDILLA M，HODGSON J M，CONSIDINE M J，et al. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2013，63 （6）：4371-4378.

［9］JOKURA H，WATANABE I，UMEDA M，et al.Coffee polyphenol consumption improves postprandial hyperglycemia associated with impaired vascular endothelial function in healthy male adults［J］.Nutrition research，2015，35（10）：873-881.

［10］薛滿，游本剛.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較金銀花藥材中綠原酸與木犀草苷的水提工藝［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：591-593.

［11］單磊，達(dá)超超，呼延曉穎，等.金銀花中綠原酸提取工藝研究［J］.飲料工業(yè)，2010，13（4）：23-25.

［12］劉佳佳，趙國(guó)玲，章曉驊，等.金銀花綠原酸酶法提取新工藝研究［J］.中成藥，2002，24（6）：416-418.

［13］楊秀芳，汪洋，馬養(yǎng)民.杜仲葉中綠原酸的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（4）：32-34.

［14］趙亞洲，達(dá)超超，劉軍海.回歸正交法優(yōu)化杜仲葉中綠原酸提取工藝研究［J］.化工科技市場(chǎng)，2010，33（11）：34-37.

［15］戴瑜，李姣娟，周盡花，等.半纖維素酶法提取杜仲葉綠原酸［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2009，23（3）：96-99.

［16］盧定強(qiáng)，洪聲，王俊，等.多級(jí)柱系統(tǒng)吸附分離金銀花水提液中綠原酸的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009（1）：164-168.

［17］ZHANG Bin，YANG Ruiyuan，ZHAO Yan，et al.Separation of chlorogenic acid from honeysuckle crude extracts by macroporous resins［J］.Journal of chromatography B，2008，867 （2）：253-258.

［18］XIANG Zhinan，ZHAN Yu，NING Zhengxiang.Purification of chlorogenic acid in Flos Loniceraewith system of polar ordered resins［J］.Journalof central south university of technology，2007，14（3）：357-362.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Studies on separation and purification of chlorogenic acid from green coffee beans

ZHANG Youming，ZHANG Yinjun，SHEN Xueliang
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

The separation and purification processes of chlorogenic acid from green coffee beans were studied.On the basis of single-factor experiments，hot water extraction of chlorogenic acid was optimized by response surfacemethodology.The results showed that the chlorogenic acid yield was significantly affected by the four factors，and the optimum extraction conditions were temperature 79.8℃，solvent pH 2.8，solid/liquid ratio 1∶6 and extraction time 3.0 h.Themaximum extraction yield of chlorogenic acid was 92.0%.The experiments on screening of different resins showed that XDA-8 resin had best efficiency in chlorogenic acid separation and purification. Under the optimized conditions，chlorogenic acid content and recovery reached 70.9%and 85.4%，respectively.Preparative high performance liquid chromatography was used to obtain high purity （95.2%）of chlorogenic acid from green coffee bean extract.The established preparation process of chlorogenic acid had the advantages of simple，efficientand environmentally friendly

chlorogenic acid；green coffee beans；extraction；purification；resin

Q946.81

A

1674-2214（2016）03-0140-07

2016-04-21

張由明（1988—），男，河南開封人，碩士，主要從事天然原料提取純化及應(yīng)用方面的研究，E-mail：zyming168 @126.com.通信作者：沈雪亮副教授，E-mail：shenxl_pat@aliyun.com.