劉財(cái)豐，吳　殷，劉偉偉，葛曉春

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200438)

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擬南芥多聚ADP核糖聚合酶活性調(diào)控植物的抗旱性

劉財(cái)豐1,2，吳殷1,2，劉偉偉1,2，葛曉春1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200438)

為了觀察植物多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]的酶活對(duì)植物生長(zhǎng)的作用，利用PARP抑制劑來(lái)抑制擬南芥PARP的體內(nèi)活性，并觀察表型.體外生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3-氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide, 3-AB)可以抑制擬南芥PARP1和PARP2的多聚ADP核糖化修飾活性；利用3-AB來(lái)處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)抑制劑處理過(guò)的植物表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱能力.為了排除3-AB的非特異性作用，使用PARP的另外一個(gè)抑制劑苯甲酰胺(Benzamide, BA)對(duì)擬南芥進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，BA處理后擬南芥也表現(xiàn)出相似的抗旱表型.另外，在正常生長(zhǎng)條件下，3-AB或BA處理過(guò)的擬南芥生長(zhǎng)量較大，植株鮮重明顯增加.以上結(jié)果說(shuō)明，抑制擬南芥PARP活性可以促進(jìn)擬南芥抗旱能力的改善，其抑制劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

擬南芥； 多聚ADP核糖聚合酶； 3-AB； BA； 抗旱性

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是蛋白質(zhì)功能的重要調(diào)控手段，常見(jiàn)的方式有糖基化修飾、泛素化修飾、磷酸化修飾、乙?；揎?、甲基化修飾等[1].多聚ADP核糖化[poly(ADP-ribosyl) ation] 修飾是一種稀有的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[2].該修飾由多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]催化，它以NAD+為底物，將其裂解為ADP核糖(ADP-ribose， ADPR)和尼克酰胺兩部分，并將其中的ADP核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移至靶蛋白.通過(guò)反復(fù)催化，PARP在蛋白質(zhì)上加上幾十個(gè)到幾百個(gè)不等的ADP核糖單元，形成線性或分支的多聚ADP核糖鏈，從而改變了受體蛋白的生理或生化活性[3].PARP對(duì)斷裂DNA有天然的親和性，它可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的DNA斷裂，從而結(jié)合到斷裂位點(diǎn)，發(fā)生自我修飾，并通過(guò)其自身連上的多聚ADP核糖鏈募集其他與DNA修復(fù)有關(guān)的蛋白，參與到DNA修復(fù)過(guò)程[4].

從動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，多聚ADP核糖化修飾是一種可逆的修飾，細(xì)胞內(nèi)多聚ADP核糖[poly(ADP-ribose), PAR]的水平受到PARP和多聚ADP核糖糖基水解酶[poly(ADP-ribose) glycohydrolase, PARG]的嚴(yán)格調(diào)控[5].PARG是一種與PARP活性相拮抗的酶，可以降解多聚ADP核糖成為單ADP核糖(ADPR)[6]，從而去除蛋白質(zhì)上的多聚ADP核糖基團(tuán).PARP與PARG活性的平衡維持著細(xì)胞內(nèi)多聚ADP核糖化的正常水平，保持了動(dòng)物體內(nèi)正常的生理功能[7].迄今為止，在人類中通過(guò)序列同源性共發(fā)現(xiàn)了17個(gè)PARP家族成員[8]，它們均具有PARP催化結(jié)構(gòu)域，存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中.在動(dòng)物中，多聚ADP核糖化修飾在多個(gè)細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用，包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、有絲分裂、DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞程序性死亡、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重組、脅迫響應(yīng)等[9-11]；在人類個(gè)體水平上，多聚ADP核糖化修飾與心臟病、白血病、阿爾茲海默病以及癌癥組織對(duì)化療的敏感性有關(guān)[12].因此，動(dòng)物中PARP的功能和作用機(jī)制得到了不少研究者的關(guān)注和深入研究.

高等植物具有兩個(gè)以上PARP基因[13-14]，和動(dòng)物中PARP基因功能的廣泛研究相比，目前對(duì)植物PARP基因功能的研究非常少.擬南芥基因組具有3個(gè)PARP基因，它們分別是PARP1(At4g02390)，PARP2(At2g31320)和PARP3(At5g22470)[15-16].擬南芥PARP1和PARP2分別是哺乳動(dòng)物PARP1及PARP2是直系同源物，暗示其功能在動(dòng)植物間可能具有保守性.PARP3則為植物中所特有，在發(fā)育的種子中高表達(dá)，表明其功能可能與種子發(fā)育相關(guān)[16].PARP1和PARP2在植物中主要與非生物[17-19]以及生物[20]脅迫信號(hào)途徑相關(guān).PARPs影響植物體內(nèi)ABA的水平，參與ABA信號(hào)途徑的調(diào)控[21]，下調(diào)PARPs的表達(dá)水平能夠增強(qiáng)植物對(duì)高溫等非生物脅迫的耐受能力.PARPs參與抗逆的具體機(jī)制到目前為止仍不十分清楚，還需要進(jìn)一步的研究.

動(dòng)物中常用的PARP抑制劑3-AB，BA，尼克酰胺(Nicotinamide, Nic)和3-甲氧基苯甲酰胺(3-Methoxybenzamide, 3-MB)都屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[22]，可以結(jié)合在PARP酶的活性中心.它們都有一個(gè)苯甲酰胺基團(tuán)，作為NAD+的結(jié)構(gòu)類似物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PARP的活性位點(diǎn)，從而阻止NAD+與PARP的結(jié)合.目前盡管PARP抑制劑已被用于植物的研究，但它們是否可以對(duì)擬南芥中PARP生化活性產(chǎn)生抑制作用還沒(méi)有直接證據(jù).本研究首先利用生化方法觀察了PARP抑制劑3-AB對(duì)擬南芥中PARP1和PARP2活性的作用，然后采用PARP抑制劑處理擬南芥，觀察其表型，為深入了解PARP在植物中的功能以及發(fā)掘PARP抑制劑可能的應(yīng)用價(jià)值提供基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

擬南芥ArabidopsisthalianaColumbia-0生態(tài)型(Col-0). 3-氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide, 3-AB)購(gòu)自Alfa Aesar試劑公司，苯甲酰胺(Benzamide)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.大腸桿菌E.coliDH5α，BL21(DE3)，Rosetta(DE3)，Origami(DE3)，表達(dá)載體pET-32(a)均為本實(shí)驗(yàn)室保存.DNA聚合酶，各種限制性內(nèi)切酶，以及T4 DNA連接酶等均購(gòu)自TaKaRa公司，PCR引物合成和DNA測(cè)序由上海博尚生物科技有限公司完成.

1.2方法

1.2.1植物培養(yǎng)

土壤中培養(yǎng)擬南芥： 基質(zhì)(V蛭石∶V黑土∶V珍珠巖=9∶3∶1)浸透營(yíng)養(yǎng)液后，將種子播于其上，用保鮮膜覆蓋，置于4℃下春化2d后轉(zhuǎn)入短日照(9h光照/15h黑暗)溫室，(22±2)℃條件下進(jìn)行培養(yǎng).

培養(yǎng)基上培養(yǎng)擬南芥： 種子用1mL 70% 乙醇滅菌10min，然后換1mL 100% 乙醇+0.01% Triton X-100，振蕩幾次后置于滅菌的干凈濾紙上，待乙醇揮發(fā)后，點(diǎn)播在1/2 MS平板上.將平板置于4℃冰箱中春化處理2d，然后轉(zhuǎn)移到(9h光照/16h黑暗)光照培養(yǎng)箱或短日照(9h光照/15h黑暗)溫室，(22±2)℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.2擬南芥抗旱實(shí)驗(yàn)以及葉片相對(duì)含水量測(cè)定

移栽擬南芥時(shí)每個(gè)小盆中先稱取相同質(zhì)量的土，移栽時(shí)盡量選取大小以及生長(zhǎng)狀態(tài)一致的野生型小苗.在短日照培養(yǎng)7d后開(kāi)始用2mmol/L 3-AB和BA處理，每隔5d處理1次，共處理4次，對(duì)照組用等量水處理.移栽30d后將擬南芥用水澆透，稱重，盡量保證每個(gè)小盆中含水量一致，然后停止?jié)菜蛊渥匀桓珊?，直至萎蔫，在萎蔫出現(xiàn)后適當(dāng)時(shí)間復(fù)水，拍照.干旱前、干旱進(jìn)行時(shí)及復(fù)水后各收集1次植物的葉片，剪取后馬上稱重得到植物葉片鮮重(Fresh Weight, FW)；然后將植物葉片浸入水中4h后取出，用草紙吸干葉子表面的水分，稱重，得到植物葉片的濕重(Turgid Weight, TW)；將稱過(guò)的葉片放入80℃烘箱中完全烘干，直至葉片重量不再變化時(shí)為止，稱取干重(Dry Weight, DW).葉片的相對(duì)含水量(Relative Water Content, RWC)根據(jù)公式RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%計(jì)算.

1.2.3PARP表達(dá)與純化

pET-32(a)-PARP1和pET-32(a)-PARP2的表達(dá)載體構(gòu)建： 根據(jù)PARP1和PARP2的全長(zhǎng)cDNA序列，分別設(shè)計(jì)上下游引物PARP1-SacI-FP(5′-GGAGCTCATGGCAAGCCCACATA-3′)和PARP1-NotI-RP(5′-GGCGGCCGCTCATCTCTTGTGCTTA-3′)，PARP2-BamHI-FP(5′-GGGATCCATGGCG AACAAGCTCAAAGTC-3′和PARP2-XhoI-RP(5′-GGAGCTCGTGCTTGTAGTTGAATTTGACTTG-G-3′), 用高保真的DNA聚合酶Prime STAR DNA聚合酶(TaKaRa公司)進(jìn)行擴(kuò)增，回收大小正確的條帶，用T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)連接到pCR-Blunt Ⅱ(Invitrogen公司)中間載體上，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α, 挑選單菌落，搖菌并抽提質(zhì)粒，測(cè)序.得到序列正確的克隆后，抽提質(zhì)粒DNA，分別進(jìn)行雙酶切，與帶有同樣粘性末端的pET-32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落搖菌并抽提質(zhì)粒，酶切鑒定確認(rèn)克隆pET-32(a)-PARP1和pET-32(a)-PARP2構(gòu)建完成.

pET-32(a)-PARP1和pET-32(a)-PARP2表達(dá)條件的確定： 為了探索融合蛋白合適的表達(dá)條件，嘗試了3種宿主菌：E.coliBL21(DE3)、E.coliRossetta(DE3)和E.coliOrigami(DE3)，并選擇3個(gè)表達(dá)條件，37℃誘導(dǎo)4h、25℃誘導(dǎo)10h和16℃誘導(dǎo)20h分別進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG.將誘導(dǎo)表達(dá)后所得菌體超聲波破碎后離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳.結(jié)果顯示，PARP1在E.coliOrigami(DE3)，PARP2在E.coliRossetta(DE3)中16℃誘導(dǎo)20h能獲得較多的可溶蛋白.

PARP1和PARP2的大量表達(dá)、純化以及透析： 進(jìn)一步將含有pET-32(a)-PARP1的E.coliOrigami(DE3)和含有pET-32(a)-PARP2的E.coliRossetta(DE3)擴(kuò)大培養(yǎng)至500mL, 搖菌至OD600為0.6～0.8 時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，然后在16℃繼續(xù)培養(yǎng)20h.離心收集菌體，重懸后超聲波破碎，離心得到上清，過(guò)Ni2+-chelating Sepharose fast flow柱純化，得到的蛋白在10mmol/L NaCl透析液中透析16～18h，期間換液3次以除去咪唑.同時(shí)，將轉(zhuǎn)入空載體pET-32(a)的E.coliRossetta(DE3)在同樣條件下表達(dá)，純化，獲得TRX標(biāo)簽蛋白用于測(cè)酶活的對(duì)照.

1.2.4體外抑制實(shí)驗(yàn)

向PAR反應(yīng)緩沖液(50mmol/L Tris·HCl，4mmol/L MgCl2，250μmol/L DTT，2mmol/L EDTA，pH 8.0)中加入NAD+至0.1mmol/L，退火的雙鏈DNA(5′-GGAATTCCGGAATTCC-3′)至500nmol/L，不加入(對(duì)照)或者加入1mmol/L 3-AB，最后加入0.2μg透析后的蛋白，總體積為200μL.上述樣品于25℃分別反應(yīng)0，1，5，15，30min后加入400μL～20℃預(yù)冷的丙酮終止反應(yīng)，-20℃放置1h以沉淀蛋白.12000r/min離心10min，倒去上清，室溫?fù)]發(fā)盡丙酮后加入10μL 1×上樣緩沖液溶解蛋白，取5μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析.TRX對(duì)照蛋白電泳時(shí)使用的膠濃度為15%，TRX-PARP1和TRX-PARP2使用的膠濃度為7.5%.

2　結(jié)果與分析

2.13-AB可以抑制擬南芥PARP的催化活性

擬南芥PARP1和PARP2具有和哺乳動(dòng)物PARPs中類似的催化結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合域.研究人類PARP1的生化功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，PARP的DNA結(jié)合域結(jié)合斷裂的DNA后，發(fā)生構(gòu)象變化，從而激活其催化結(jié)構(gòu)域裂解NAD+，并將生成的ADP核糖轉(zhuǎn)移到自我修飾結(jié)構(gòu)域上，對(duì)自身進(jìn)行多聚ADP核糖化修飾，從而導(dǎo)致自身分子量的增加[23-24].

在TRX-PARP1和TRX-PARP2活性檢測(cè)液中加入NAD+底物，反應(yīng)不同時(shí)間后加入丙酮終止反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分析TRX-PARP1和TRX-PARP2的泳動(dòng)情況.同時(shí)，為了檢測(cè)3-AB是否能抑制擬南芥PARP的活性，我們?cè)谄叫袑?shí)驗(yàn)中分別加入終濃度為1mmol/L的3-AB, 結(jié)果表明，TRX-PARP1和TRX-PARP2蛋白質(zhì)在加入NAD+后，主帶逐漸變淡，呈現(xiàn)出向上的彌散，時(shí)間越長(zhǎng)，主帶越弱，而向上擴(kuò)散越嚴(yán)重，出現(xiàn)凝膠阻滯現(xiàn)象，表明大腸桿菌中表達(dá)的PARP1和PARP2均具有自我修飾活性(圖1(a)，(b)).同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PARP1的活性要強(qiáng)于PARP2.加入抑制劑3-AB后，PARP1向上彌散的趨勢(shì)被大大抑制，而在PARP2中，這種向上彌散的趨勢(shì)幾乎被完全抑制.以同樣的條件進(jìn)行反應(yīng)，作為標(biāo)簽蛋白的TRX蛋白的分子量和條帶都沒(méi)有明顯變化(圖1(c)).這些結(jié)果表明，大腸桿菌中表達(dá)的PARP1和PARP2具有自我催化多聚ADP核糖修飾反應(yīng)的活性，3-AB可以抑制它們的催化活性.

2.2PARP抑制劑3-AB促進(jìn)擬南芥抗旱

PARP抑制劑3-AB在動(dòng)物中使用的IC50為1mmol/L[22].我們采用接近動(dòng)物IC50的濃度范圍來(lái)處理擬南芥，利用3-AB溶液澆灌擬南芥根部的方法來(lái)抑制PARP的活性.

擬南芥在短日照培養(yǎng)7d后，用1mmol/L和2mmol/L 3-AB按材料與方法中所述步驟進(jìn)行少量多次澆灌擬南芥根部，30d后停止?jié)补噙M(jìn)行干旱.結(jié)果顯示，干旱20d時(shí)對(duì)照組已基本枯死，而3-AB處理過(guò)的植物仍然存活，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)恢復(fù)澆水，兩天后拍照(圖2)，可以看到，3-AB處理后擬南芥在干旱脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于對(duì)照，復(fù)水后基本能恢復(fù)生長(zhǎng)，且2mmol/L 3-AB處理較1mmol/L處理效果更為顯著.

2.3其他抑制劑也可促進(jìn)擬南芥的抗旱性

為了排除3-AB的非特異性作用，本研究還使用了PARP的另外一個(gè)抑制劑BA來(lái)處理擬南芥.BA對(duì)PARP的作用機(jī)制和3-AB相似[22].盡管3-AB在臨床和科研上應(yīng)用廣泛，但BA成本低廉，使用量較大的話更具備價(jià)格優(yōu)勢(shì).BA對(duì)PARP的抑制力比3-AB稍弱，因此我們使用了2mmol/L的BA來(lái)進(jìn)行處理.擬南芥在短日照培養(yǎng)7d后用 2mmol/L的BA水溶液澆灌其根部，同時(shí)，用等量2mmol/L 3-AB澆灌作為陽(yáng)性對(duì)照，等量的水澆灌作為陰性對(duì)照，每隔5d處理1次，共處理4次.

停止?jié)菜暗膶?duì)照組、3-AB及BA處理組的植物的生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致(圖3)，但干旱20d后，對(duì)照組幾乎干死，而3-AB及BA處理組則仍保持暗綠色，2mmol/L 3-AB處理擬南芥的植物狀態(tài)稍好于2mmol/L BA處理的擬南芥.恢復(fù)澆水3d后觀察表型，對(duì)照組不能恢復(fù)生長(zhǎng)，而3-AB和BA處理組則可恢復(fù)生長(zhǎng)(圖3)，兩者狀態(tài)相差不多.以上結(jié)果表明，利用PARP抑制劑BA處理植物，也能達(dá)到與3-AB相類似的增強(qiáng)擬南芥抗旱性的效果，干旱20d后復(fù)水，植物均能恢復(fù)生長(zhǎng).

2.4葉片相對(duì)含水量測(cè)定

葉片相對(duì)含水量是植物抗旱性能的一種重要指標(biāo)[25]，我們從對(duì)照和處理植物上剪取停止?jié)菜?、恢?fù)澆水前和恢復(fù)澆水后3d的葉片，測(cè)量3-AB、BA處理組與對(duì)照組的葉片的相對(duì)含水量.結(jié)果表明，在停止?jié)菜?，PARP抑制劑處理的植物和對(duì)照組的葉片相對(duì)含水量幾乎一致，但在干旱20d后，對(duì)照組的葉片相對(duì)含水量?jī)H有20%多，表明大部分葉片已處于嚴(yán)重缺水的狀態(tài)，而處理組中葉片相對(duì)含水量則保持在80%以上，此外3-AB處理的效果比同濃度的BA效果稍好(圖4).恢復(fù)澆水后3d，對(duì)照組的葉片相對(duì)含水量不能有效地恢復(fù)，和復(fù)水前比沒(méi)有顯著差異，表明大部分植株已經(jīng)死亡；而處理組的葉片相對(duì)含水量則和復(fù)水前比有顯著的上升(P<0.01)，并且基本恢復(fù)到了干旱前的水平，和干旱前比沒(méi)有顯著差異.這些結(jié)果再次表明了3-AB或BA處理能夠降低擬南芥在干旱處理時(shí)的脫水現(xiàn)象，大大增強(qiáng)擬南芥的干旱恢復(fù)能力.

2.5PARP抑制劑處理促進(jìn)擬南芥鮮重增加

以上的結(jié)果表明PARP抑制劑處理可以顯著提高擬南芥的抗旱能力，我們還進(jìn)一步研究了PARP抑制劑處理是否會(huì)影響擬南芥在正常條件下的生長(zhǎng)狀況.擬南芥(Col-0)種子用乙醇消毒后均勻點(diǎn)播于含1/2 MS培養(yǎng)基的平皿中，在1/2 MS培養(yǎng)基上加入終濃度為1mmol/L 的3-AB或者2mmol/L BA，對(duì)照培養(yǎng)基中加入等量的滅菌水.生長(zhǎng)20d后觀察擬南芥小苗的表型，發(fā)現(xiàn)3-AB或BA處理后，擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)更好(圖5(a)).我們進(jìn)一步將整株小苗輕輕拔出后將培養(yǎng)基清洗干凈，然后分別稱量擬南芥的鮮重，測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-AB或BA處理后，擬南芥鮮重顯著增加(圖5(b)).這些結(jié)果表明，利用PARP抑制劑處理過(guò)的植物在抗旱力增強(qiáng)的同時(shí)，正常生長(zhǎng)并沒(méi)有受到妨礙，相反，長(zhǎng)勢(shì)更強(qiáng).

3　討　論

PARP廣泛存在于真核生物中，在動(dòng)物中PARP1與PARP2受斷鏈DNA的激活，參與DNA修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性，功能上具有一定冗余性[4].在不同的DNA損傷程度下，PARPs的激活表現(xiàn)出不同的作用： 當(dāng)DNA只有輕微損傷時(shí)，適量PARP被激活，自身發(fā)生多聚ADP核糖化，蛋白質(zhì)上合成的多聚ADP核糖鏈可招募DNA修復(fù)因子對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)，有利于細(xì)胞保持正常的生命活動(dòng)；如果脅迫過(guò)于嚴(yán)重導(dǎo)致DNA大量斷裂時(shí)，PARPs被過(guò)度激活，引起細(xì)胞內(nèi)大量的NAD+被消耗，NAD+的合成需要ATP，為了重新合成NAD+，細(xì)胞內(nèi)ATP水平會(huì)發(fā)生嚴(yán)重下降，從而激活細(xì)胞內(nèi)的壞死(necrosis)相關(guān)途徑，使得細(xì)胞放棄修復(fù)而走向死亡途徑[12].另外，PARPs的底物NAD+也是許多生物反應(yīng)的輔酶，參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，幫助維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)[26].因此，為了避免NAD+被過(guò)度消耗，體內(nèi)PARPs的活性需要維持在適當(dāng)水平.

動(dòng)物中PARPs的活性與多種疾病相關(guān)，使得它們成為疾病治療的靶基因，其抑制劑的應(yīng)用越來(lái)越受到重視.目前最常用的PARP抑制劑是PARP底物NAD+的類似物，例如尼克酰胺、苯甲酰胺、3-AB等[22,27]，許多體內(nèi)研究的開(kāi)展也依賴于抑制劑的使用.小鼠PARP1與PARP2單突變后對(duì)射線或者烷化劑過(guò)度敏感，但PARP1與PARP2雙突變之后則表現(xiàn)出胚胎致死表型[4]，因此用雙突變體來(lái)研究PARPs在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用幾乎不可能，而使用抑制劑來(lái)抑制體內(nèi)PARPs活性，則可以避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在胚胎期就死亡的問(wèn)題，從而為研究PARPs在某一環(huán)節(jié)中的生理功能提供可能性[10,28].

擬南芥PARP1和PARP2與動(dòng)物中的PARP具有同源性，但對(duì)其功能的研究較少.Block等[17]首先用PARP抑制劑3-MB等處理油菜的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑能保護(hù)其不受氧化脅迫損傷；利用RNA干擾技術(shù)分別將擬南芥中的PARP1及PARP2基因的表達(dá)水平下調(diào)，擬南芥可表現(xiàn)出對(duì)干旱以及高光照等多種非生物脅迫的耐受性[21].我們?cè)谘芯繑M南芥PARP功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制劑3-AB或BA處理就可以使擬南芥抗旱性增強(qiáng)，葉片相對(duì)含水量更高.體外生化實(shí)驗(yàn)表明3-AB確實(shí)抑制了擬南芥PARP1和PARP2的生化活性，因此可以推斷，3-AB通過(guò)抑制PARPs活性降低了NAD+的消耗，從而維持了細(xì)胞的能量平衡，減少脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞死亡.使用抑制劑來(lái)研究基因功能比使用RNA敲除等轉(zhuǎn)基因技術(shù)更為簡(jiǎn)單方便，蛋白質(zhì)活性可控且可以同時(shí)抑制多個(gè)同源蛋白質(zhì)的活性.如果能在農(nóng)作物上應(yīng)用則可以大大縮短研究周期，生產(chǎn)上更容易推廣.此外，我們還觀察到3-AB或BA處理在正常條件下不僅不會(huì)抑制擬南芥的生長(zhǎng)，反而能增加擬南芥的生物量，對(duì)植物的正常生長(zhǎng)無(wú)負(fù)面作用.

在正常條件下，PARP活性被抑制可以促進(jìn)擬南芥的生物量增加的具體機(jī)制并不清楚，Schulz等[19,29]通過(guò)監(jiān)測(cè)擬南芥的葉片生長(zhǎng)趨勢(shì)，以及對(duì)PARP抑制后擬南芥的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)抑制PARP活性增加了擬南芥葉片的細(xì)胞數(shù)目，推測(cè)可能是PARP被抑制后，促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)行，并影響植物的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝過(guò)程，從而促進(jìn)了植物的生長(zhǎng).另外，盡管環(huán)境脅迫對(duì)植物基因組的完整性及穩(wěn)定性有一定影響，但在DNA損傷不嚴(yán)重時(shí)，激活PARP會(huì)消耗大量的ATP，對(duì)植物的生長(zhǎng)是不利的.植物細(xì)胞由于其細(xì)胞壁的限制，不能自由移動(dòng)，不會(huì)像動(dòng)物細(xì)胞那樣發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，因此DNA損傷對(duì)植物整體造成的影響不如動(dòng)物嚴(yán)重，植物對(duì)DNA損傷的耐受程度也比動(dòng)物細(xì)胞要高很多.PARPs在擬南芥中并非正常生長(zhǎng)所必須，其功能的缺失未對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成影響(雙突變正常條件下無(wú)表型)，這與動(dòng)物中PARP缺失造成胚胎期致死完全不同.我們推測(cè)，在正常生長(zhǎng)條件下或者僅有輕微DNA損傷的情況下，抑制擬南芥PARP的活性有利于能量的保存，使得植物能夠更好地生長(zhǎng).這可能是我們觀察到在正常生長(zhǎng)條件下，抑制PARP活性后擬南芥的生長(zhǎng)量發(fā)生增加的原因.

干旱是我國(guó)主要的自然災(zāi)害之一，它往往導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，是影響作物生長(zhǎng)、限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因素.為了減小干旱年份作物產(chǎn)量的損失、合理利用有效的水資源，提高作物的抗旱性一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的主要目標(biāo)之一.科學(xué)家從抗旱節(jié)水作物品種的選育、抗旱節(jié)水轉(zhuǎn)基因工程育種等入手來(lái)提高作物抗旱性[30]，這些都取得了很大進(jìn)步，但是前期投入大，研究周期較長(zhǎng).在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，也有一些“植物抗旱劑”得到應(yīng)用，主要基于保水材料的應(yīng)用，或者基于植物對(duì)礦質(zhì)元素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的需求而發(fā)展起來(lái)的[31]，這些都對(duì)改造作物的抗旱性做出了很大貢獻(xiàn)，但其中有一些是通過(guò)影響激素途徑來(lái)調(diào)節(jié)植物抗旱性的，則對(duì)植物的整體生長(zhǎng)影響較大.本研究使用的3-AB或BA，作用于PARP的催化活性位點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞中其他基因或者蛋白質(zhì)的影響較小，不僅可以增強(qiáng)擬南芥抗旱性，還能促進(jìn)植物的正常生長(zhǎng)，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有作為抗旱劑使用的潛在價(jià)值.此外，3-AB是一種小分子量水溶性化學(xué)物質(zhì)，容易配制、使用方便、用量小，但3-AB比BA的市售價(jià)更高，因此在使用抑制劑時(shí)也可用BA替代3-AB.BA易溶于水，價(jià)格低廉、使用方便、對(duì)植物副作用小，在土中僅需少量多次澆灌，就能起到明顯促進(jìn)抗旱的功能.在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中如能應(yīng)用，將帶來(lái)一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

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Application of Poly(ADP-ribose) Polymerases Inhibitors Improves the Drought Tolerance ofArabidopsisThaliana

LIU Caifeng1,2, WU Yin1,2, LIU Weiwei1,2, GE Xiaochun1,2

(1. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

In order to study the physiological role of poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)invivo, we used PARP inhibitors to suppress the activities of PARPs by adding the inhibitors into soil or the culture media.Invitrobiochemical experiments showed that PARP inhibitor 3-AB can inhibit the catalysis activities of PARP1 and PARP2. Application of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor 3-AB improved the drought tolerance ofArabidopsis. The 3-AB treated seedlings retained more water in leaves and recovered better than control plants after drought stress. Another inhibitor BA also showed the similar effects as 3-AB. Under normal conditions, application of 3-AB or BA also increased the fresh weight ofArabidopsis. These results suggested that inhibition of PARP activities can improveArabidopsisdrought tolerance.

Arabidopsisthaliana; poly(ADP-ribose) polymerase; 3-AB; BA; drought tolerance

0427-7104(2016)01-0074-08

2015-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070232, 31170169)

劉財(cái)豐(1985—)，女，碩士研究生；葛曉春，女，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail： xcge@fudan.edu.cn.

Q 946.1

A