黃冠廷，杜育芝，彭　昆，張文承，葉　鵬

(浙江理工大學(xué)化學(xué)系，浙江　杭州　310018)

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專論與綜述

脂肪酶手性拆分的研究進展*

黃冠廷，杜育芝，彭昆，張文承，葉鵬

(浙江理工大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州310018)

手性拆分廣泛應(yīng)用于手性藥物的制備，具有重要的科學(xué)意義與實用價值。脂肪酶由于其獨特的界面催化特性，可在有機相中進行酶促合成，已成為手性拆分研究中的熱點之一。本文重點綜述了脂肪酶對手性醇、手性酯和手性胺類等有機合成中間體催化拆分作用的最新研究進展，并從脂肪酶來源、底物分子結(jié)構(gòu)和固定化方法等角度對脂肪酶催化手性拆分機理進行了介紹。

脂肪酶；手性拆分；對映體選擇性；酶固定化

手性拆分有結(jié)晶法、化學(xué)法、酶法和色譜法等方法[1]。酶法拆分具有活性高、反應(yīng)條件溫和和立體選擇性高等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用。脂肪酶(Lipase，三酰基甘油水解酶，EC 3.1.1.3)在油水界面催化酯水解，也可在有機相中酶促合成，是一種重要的手性拆分酶。

脂肪酶手性拆分在手性藥物產(chǎn)業(yè)具有巨大的潛能。為提高脂肪酶的穩(wěn)定性，以及控制其在反應(yīng)過程中產(chǎn)品的純度, 常采用固定化的方法脂肪酶穩(wěn)定其分子結(jié)構(gòu)，并增加其重復(fù)使用性[2-3]。脂肪酶用于手性醇、手性胺及手性酯的拆分，具有重要的科學(xué)意義與實用價值，本文對其最新研究進展進行綜述，并對其機理進行了介紹。

1　手性醇(含羥基化合物)的拆分

(R)-3-氨基-2-[(苯氧基)甲基]-丙醇鹽酸鹽是一種重要的手性中間體。Shinya等[4]用熒光假單胞菌屬(Pseudomonas fluorescens，LAK Amano)在DMSO中催化2-羥甲基-1，3-丙二醇選擇性酯化，游離LAK Amano反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率達到74%，產(chǎn)物eep=85%，見圖1。

圖1　脂肪酶拆分手性2-羥甲基-1，3-丙二醇Fig.1　The resolution of chiral 2-hydroxymethyl-1,3-propanediol by lipase

光學(xué)純化合物1，2-二芳基-2-羥基乙酮在藥物合成中是非常有用的砌塊。Antonio等[5]報道了在2-甲基四氫呋喃中用施氏假單胞菌脂肪酶(Lipase from Pseudomonas stutzeri，PTL)結(jié)合釕催化劑，丁酸乙烯酯做?；w，動力學(xué)拆分1，2-二芳基-2-羥基乙酮，轉(zhuǎn)化率達到50%，對映體選擇率E>200，產(chǎn)物eep>99%，見圖2。

圖2　脂肪酶拆分手性1，2-二芳基-2-羥基乙酮Fig.2　The resolution of chiral 1,2-carbonyl-2-hydroxy-ethanone by lipase

1-苯乙醇可作為手性中間體被廣泛應(yīng)用于手性藥物的合成。Yoshikazu等[6]用離子液體涂覆洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶(Burkholderia cepacia lipase，IL1-PS)催化1-苯乙醇和乙酸乙烯酯選擇性酯化，用三丁基((2-甲氧基乙基)-甲基)鏻雙(三氟甲烷磺酰)亞胺([P444MEM][NTf2])做溶劑比i-Pr2O(二異丙醚)做溶劑，反應(yīng)速率提高了1.6倍。使得反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為42%，產(chǎn)物eep=99%，對映體選擇率E>200。

(R,S)-1-苯乙基醋酸，是一些生物活性物質(zhì)的手性合成子。Ru等[7]將被羰二咪唑活化的離子液體通過賴氨酸耦合共價連接到豬胰脂肪酶(Porcine pancreatic lipase，PPL)上，相對于天然脂肪酶PPL，展現(xiàn)了很高的水解活性，轉(zhuǎn)化率明顯得到了提高。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為49%，產(chǎn)物eep=94%，對映體選擇率E由39提高到101，見圖3。

圖3　脂肪酶拆分手性(R，S)-1-苯乙基醋酸Fig.3　The resolution of chiral (R, S) -1- phenyl ethyl acetate by lipase

終上所述，脂肪酶廣泛應(yīng)用于手性醇的手性拆分[8]，可以用超臨界CO2[9]和離子液體[10]作為酶手性拆分的反應(yīng)介質(zhì)，而且固定化的脂肪酶在轉(zhuǎn)化率和對映體選擇性方面優(yōu)于游離的脂肪酶。脂肪酶拆分手性醇的反應(yīng)匯總于表1。

表1　脂肪酶拆分手性醇

2　手性酯的拆分

布洛芬(異丙酚酸)是一種手性藥物。Lau等[13]將皺褶假絲酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase，CRL)固定在聚丙烯腈(PAN)膜上，然后對酶用量和反應(yīng)溫度等工藝參數(shù)進行了研究，在最佳條件下轉(zhuǎn)化率可以達到96%～98%，產(chǎn)物對映體過量eep達到97%～99%。

(2S,3R)-二甲基-1-乙酰吡啶-2,3-二羧酸酯，是一個莫西沙星中間體。Perla等[14]采用南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CAL B)催化(順)-(±)-二甲基-1-乙酰吡啶-2,3-二羧酸酯，采用自由酶，反應(yīng)需16 h，而具有相似活性的固定化酶，反應(yīng)需140 h。對映體選擇率E=80，在對映體過量eep>99%，轉(zhuǎn)化率為53%。

Hedwig等[15]對2-庚醇己酸酯進行動力學(xué)拆分，以七(2,3-二-O-甲基-6-O-叔丁基二甲基)-β-環(huán)糊精作為手性固定相，固定化的CAL B作為催化劑，得到(R)-烷基酯(eep>99.9%)，隨后用柱狀假絲酵母脂肪酶(Candida cylindracea lipase，CCL)催化酯化反應(yīng)，得到(S)-酯(eep>81.4%)。

對-甲基磺?；交z氨酸乙酯的D-蘇型(MPSE)是合成氟苯尼考的關(guān)鍵中間體。Rui等[16]研究了脂肪酶催化手性拆分DL-蘇-對-MPSE(DL-threo-p-MPSE)，諾維信435(Novzyme 435)脂肪酶的拆分效果最好，轉(zhuǎn)化率為36.83%，ee值為35.13%；發(fā)現(xiàn)對-甲基磺酰苯甲醛是副反應(yīng)的關(guān)鍵中間體，通過加入鋅離子來抑制酶催化的副反應(yīng)，提高了轉(zhuǎn)化率和ee值，達到69.29%和46.26%。

羥丙茶堿[(±)-3,7-(2-羥丙基)-1,3-二甲基-3,7-二氫-1H-嘌呤-2,6-二酮]是一種用于強心劑的化合物。Pawet等[17]報道了用固定化的CAL B催化反應(yīng)，見圖4。反應(yīng)兩天后的產(chǎn)率為45%和46%。反應(yīng)到第六天時，(S)-(+)-丁酸甲酯被分離出來(ee值>99%，對映選擇性E=90)。動力學(xué)拆分的產(chǎn)品可以根據(jù)醇和酯的不同的溶解度在室溫下進行分離。

圖4　脂肪酶拆分手性酯Fig.4　The resolution of chiral ester by lipase

Enise等[18]將CRL脂肪酶分別在存在和不存在杯芳烴羧酸衍生物的情況下嫁接到磁性納米顆粒上，用于對萘普生甲酯的對映選擇性水解。封裝的脂肪酶沒有支撐物相對于封裝在Calix[n]COOH-based的脂肪酶具有較低的轉(zhuǎn)化率和對映體選擇性，Calix[4]COOH-based封裝的脂肪酶具有高的對映體選擇性(對映體比率E>400)，無封裝的脂肪酶對映體選擇性E=137。

Mata等[19]用洋蔥假單胞菌脂肪酶(Lipase from Pseudomonas cepacia，PCL)催化甲氧基乙酸乙酯?；被?，轉(zhuǎn)化率達到50%，對映體選擇率E>200，產(chǎn)物eep=98%。不同的苯環(huán)的取代方式對酶促反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和對映選擇性值有影響。這種酶法路線可應(yīng)用于制備中間體 (S)-達泊西汀。

3　手性胺的拆分

(S)-1-環(huán)丙基-2-甲氧基乙胺是合成促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子-1受體拮抗劑的關(guān)鍵手性中間體。William等[20]通過轉(zhuǎn)氨酶(Vibrio fluvalis)拆分外消旋胺得到S-胺產(chǎn)率38%，ee值為53%。通過CAL B催化癸酸乙酯?；鸱滞庀返玫絊-胺產(chǎn)率35%，ee值為91%。隨后通過甲基環(huán)酮來制備(S)-1-環(huán)丙基-2-甲氧基乙胺，總產(chǎn)率為62%，沒有檢測到R-對映體，見圖5。

圖5　脂肪酶拆分手性胺Fig.5　The resolution of chiral amine by lipase

圖6　脂肪酶拆分手性苯乙胺Fig.6　The resolution of chiral phenethylamine by lipase

Florent等[22]研究了酶法動態(tài)動力學(xué)拆分伯胺。結(jié)合CAL B關(guān)聯(lián)辛硫醇作為自由基消旋劑，甲基β-甲氧基丙酸酯作為?；w，在玻璃器皿中350 nm光照射下反應(yīng)。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率由50%提高到了89%，對映體過量ee值為>99%，對映體選擇率E>200。

圖7　脂肪酶拆分手性伯胺Fig.7　The resolution of chiral primary amine by lipase

Mari等[23]用CAL B(諾維信435)催化拆分N-?；耐庀泛彤惐宜峒柞?，在無溶劑條件下拆分效果為未反應(yīng)的(S)-胺(ee≥98%)，產(chǎn)物(R)-酰胺(ee≥95%)，轉(zhuǎn)化率為50%，見圖7。催化反應(yīng)中，諾維信435的重復(fù)使用穩(wěn)定性不好，利用溶膠-凝膠法對CAL B催化劑進行修飾可以有效的提高其穩(wěn)定性。

鈀納米顆粒負載的氨基官能化的氧化硅介孔泡沫材料催化劑(Pd-AmP-MCF)用于酶法動態(tài)動力學(xué)拆分(DKR)伯胺為酰胺，具有高的產(chǎn)率和ee值。Karl等[24]以1-苯乙胺和芐基胺為例，使用諾維信-435(CAL B)和天野脂肪酶PS-CI(Burkholderia cepacia lipase)催化，轉(zhuǎn)化率為99%，ee值為99%，見圖8。第二種酶超過60 ℃不穩(wěn)定，所以不常用于DKR。多相的Pd-AmP-MCF催化劑可重復(fù)使用5次。

圖8　脂肪酶拆分手性伯胺Fig.8　The resolution of chiral primary amine by lipase

Leandro等[25]用酶法動態(tài)動力學(xué)拆分含硒手性胺(有機硒-1-苯乙胺)，相應(yīng)的酰胺具有高的對映選擇性和產(chǎn)率(產(chǎn)率為40%，ee值為>99%，E值>200)。該一鍋法采用兩種不同類型的催化劑：Pd/BaSO4為外消旋催化劑，CAL B為拆分催化劑。

4　拆分機理

脂肪酶催化的底物及其底物的立體選擇性與脂肪酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)，這主要由脂肪酶結(jié)合位點結(jié)構(gòu)的不同所決定。Pleiss等[26]報道了6種脂肪酶，根據(jù)其結(jié)合位點結(jié)構(gòu)的不同，分為：隧道狀結(jié)合位點(來源于皺褶假絲酵母)；疏水縫隙狀結(jié)合位點(來源于根霉菌類)；漏斗狀結(jié)合位點(來源于南極假絲酵母、假單胞菌屬、哺乳動物胰腺)。不同脂肪酶適用于不同大小底物分子，因此表現(xiàn)出不同的選擇性。

脂肪酶的手性選擇性與來源有關(guān)。如脂肪酶CAL B在底物(仲醇類、胺類及酯類)催化可優(yōu)先對R-構(gòu)型底物反應(yīng)[27]，而脂肪酶CRL則優(yōu)先對S-構(gòu)型底物反應(yīng)[28]。光假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas fluorecens lipases，PFL)在乙酸乙酯作為共溶劑下優(yōu)先對R-構(gòu)型底物反應(yīng)[29]。假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase，PSL)優(yōu)先對R-構(gòu)型底物反應(yīng)[30]。洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶(Burkholderia cepacia lipase，BCL)優(yōu)先對R-構(gòu)型底物反應(yīng)[31]。米赫根毛霉(Rhizomucor miehei lipase，RML)則優(yōu)先對S-構(gòu)型底物反應(yīng)[32]。

脂肪酶的手性拆分機理引起了研究者的濃厚興趣。Jusuk等[33]研究了脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL-D1)對于仲醇的選擇性，見圖9。LPL-D1的對映選擇性隨著在底物的羥基次甲基中心兩個芳基大小之間的差異而增大，一鹵代的對映選擇性很低，而鹵素被叔丁基或者三甲基硅烷基取代，對映選擇性明顯增大，令人驚訝的是異丙基在提高對映體選擇性上比三甲基硅烷基顯著。在其他芳香環(huán)上的第二取代降低了對映選擇性，第二取代基體積的增大，對映選擇性降低(E=H>F>Cl>OMe>NO2)。用較小的芳雜環(huán)取代苯基，對映選擇性增加(Ar=Ph，E=45；Ar=2-furyl，E=93；Ar=3-furyl，E=78)，見圖13a。用相同大小的吡啶環(huán)取代苯環(huán)，對映體選擇性增加(Ar=Ph，E=114；Ar=3-pyridyl，E≥200；Ar=4-pyridyl，E≥200)，見圖13b，這表明基本吡啶環(huán)似乎結(jié)合酶的活性位點更有利。作者認為所有測試的底物，LPL-D1應(yīng)該有相同的立體偏好，這在很大程度上由底物的兩個芳環(huán)的空間位阻控制的。

圖9　脂肪酶拆分仲醇Fig.9　The resolution of secondary alcohol by lipase

圖10　底物a、bFig.10　Substrate a and b

使用中脂肪酶常被固定化，使其穩(wěn)定性增加、易于與產(chǎn)物分離[34-35]。固定化也成為影響脂肪酶手性拆分效果的一個重要因素。脂肪酶有一個疏水性的的“蓋子”，根據(jù)此特點，將其固定在疏水性載體上通常具有良好的活性。Yang等[36]將少根根霉脂肪酶(Rhizopus arrhizus lipase，RAL)分別采用包埋法固定于疏水性乙烯基和甲基丙烯基改性的凝膠和通過共價結(jié)合法固定于環(huán)氧樹脂，仍是優(yōu)先對R-底物酰化，選擇性比自由酶得到提高(ee值為98%，轉(zhuǎn)化率為52%，E值為99)。

蛋白質(zhì)定向進化可以改變酶的底物特異性和對映異構(gòu)體特異性，是研究脂肪酶手性拆分催化機理和提高其手性拆分效果的重要方法。Reetz等[37]最初選擇epPCR在低突變率下只有一個氨基酸取代每個酶分子。經(jīng)過四個周期突變篩選(每輪有2000～3000突變)，水解動力學(xué)拆分手性酯的選擇性E從1.1增加到11.3。已經(jīng)證實定向進化產(chǎn)生的突變體(變種J)在動力學(xué)拆分酯的過程中顯示出更高的對映體選擇性(E>51)[38]，作者做了一個詳細的分子模型量子力學(xué)研究[39]。變種J有六個突變(D20N，S53P，S155M，L162G，T180I和T234S)，其中大部分是再次遠程。

5　結(jié)　語

脂肪酶廣泛適用于非天然底物的催化，表現(xiàn)出優(yōu)良的立體選擇性，在手性藥物的合成中具有重要的應(yīng)用價值[40]。脂肪酶的種類繁多，其結(jié)構(gòu)具有顯著的差異，從而使得來源不同的脂肪酶具有不同的底物專一性，擴大了脂肪酶手性拆分的范圍。脂肪酶對手性醇、手性酯和手性胺進行拆分，表現(xiàn)出良好的拆分效果。其中CAL B酶的手性拆分效果最為顯著，已大量用于手性分子合成，并進行了商業(yè)開發(fā)。在各種催化體系中，研究工作多集中于布洛芬、萘普生等具有極高應(yīng)用價值的醫(yī)藥中間體上。

然而脂肪酶的手性拆分仍存在很多問題。其中之一是脂肪酶在應(yīng)用過程中穩(wěn)定性較差，使得其使用成本相對較高。因此，通過固定化提高脂肪酶的穩(wěn)定性仍是一個重要的研究方向。對于拆分機理的研究，由于脂肪酶種類較多，底物體系繁雜，不易進行定量化比較，從而難以對實際催化反應(yīng)進行理論指導(dǎo)。蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)可以對酶結(jié)構(gòu)加以調(diào)控，從而改變酶的底物特異性，將是這一領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

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Research Progress on Lipase for Chiral Resolution*

HUANG Guan-ting， DU Yu-zhi， PENG Kun， ZHANG Wen-cheng， YE Peng

(Department of Chemistry, Zhejiang Sci-tech University, Zhejiang Hangzhou 310018, China)

Chiral resolution is widely applied in the preparation of chiral drug, which has important scientific significance and practical value. Due to the unique interface catalytic propertirs, lipase can catalysize in organic phase and has become a hot research in chiral resolution. The application of lipase in resolution of some important intermediates for medical and fine chemicals was summarized, such as chiral alcohols, chiral esters and chiral emines. Furthermore, the mechanism of lipase chiral resolution was introduced.

lipase; chiral resolution; enantioselectivity; enzyme immobilization

國家自然科學(xué)基金面上項目(No：51473148)。

黃冠廷(1994-)，男，大學(xué)生。

葉鵬，浙江理工大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師。

TQ 932

A

1001-9677(2016)09-0005-05