馬奎影，萬　全，王伊林，陶謝鑫，黃　俠，柴　花，趙　明

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼 028000)

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黃芪注射液對網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白基因沉默阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78，GRP94 mRNA的作用*

馬奎影，萬全，王伊林，陶謝鑫，黃俠，柴花，趙明△

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼 028000)

目的：研究黃芪注射液對網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)基因沉默阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78，GRP94 mRNA的作用。方法：實驗將體外培養(yǎng)的1～3 d乳鼠心肌細(xì)胞分為5組：對照組、模型組(正常細(xì)胞+3 mg/L阿霉素)、calumenin基因沉默模型組(慢病毒感染細(xì)胞+3 mg/L阿霉素)、黃芪組1(正常細(xì)胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黃芪)、黃芪組2(慢病毒感染細(xì)胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黃芪)。構(gòu)建慢病毒-calumenin質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞,采用實時熒光定量分析(real-time PCR)檢測各組心肌細(xì)胞calumenin及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、GRP94 mRNA表達(dá)。結(jié)果：①與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，而calumenin基因沉默模型組及黃芪組2心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，黃芪組1心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與calumenin基因沉默模型組比較，黃芪組2心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。②與對照組相比較，模型組及calumenin基因沉默模型組心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、GRP94 mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，黃芪組1心肌細(xì)胞GRP78、GRP94 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與calumenin基因沉默模型組比較，黃芪組2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、GRP94 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)。結(jié)論：①阿霉素?fù)p傷可引起心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)減少。②Calumenin可緩解阿霉素?fù)p傷所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。黃芪注射液可抑制阿霉素?fù)p傷所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這種作用可能系通過calumenin介導(dǎo)實現(xiàn)的。

阿霉素；黃芪；網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;心肌細(xì)胞;乳鼠

阿霉素屬蒽環(huán)類抗癌藥物，具有抗瘤譜廣、抗瘤活性強(qiáng)的特點(diǎn)，臨床上廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤治療。但因?qū)π募〉亩拘宰饔?，限制了其在抗腫瘤中的臨床應(yīng)用。隨其劑量的增加而導(dǎo)致不可逆的心肌損傷，最終可發(fā)生擴(kuò)張性心肌病及充血性心力衰竭[1]。關(guān)于阿霉素心肌損傷的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，主要有以下觀點(diǎn)：(1)自由基損傷；(2)線粒體損傷；(3)鈣超載；(4)細(xì)胞凋亡[2]。凋亡的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜,近年發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一條新的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]。網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)是一種位于哺乳動物心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)內(nèi)屬于CREC家族具有多個EF-hand 結(jié)構(gòu)的鈣離子(Ca2+)結(jié)合蛋白[4]，與Ryanodine(雷諾定)受體(RyR2)通道及Ca2+-ATPase(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)相互作用調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣釋放，鈣回攝與儲存，共同維持鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)[5]。中藥黃芪具有顯著的益氣強(qiáng)心作用，文獻(xiàn)報道黃芪及其有效作用成分對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞有保護(hù)作用[6,7],但作用機(jī)制尚未完全闡明。目前關(guān)于黃芪注射液對calumenin及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡研究還未見報道。本研究擬應(yīng)用質(zhì)粒介導(dǎo)shRNA實驗技術(shù)研究黃芪注射液對calumenin基因沉默阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，為阿霉素心肌損傷發(fā)病機(jī)制及其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物、藥品與儀器

1～3 d SD乳鼠購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心,許可證號：scxk(吉)2011-0004;shRNA慢病毒-calumenin質(zhì)粒購于沈陽萬類生物科技有限公司，干擾片段信息：calumenin -sh1 ggatggagacctaattgcc；NC ttctccgaacgtgtcacgt；Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(BioTeke)公司,RNA simple Total RNA Kit試劑盒(TIANGEN)公司,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,阿霉素(深圳萬東藥業(yè)),黃芪注射液(上海新亞藥業(yè))。

1.2乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將乳鼠處死取心臟放入培養(yǎng)皿中，用PBS反復(fù)清洗后剪碎至1～3 mm3小塊，加入0.1%Ⅱ型膠原酶及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min后移入15 ml離心管1 500 r/min離心7 min去上清。用PBS重懸沉淀，用吸管反復(fù)吹打后1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。PBS清洗細(xì)胞兩次，1 000 r/min離心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后放置到培養(yǎng)板中。2 h差速貼壁法去除大量的成纖維細(xì)胞，上清懸液中則為較純的心肌細(xì)胞。細(xì)胞放置在培養(yǎng)板上靜置24 h，隨后每2 d換一次液。培養(yǎng)細(xì)胞至密度為90%左右，PBS清洗2次。按實驗內(nèi)容將細(xì)胞接種于6孔板中，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。24 h后可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度一般在70%為宜。

1.3慢病毒感染分組及處理方法

(1)準(zhǔn)備病毒：取出4℃保存的病毒，使用前輕輕搖勻。(2)感染目的細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始慢病毒感染。(3)用移液器吸取準(zhǔn)確體積(病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)比值為10∶1)的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。(4)在培養(yǎng)基中加入ploybrene(8 μg/ml)提高病毒的感染效率。(5)吸去細(xì)胞中剩余的培養(yǎng)基，在待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分別加入計算好的病毒液。(6)混勻后放于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。(7)24 h后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液(含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基)，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行加藥處理。(8)按如下分組進(jìn)行加藥處理：對照組(正常細(xì)胞)、模型組(正常細(xì)胞+3 mg/L阿霉素)、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白基因沉默模型組(慢病毒感染細(xì)胞+3 mg/L阿霉素)、黃芪組1(正常細(xì)胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黃芪)、黃芪組2(慢病毒感染細(xì)胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黃芪)，黃芪注射液濃度參照發(fā)表文獻(xiàn)[8]。

1.4real-time PCR檢測各組心肌細(xì)胞calumenin及GRP78、GRP94 mRNA表達(dá)

引物序列見表1。經(jīng)下列實驗步驟：樣本總RNA提取，RNA濃度檢測，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR檢測。每種樣本每個基因進(jìn)行4個復(fù)孔平行實驗，實驗數(shù)據(jù)的選取，舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實驗保留數(shù)據(jù)，利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。

Tab.1The primer sequence of calumenin,GRP78 and GRP94 for qPCR analysis calumenin,GRP78,GRP94 mRNA primer sequence

Genes5'-3'CalumeninFGGTGAAGACAGAGCGAGAACCalumeninRATCTCCTCCTTGGTGAGCTTGRP78-FCAGCCAACTGTAACAATCAAGRP78-RCTGTCACTCGGAGAATACCAGRP94-FGGTGTTGTGGATTCCGATGAGRP94-RAAGTTTAGCAAGCCGTGTβ-actin-FCTGTGCCCATCTACGAGGGCTATβ-actin-RTTTGATGTCACGCACGATTTCC

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1各組乳鼠心肌細(xì)胞圖片

各組心肌細(xì)胞經(jīng)免疫熒光圖片分析，網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白基因沉默模型組及黃芪組2心肌細(xì)胞慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.2real-time PCR檢測各組乳鼠心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)

與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，而calumenin基因沉默模型組及黃芪組2心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，黃芪組1心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與calumenin基因沉默模型組比較，黃芪組2心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01，圖2,表2)。

Fig.2The melting and amplification curve of calumenin mRNA

A:Calumenin;B:Calumenin interference;

The left of A/B(the x-coordinate is temperature,the y-coordinate is dF/dT);The right of A/B(the x-coordinate is △ Rn,the y-coordinate is Cycle)

Tab.2Expression of calumenin mRNA in the mouse myocardial cells

Group2-ΔΔCtControlgroup1.25±0.04Modelgroup0.90±0.03*Calumeningenesilencingmodelgroup0.40±0.02**Astragalus1group1.20±0.03**Astragalus2group0.70±0.01**

*P<0.05,**P<0.01 vs control

2.3real-time PCR檢測各組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78 mRNA表達(dá)

與對照組相比較，模型組及calumenin基因沉默模型組心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78 mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，黃芪組1心肌細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與calumenin基因沉默模型組比較，黃芪組2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01,表3)。

Tab.3Expression of endoplasmic reticulum stress chaperone GRP78 mRNA in mouse myocardial cells

Group2-ΔΔCtControlgroup0.80±0.02Modelgroup1.70±0.04**Calumeningenesilencingmodelgroup2.30±0.02**Astragalus1group1.00±0.02**Astragalus2group1.34±0.03**

**P<0.01 vs control

2.4real-time PCR檢測各組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP94 mRNA表達(dá)

與對照組相比較，模型組及calumenin基因沉默模型組心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP94 mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，黃芪組1心肌細(xì)胞GRP94 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與calumenin基因沉默模型組比較，黃芪組2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP94 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01,表4)。

Tab.4Expression of endoplasmic reticulum stress chaperone GRP94 mRNA in the mouse myocardial cells

Group2-ΔΔCtControlgroup1.00±0.02Modelgroup1.70±0.04**Calumeningenesilencingmodelgroup2.40±0.03**Astragalus1group1.10±0.02**Astragalus2group1.90±0.02**

**P<0.01 vs control

3　討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在心肌等肌細(xì)胞內(nèi)稱肌漿網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的細(xì)胞器。蛋白折疊是一個復(fù)雜的過程，初級多肽鏈轉(zhuǎn)變?yōu)闊釀恿W(xué)穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)，繼而形成有功能的結(jié)構(gòu)蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白質(zhì)功能異常，可能致誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，并且識別錯誤折疊蛋白，并通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過上調(diào)分子伴侶蛋白GRP78及GRP94 表達(dá)、抑制蛋白質(zhì)合成、加速錯誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)降解等方式緩解ERS。然而持續(xù)或較嚴(yán)重的ERS 則觸發(fā)凋亡信號，誘導(dǎo)CHOP、caspase-12、JNK 等促凋亡因子的表達(dá)及活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了阿霉素心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡[10]。

網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)是一種位于哺乳動物心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)內(nèi)屬于CREC家族具有多個EF-hand 結(jié)構(gòu)的鈣離子(Ca2+)結(jié)合蛋白，文獻(xiàn)報道：calumenin緩解心肌細(xì)胞ERS并減少ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量[11]。本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)calumenin對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[12]。要明確黃芪對calumenin及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用，必須先沉默calumenin基因，制備阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞模型，比較黃芪注射液對未沉默calumenin基因及沉默calumenin基因的阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞作用，明確黃芪注射液是否通過干預(yù)calumenin表達(dá)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來發(fā)揮對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

在本實驗中觀察到阿霉素?fù)p傷可引起心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)減少，calumenin可緩解阿霉素?fù)p傷所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及黃芪注射液可抑制阿霉素?fù)p傷所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且這種作用可能系通過calumenin介導(dǎo)實現(xiàn)的。上述機(jī)制為阿霉素心肌病發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)理論研究以及臨床治療依據(jù)。

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The effect of astragalus injection on the expression of endoplasmic reticulum stress chaperonin GRP78 and GRP94 mRNA in adriamycin- injured cardiomyocytes with calumenin silencing by shRNA

MA Kui-ying，WAN Quan，WANG Yi-li，TAO Xie-xin，HUANG Xia，CHAI Hua，ZHAO Ming△

(The Inner-Mongolia National University Affiliated Hospital,Tongliao 028000,China)

Objective:To investigate the effect of astragalus injection on the endoplasmic reticulum stress in adriamycin(ADR)-injured cardiomyocytes with calumenin silencing by shRNA.Methods:Firstly,the stable lentiviral calumenin shRNAvector was constructed.Secondly,in vitro cultured neonatal rat cardiac myocytes were randomly divided into control group、normal group(3 mg/L ADR),lentivirus infection group(lentivirus infection+3 mg/L ADR),Astragalus group 1(3 mg/L ADR+Astragalus),Astragalus group 2(lentivirus infection+3 mg/L ADR+Astragalus).The mRNA epression level of calumenin expression and reticulum stress chaperone in GRP78,GRP94 of each group was monitored by real-time PCR.Results:①Compared with that of the control group,the calumenin mRNA expression in the normal group was reduced(P<0.05),yet its mRNA level in lentivirus the infection group and the Astragalus group 2 was further reduced(P<0.01).Compared with that of the normal group,the mRNA contents of calumenin in the Astragalus group 1 was increased(P<0.05).The expression of calumenin in Astragalus group 2 was increased comparing with lentivirus infection group(P<0.01).②Compared with that in the control group,the expression of reticulum stress chaperone in GRP78,GRP 94 in lentivirus infection group and normal group was significantly increased(P<0.01);Compared with that in the normal group,the expression of reticulum stress chaperone in GRP78,GRP94 in Astragalus group 1 was reduced(P<0.01);Compared with that in the lentivirus infection group,the expression of reticulum stress chaperone in GRP78,GRP94 in the Astragalus group 2 was obviously decreased(P<0.01).Conclusion:①Calumenin can alleviate endoplasmic reticulum stress induced by ADR-injured myocardial cells.②Astragalus injection can restrain the endoplasmic reticulum stress induced by adriamycin,which may be achieved by the calumenin protein.

adriamycin;astragalus;calumenin;endoplasmic reticulum stress;cardiomyocyte;suckling rat;eticulum stress;cardiomyocyte;suckling rat

2014-12-10

2015-11-02

△Tel：13474859991；E-mail:langzhe73@163.com

R331.3；R-332

A

1000-6834(2016)02-154-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.015