沙愛龍

(西南醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，四川 瀘州 646000)

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阿里紅黃酮對(duì)衰老模型小鼠的抗衰老作用*

沙愛龍△

(西南醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，四川 瀘州 646000)

目的：研究阿里紅黃酮對(duì)衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法：將小鼠隨機(jī)分為6組(n=12)：正常對(duì)照組，衰老模型組，陽性對(duì)照組，低、中、高劑量阿里紅黃酮組。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用D-半乳糖頸背部皮下注射建立亞急性衰老小鼠模型，用不同劑量的阿里紅黃酮(100、200和400 mg/(kg·d))灌服小鼠6周后，計(jì)算衰老模型小鼠腦指數(shù)及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，測(cè)定其腦組織丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、肝組織過氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果：阿里紅黃酮3個(gè)劑量組可不同程度的升高衰老模型小鼠的腦指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腦組織中的GSH- Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性，降低其腦組織中的MDA含量。結(jié)論：阿里紅黃酮可能通過提高機(jī)體的抗氧化能力而達(dá)到抗衰老作用。

阿里紅黃酮；衰老模型小鼠；抗衰老；抗氧化酶

阿里紅(Fomes officinalis Ames)，又名苦白蹄，屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、層孔菌屬(Fomes)真菌，為落葉松病原菌，主要分布在我國西部和東北，其中新疆林區(qū)分布廣泛，尤以阿爾泰林區(qū)所產(chǎn)最為著名，容易采集。作為常用的維吾爾藥材，有溫胃祛痰、祛風(fēng)除濕、消腫利尿之功用[1]，并且能增強(qiáng)體力和機(jī)體的應(yīng)激能力。阿里紅含有黃酮、多糖、皂甙類和萜烯類等化學(xué)成分。近年來對(duì)阿里紅多糖藥理學(xué)研究已有報(bào)道，如依巴代提·托乎提等[2]通過阿里紅多糖對(duì)氧自由基的清除作用實(shí)驗(yàn)研究表明：阿里紅多糖在體外可有效的清除O2-，可明顯減少小鼠心臟、肝臟、腎臟和脾臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量；叢媛媛等[3]通過阿里紅多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響得知阿里紅多糖有顯著的免疫增強(qiáng)作用；帕麗達(dá)·阿不力孜等[4]通過阿里紅多糖對(duì)衰老模型小鼠的抗衰老作用研究表明阿里紅多糖具有一定的抗衰老作用。黃酮亦為阿里紅主要有效成分之一，阿布來提·阿布都熱西提[5]用乙醇熱回流法對(duì)阿里紅中總黃酮進(jìn)行了提取并測(cè)定其含量，結(jié)果表明阿里紅中黃酮含量為1.82 mg/g。目前，關(guān)于阿里紅黃酮藥理學(xué)方面的研究尚少有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬用阿里紅黃酮作用于衰老模型小鼠，看其對(duì)小鼠是否具有抗衰老作用，以期為阿里紅的開發(fā)和利用提供新的理論基礎(chǔ)，也可為新藥的研發(fā)提供新思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，許可證號(hào)SCXK(新)2003-0001，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)站提供。

1.2藥品與儀器

阿里紅，采于新疆阿勒泰并經(jīng)鑒定。D-半乳糖、Triton X-100(Sigma公司)，維生素E、H2O2(Fluka公司)，鉬酸銨(滬試)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。無水乙醇、丙酮、乙醚、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4及NaCl均為國產(chǎn)分析純。PowerWave XS全波長酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek寶特)，723型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，紫外可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，精密電子天平(上海精科天平)，電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3阿里紅黃酮的制備

參照阿布來提·阿布都熱西提提取方法Ⅱ[5]制備：將陰干的阿里紅粉末，置于索氏提取器中，用75 %乙醇為溶劑連續(xù)提取6 h，最后進(jìn)行減壓濃縮。經(jīng)真空干燥箱60℃干燥，所得膠狀固體參照阿布來提·阿布都熱西提的鑒定方法[5]鑒定為阿里紅總黃酮。精密稱取阿里紅黃酮2.00 g，置100 ml容量瓶中，加蒸餾水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得400 mg/kg高劑量阿里紅黃酮(含阿里紅黃酮20 mg/ml)。后稀釋兩次，各稀釋一倍，得200 mg/kg 中劑量(含阿里紅黃酮10 mg/ml)和100 mg/kg低劑量(含阿里紅黃酮5 mg/ml)阿里紅黃酮。

同時(shí)配制1.5%的D-半乳糖溶液與0.25%的維生素E溶液(用植物油溶解)，分別裝入磨口瓶中，放人冰箱中冷藏備用。

1.4動(dòng)物分組、衰老模型建立及給藥

72只小鼠，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，衰老模型組，陽性對(duì)照組(維生素E)，低、中、高劑量阿里紅黃酮組(n=12)。除正常對(duì)照組外，其余各組300 mg/kg(1.5%的D-半乳糖溶液，按0.20 ml/10 g注射)每日頸背部皮下注射D-半乳糖，連續(xù)6周，建立小鼠衰老模型，正常組注射等量生理鹽水。造模同時(shí)每天分別灌胃(0.20 ml/10 g)給予低、中、高劑量阿里紅黃酮，陽性對(duì)照組每天給予維生素E 50 mg/(kg·d)(0.25%的維生素E溶液，按0.20 ml/10 g灌胃)，正常對(duì)照組、衰老模型組給予生理鹽水50 ml/kg。6周后，各組小鼠頸椎脫臼處死取全腦、胸腺、脾臟、肝臟，用4℃的生理鹽水沖洗2 次，濾紙拭干后，立即稱重，計(jì)算出腦及免疫器官指數(shù)。剪碎腦及肝組織塊，分別置于9倍的預(yù)冷生理鹽水中，冰水浴勻漿10 min，分別制成10%腦及肝臟組織勻漿，離心后取上清液待測(cè)。

1.5測(cè)定指標(biāo)及方法

分別測(cè)定：腦組織勻漿中蛋白質(zhì)、MDA含量及GSH-Px活性，肝組織勻漿中蛋白質(zhì)含量及過氧化氫酶(catalase，CAT)、SOD活性。

CAT活性測(cè)定采用鉬酸銨比色法。

SOD、GSH-Px活性和蛋白質(zhì)、MDA含量測(cè)定均按照所購買試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1阿里紅黃酮對(duì)衰老模型小鼠腦及免疫器官指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠的腦指數(shù)及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)。與衰老模型組相比，阿里紅黃酮3個(gè)劑量組腦指數(shù)及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均升高，其中3個(gè)劑量組的脾臟指數(shù)和中、高劑量組的腦指數(shù)、胸腺指數(shù)均極顯著高于衰老模型組(P<0.01)，低劑量組的腦指數(shù)、胸腺指數(shù)雖高于衰老模型組，但差異均不顯著。維生素E組(陽性對(duì)照)小鼠的腦指數(shù)及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均極顯著高于衰老模型組(P<0.01，表1)。

GroupCerebralSpleenThymusNormalcon-trol15.09±2.377.53±1.201.87±0.36Agingmodel10.85±1.03**3.08±0.44**0.64±0.10**VitaminE13.28±1.14##5.21±0.72##1.13±0.24##Lower11.46±1.694.66±0.69##0.86±0.20Intermediate12.87±0.75##5.27±0.75##1.29±0.28##High13.75±1.16##5.98±0.81##1.14±0.15##

**P<0.01 vs normal control;#P<0.05,##P<0.01 vs aging model

2.2阿里紅黃酮對(duì)衰老模型小鼠腦組織MDA、GSH-Px及肝組織CAT、SOD的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中的MDA含量極顯著增加(P<0.01)，衰老模型組小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性均極顯著降低(P<0.01)。與衰老模型組相比，阿里紅黃酮3個(gè)劑量組小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性均升高，且都呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)的趨勢(shì)，其中高劑量組的腦組織GSH-Px活性和中、高劑量組的肝組織CAT、SOD活性均極顯著高于衰老模型組(P<0.01)，中劑量組的腦組織GSH-Px活性和低劑量組的肝組織CAT、SOD活性均顯著高于衰老模型組(P<0.05)，低劑量組的腦組織GSH-Px活性雖高于衰老模型組，但差異不顯著(P>0.05)。阿里紅黃酮3個(gè)劑量組和維生素E組(陽性對(duì)照)小鼠腦組織中的MDA含量均極顯著低于衰老模型組(P<0.01)。維生素E組(陽性對(duì)照)小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性均極顯著高于衰老模型組(P<0.01,表2)。

Tab.2　Effects of the Fomes officinalis flavonoids on the contents of MDA and the activities of GSH-Px in brain tissues,the activities of CAT and SOD in liver tissues of the aging model mice ±s，n=12)

MDA：Malondialdehyde；GSH-Px：Gutathione peroxidase；CAT：Catalase；SOD：Superoxide dismutase

3　討論

衰老是生命過程中正常而又復(fù)雜的生物過程，是諸多病理、生理過程綜合作用的結(jié)果，主要表現(xiàn)為生物體全身各組織、器官的退行性變化，從而使細(xì)胞變性、萎縮、數(shù)量減少、組織脫水以致大部分臟器重量減輕[6]。D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型是基于衰老的代謝學(xué)說而復(fù)制的一種衰老模型，是目前常用的制備衰老動(dòng)物模型的方法[7,8]，其衰老反應(yīng)接近或相當(dāng)于自然衰老[9]。D-半乳糖是機(jī)體正常的營養(yǎng)成分，在一定時(shí)間內(nèi)，連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的D-半乳糖，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的半乳糖濃度就會(huì)過多，這些半乳糖可由半乳糖氧化酶催化生成醛糖和過氧化氫，產(chǎn)生超氧陰離子損害正常組織細(xì)胞[10]。醛糖在醛糖還原酶的催化下，還原成不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝的半乳糖醇，從而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹重要器官代謝障礙[11]，最終出現(xiàn)衰老。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：衰老模型組小鼠的腦指數(shù)及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均極顯著低于正常對(duì)照組，腦及脾臟、胸腺顯著性萎縮說明本研究采用D-半乳糖造模成功；阿里紅黃酮3個(gè)劑量組可不同程度的升高衰老模型小鼠的腦指數(shù)及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，說明阿里紅黃酮能有效延緩小鼠腦及免疫器官的萎縮與退化、對(duì)抗衰老、促進(jìn)機(jī)體代謝、提高機(jī)體免疫力。

脂質(zhì)過氧化是氧自由基損傷組織的重要方式，MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，其在腦組織中的水平隨年齡的增加而升高，MDA含量的多少可間接反映自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度[12]。GSH-Px、CAT、SOD是機(jī)體清除自由基的主要抗氧化酶，其含量可間接反映機(jī)體清除自由基的能力[13,14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿里紅黃酮3個(gè)劑量組可不同程度的升高衰老模型小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性，降低其腦組織中的MDA含量。這與鐘靈等[15]研究黃芪多糖對(duì)衰老模型小鼠血清中MDA含量、SOD活性及肝組織中GSH-Px活性、腦組織中CAT活性的影響結(jié)果相一致。本研究結(jié)果提示，阿里紅黃酮可減輕機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷、提高抗氧化酶活性、增強(qiáng)自身抗氧化能力，從而發(fā)揮抗衰老作用。已有研究表明阿里紅多糖具有一定的抗衰老作用[4]，充分說明阿里紅中黃酮、多糖均為其抗衰老有效成分，但抗衰老作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of the Fomes officinalis flavonoids on anti-senile action in the aging model mice

SHA Ai-long△

(Department of Physiology,Southwest Medical University,Luzhou 646000,China)

Objective:To study the anti-senile effects of the Fomes officinalis flavonoids on the aging model mice.Methods:All Kun ming mice were randomly divided into six groups,and each group consisted of 12 animals.The groups were categorized as normal,model,positive control groups and low(100 mg/(kg·d)),medium(200 mg/(kg·d)),high(400 mg/(kg·d))doses of Fomes officinalis flavonoids treated groups.The study was carried out to investigate the cerebral index,spleen index,thymus index,the contents of malondi-aldehyde(MDA)and the activities of glutathione peroxidase(GSH-Px)in brain tissues as well as the activities of catalase(CAT)and superoxide dismutase(SOD)in liver tissues of the aging model mice treated with D-galactose in vivo by subcutaneous injection together with the Fomes officinalis flavonoids at doses of 100,200 and 400 mg/(kg·d)for 6 weeks.The normal group was administered with 0.20 ml/10 g of normal saline s.c.and 50 ml/kg of normal saline i.g.daily.Results:Compared with the aging model groups,the three doses of the Fomes officinalis flavonoids could elevate the cerebral index,spleen index,thymus index,activities of GSH-Px in brain tissues,the activities of CAT and SOD in liver tissues to different degree and decrease the contents of MDA.Conclusion:The Fomes officinalis flavonoids might have anti-senile action by improving antioxidant capacity of human body.

Fomes officinalis flavonoids;aging model mice;anti-senile;antioxidase

瀘州醫(yī)學(xué)院人才引進(jìn)科研啟動(dòng)金(2014YJRC04)；塔里木大學(xué)校長基金自然科學(xué)項(xiàng)目(TDZKSS201304)

2015-01-26

2015-10-13

△Tel：0830-3167057；E-mail:lyshaailong@163.com

R285.5

A

1000-6834(2016)02-121-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.007