羅梓垠，郭長(zhǎng)滿，項(xiàng)冰倩，宋　冬，陳　丹，應(yīng)　磊，邱曉曉，王萬(wàn)鐵

(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035 )

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右美托咪定對(duì)肺缺血/再灌注損傷小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子Caspase-12表達(dá)的影響*

羅梓垠+，郭長(zhǎng)滿+，項(xiàng)冰倩，宋冬，陳丹，應(yīng)磊，邱曉曉△，王萬(wàn)鐵△

(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035 )

目的：探討右美托咪定(DEX)對(duì)肺缺血/再灌注(I/R)損傷小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)分子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)表達(dá)的影響。方法：選用C57BL/6J小鼠復(fù)制在體左肺原位I/R損傷模型。隨機(jī)將40只小鼠分為4組(n=10)：假手術(shù)組(sham組)，I/R損傷組(I/R組)，生理鹽水對(duì)照組(NS組)，右美托咪定干預(yù)缺血/再灌注組(DEX組)。DEX組在夾閉小鼠左肺門30 min前經(jīng)腹腔注射DEX 25 μg/kg，NS組為用同DEX組等體積的生理鹽水替代DEX，其余操作同DEX組。3 h肺再灌注結(jié)束后，留取左肺。測(cè)定肺組織濕/干重比(W/D)及總肺含水量(TLW)，光鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變，對(duì)肺組織進(jìn)行損傷評(píng)估(IQA)。原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，蛋白免疫印跡法(Western blot)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測(cè)Caspase-12、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(grp78)蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:與sham組比，I/R組和NS組肺W/D、TLW、IQA、AI均明顯升高(P<0.01)，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯，Caspase-12、grp78蛋白和mRNA 表達(dá)量增加(P<0.01)；I/R組與NS組相比，兩組Caspase-12、grp78蛋白和mRNA 表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。DEX組與I/R組比，W/D、TLW、IQA和AI均有下降(P<0.01或P<0.05)，肺組織形態(tài)學(xué)改變明顯減輕，Caspase-12和grp78蛋白和mRNA 表達(dá)量下降(P<0.01)。結(jié)論：DEX可有效緩解小鼠肺缺血/再灌注性損傷，其機(jī)制可能與其對(duì)抗ERS中Caspase-12引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Caspase-12；右美托咪定；缺血/再灌注；肺；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；小鼠

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的迅猛發(fā)展，肺動(dòng)脈袖狀切除、肺移植、心肺聯(lián)合移植、肺溶栓治療等新的醫(yī)療方法不斷地建立和發(fā)展，但肺缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)始終是溶栓及移植后影響預(yù)后的一個(gè)重要因素。研究表明，缺血缺氧、葡萄糖/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、氧化應(yīng)激及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。過度的ERS則會(huì)引起細(xì)胞凋亡，肺組織細(xì)胞凋亡在PIRI發(fā)生中起關(guān)鍵作用[1-3]。因此，尋求肺I/R的防治方法顯得十分迫切和重要。其中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(cysteinylaspartate specific proteinase-12,Caspase-12)是ERS的主要凋亡信號(hào)分子之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子平衡的失調(diào)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白積累過多都會(huì)導(dǎo)致Caspase12的表達(dá)[4]。ERS時(shí)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulating protein 78，grp78)與3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE1和ATF6解離，致使這3種跨膜蛋白活化，起到重要的調(diào)控作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白[5]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)為α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑[6]，能夠通過減輕肺部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)肺起到顯著的保護(hù)作用[7]，并且有研究表明它對(duì)心肌、腎臟等缺血/再灌注損傷均都具有一定的藥理療效[8～9]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究右美托咪定能否通過抑制ERS中Caspase-12的表達(dá)以減輕小鼠肺I/R損傷，為臨床預(yù)防和治療肺I/R損傷提供新的治療思路與方法。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠40只，8～10周齡，雄性，體重(20±2)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2012-075。

1.2藥品及試劑

右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，DNase I、Proteinase K(Sigma)，TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche)，DAB 顯色試劑盒( 北京中杉金橋生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒(Fermentas Life Science);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，一抗：兔抗GAPDH多克隆IgG 抗體(杭州至賢生物科技有限公司)，Caspase-12、grp78(Cell Signaling Technology),二抗：HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG二抗(Abcam)。其余所需試劑均為市售分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

將40只SPF級(jí)C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：假手術(shù)組(sham組)、I/R損傷組(I/R組)、生理鹽水對(duì)照組(NS組)、右美托咪定干預(yù)缺血/再灌注組(DEX+I/R組)。DEX組在夾閉小鼠左肺門30 min前經(jīng)腹腔注射25 μg/kg DEX，NS組給予與同DEX組等體積的生理鹽水，其余操作均同I/R組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，留取左肺組織。

1.4模型制作

依據(jù)參考文獻(xiàn)建立小鼠原位左肺I/R模型[10],小鼠腹腔麻醉后,取仰臥位固定，備皮消毒，行倒T型氣管切開術(shù),插入20G注射針套管后，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù)。于小鼠左側(cè)2、3 肋間體表處，備皮消毒，用組織剪逐層鈍性分離至胸腔，暴露左肺門，用微型動(dòng)脈夾夾閉肺門30 min,即為缺血期；繼之松開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注3 h,為再灌注期。3 h肺再灌注結(jié)束后，處死小鼠，留取左肺組織。術(shù)中維持小鼠體溫在(37+0.5)℃。假手術(shù)組(sham組)僅開胸不夾閉左肺門，其余操作步驟均同I/R組，實(shí)驗(yàn)畢，處死小鼠，留取左肺組織。

1.5肺W/D及TLW值

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，獲取小鼠左肺上葉組織，生理鹽水漂洗，用濾紙吸除表面血液和水分，稱重，記為濕重(wet weight,W)，置于80℃恒溫烤箱48 h,稱重，記為干重(dry weight,D)。W、D兩者的比值表示肺干濕比(wet weight to dry weight of lung tissue,W/D)，以W-D/D計(jì)算總肺水含量(total lung water content,TLW)。

1.6肺泡損傷定量指標(biāo)(IQA)檢測(cè)及光鏡觀察

取小鼠左肺下葉組織，大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，生理鹽水漂洗，4%甲醛固定。常規(guī)石蠟包埋，組織切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察各組肺組織形態(tài)學(xué)變化，并計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取50個(gè)視野連續(xù)觀察，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞和(或)白細(xì)胞數(shù)大于2個(gè)或肺泡內(nèi)有水腫滲出者的均視為損傷細(xì)胞，每視野內(nèi)損傷肺泡數(shù)占總肺泡數(shù)的百分比即為肺泡損傷定量評(píng)估指標(biāo)(index of quantitative evaluation for alveolar damage,IQA)。

1.7原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書操作，光鏡下(×400)觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)數(shù)，胞核呈棕褐色者為凋亡細(xì)胞，胞核呈藍(lán)紫色者為未凋亡細(xì)胞。每片至少觀察500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)，則為凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)。

1.8Caspase-12、GRP 78蛋白表達(dá)量測(cè)定

取100 mg小鼠肺組織用液氮在研缽里加以研磨，用1 000 μl RIPA(含10 μl PMSF)裂解組織，待研磨充分后，吸取勻漿液物理低溫離心，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白均調(diào)配成2 μg/μl,繼之將蛋白煮沸變性。配膠進(jìn)行電泳，上樣量30 μg，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。再將用TBS浸濕的膜放至5%脫脂奶粉，室溫下封閉1 h，TBST漂洗，加入一抗(Caspase-12/grp78/GAPDH，均以1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗滌每次5 min×3次，再加入二抗(HRP標(biāo)記)：Caspase-12(1∶3 500)，grp78(1∶4 500),GAPDH(1∶4 000)，室溫孵育1～2 h。TBST洗滌每次5 min×3次，滴加ECL工作液，反應(yīng)5 min，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影。GAPDH為內(nèi)參，掃描后，用凝膠分析軟件分析內(nèi)參蛋白與目的蛋白吸光度值。

1.9Caspase-12、GRP 78 mRNA表達(dá)量

取小鼠肺組織100 mg，加液氮在研缽里加以研磨，以Trizol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成及擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性:94℃,1 min;變性:94℃,30 s;退火:Caspase-12(57℃),GAPDH(55℃),grp78(49℃),30 s;延伸:72℃,30 s；終止延伸:72℃,10 min;循環(huán)31次。引物序列如表1。

Tab.1　Gene sequence primers

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組肺組織損傷情況比較

Sham組，I/R組，NS組,DEX組的W/D分別是3.08±0.75、5.51±1.56、5.37±0.58、4.08±0.49。各組TLW值分別是2.08±0.75、4.51±1.56、4.37±0.58、3.08±0.49。各組的IQA分別是6.23%±1.76%、42.77%±4.34%、42.80%±3.39%、20.20%±3.33%。與sham組相比較，I/R組和NS組的明顯上升(P<0.01)，與NS組相比，I/R組和NS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；DEX組與I/R組比，W/D、TLW、IQA值下降明顯(P<0.01，圖1)。

W/D:The lung tissue wet/dry weight;TLW:The total lung water content;IQA:The damage assessment for the lung tissue

*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs I//R group

2.2光鏡下各組肺組織形態(tài)學(xué)觀察

Sham組肺泡結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)完好，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A，圖2見彩圖頁(yè)Ⅲ)；I/R組和NS組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)明顯增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)見明顯滲出和水腫(圖2B、C)；DEX組肺泡損傷小，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，間質(zhì)無(wú)增厚，炎癥浸潤(rùn)及水腫滲出程度減輕(圖2D)。箭頭所指為損傷部位。

2.3各組肺組織細(xì)胞凋亡情況比較

sham 組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少(圖3A，圖3見彩圖頁(yè)Ⅲ)；I/R組、NS組細(xì)胞凋亡程度最為嚴(yán)重，以血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡較為明顯，肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)亦有大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)(圖3B、C)；DEX組凋亡程度相對(duì)較低，并且相比于I/R和NS組有改善明顯。圖中棕褐色顆粒皆為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞(圖3D)。

2.4各組肺組織Caspase-12和grp78蛋白的表達(dá)水平

與sham組比，其余各組Caspase-12、grp78 蛋白水平均升高(P<0.01)；I/R組與NS組的蛋白表達(dá)水平相比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；，DEX組Caspase-12蛋白水平與I/R組相比，呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.01，圖4)。

Fig.4Levels of Caspase-12 and grp78 protein in each group

A:Sham group;B:I/R group;C:NS group;D:DEX group

*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs I/R group

2.5各組肺組織Caspase-12和grp78 mRNA的表達(dá)水平

其余各組與sham組比，Caspase-12和grp78 mRNA水平均上升明顯(P<0.01)；I/R組與NS組的mRNA表達(dá)水平相比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。與IR組相比，DEX組Caspase-12 mRNA表達(dá)量明顯減少(P<0.01，圖5)。

Fig.5Levels of Caspase-12 and grp78 mRNA in each group

A:Sham group;B:I/R group;C:NS group;D:DEX group

*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs I/R group

3　討論

近來(lái)，隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡認(rèn)識(shí)的深入，對(duì)其機(jī)制的研究也越加透徹，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是研究細(xì)胞凋亡的熱點(diǎn)之一。研究表明：在肺組織I/R發(fā)生發(fā)展過程中，可誘發(fā)過度的ERS，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11，12]。Caspase-12的表達(dá)激活是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡的途徑之一，它廣泛存在于小鼠的各組織中,在肺、腎臟、肝臟中均為高表達(dá)[13]。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，過度的ERS可引起其他Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Caspase-9、Caspase-3的活化，最終導(dǎo)致Caspase-12活化介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)過多的蛋白沉積，以及鈣離子平衡的破壞均能引起ERS，而非ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，則無(wú)Caspase-12的活化，表明Caspase-12與ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制有關(guān),而與非ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)[15]。本研究中，對(duì)小鼠左肺進(jìn)行I/R處理后，肺組織中的Caspase-12蛋白和mRNA表達(dá)明顯上升。表明I/R過程中發(fā)生了過度的ERS，使Caspase-12表達(dá)上升。且Caspase-12介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡途徑，引起小鼠肺組織損傷。

Grp78(78-kD glucose-regulated protein)，屬于熱休克蛋白Hsp70亞家族。Grp78是一種主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子結(jié)合分子伴侶，它是一種高度保守的蛋白，對(duì)維持細(xì)胞正?；钚云鹬浅Ｖ匾淖饔肹16]。當(dāng)各種誘導(dǎo)條件導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白折疊受到干擾并不能完全正常進(jìn)行時(shí)，grp78的表達(dá)量就會(huì)急速增加。因此，grp78的急速上調(diào)被認(rèn)為是ERS最敏感的標(biāo)志[17]。本研究中，sham組grp78蛋白和mRNA表達(dá)量處于較低水平，I/R組的表達(dá)水平則明顯高于sham組，提示肺I/R誘發(fā)ERS，grp78在發(fā)揮其保護(hù)作用。但如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生持久和(或)過強(qiáng)的應(yīng)激，會(huì)超出grp78的防御能力，導(dǎo)致機(jī)體喪失自我修復(fù)能力，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。

DEX是一種在臨床上廣泛使用的鎮(zhèn)痛麻醉藥物，具有鎮(zhèn)靜、抗炎和交感神經(jīng)阻滯作用[6]。DEX能促進(jìn)IL-10的生成，參與單肺通氣期間 ALI 時(shí)局限、抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，且能夠使肺泡間隔厚度降低，抑制肺水腫和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活力，起到肺保護(hù)作用[8]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，DEX預(yù)處理可以維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，保證重要器官的血流灌注，能減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕大鼠肝臟缺血/再灌注損傷，改善器官損傷情況[18]。本研究中，經(jīng)DEX干預(yù)后，肺組織損傷情況有明顯改善，凋亡細(xì)胞減少。Caspase-12蛋白和mRNA水平相較于I/R組有明顯下降，表明DEX通過使Caspase-12表達(dá)下調(diào)，以減輕肺I/R損傷。DEX組grp78相較于sham組仍處于高水平表達(dá)，表明藥物作用后，grp78仍舊發(fā)揮著積極的保護(hù)作用。

綜上所述，右美托咪定對(duì)肺I/R損傷能起到較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制ERS中Caspase-12的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Effect of dexmedetomidine on expression of endoplasmic reticulum stress- related Caspase-12 in lung ischemia/reperfusion injury mice

LUO Zi-yin+,GUO Chang-man+,XIANG Bing-qian,SONG Dong,CHEN Dan,YING Lei,QIU Xiao-xiao△,WANG Wan-tie△

(Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China)

Objective:To investigate the effect of dexmedetomidine(DEX)on expression of endoplasmic reticulum stress(ERS)-related cysteinyl aspirate specific proteinase-12(Caspase-12)in lung ischemia/reperfusion(I/R)injury mice.Methods:Forty C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups:sham operation group(sham group),ischemia/reperfusion injury group(I/R group),normal salinecontrol group(NS group),ischemia/reperfusion + dexmedetomidine group(DEX group).Dexmedetomidine was infused intraperitoneally into the mice to stablish situ left pulmonary I/R injury mouse model.In NS group,the isometric dexmedetomidine was replaced by normal saline，other operations were as the same as the DEX group.After reperfusion 3 hours,the lung tissue wet/dry weight(W/D),the total lung water content(TLW)of the left lung tissues were determined.The lung tissue morphology changes were observed by light microscopy and the damage assessment(IQA)was taken.The structure changes and the apoptosis index(AI)of the lung tissues were evaluated by TUNEL method.The protein and mRNA expression of Caspase-12 and grp78 in lung tissues were detected by Western blot and reverse translate-PCR.Results:Compared with the sham group,the W/D,TLW,IQA,AI,lung tissue structure damages,and the expression of Caspase-12 and grp78 protein and mRNA obviously raised both in I/R group and NS group(P<0.01 or P<0.05).Compared with I/R group,the W/D,TLW,IQA,AI of DEX group were all decreased,the demaged lung tissue morphology changes were significantly reduced,the protein and mRNA expression level of Caspase-12 and grp78 in DEX group were decreased(P<0.01).Conclusion:DEX can effectively relieve the lung I/R injuries in mice,which maybe associated with inhibition of pneumocyte apoptosis induced by ERS-related Caspase-12 pathway.

Caspase-12;dexmedetomidine;ischemia/reperfusion;lung;endoplasmic reticulum stress;mice

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2013C33168)；浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2014R413043)；溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20140652)

2015-06-23

2016-01-25

△Tel：0577-86689817;E-mail：wwt@wmu.edu.cn.

+:為共同第一作者

R363

A

1000-6834(2016)02-164-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.018