鐘孟如，劉忠民，萬德勝，李偉其，莫玉前 （廣東省東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞523059）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

東莞漢族人血清PCSK9水平與冠心病關(guān)系的研究

鐘孟如，劉忠民，萬德勝，李偉其，莫玉前 （廣東省東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞523059）

【摘 要】目的：探討廣東東莞地區(qū)漢族人前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9（PCSK9）的血清學(xué)水平及其與冠心病的相關(guān)性.

方法：選取廣東省東莞市人民醫(yī)院2014-06/2015-06經(jīng)冠脈造影確診的60例冠心病患者的血清標(biāo)本和60例非冠心病對(duì)照組的血清標(biāo)本，用ELISA測(cè)定血清PCSK9水平，用酶法測(cè)定血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的濃度水平.結(jié)果：冠心病組的血清PCSK9水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），冠心病組的CHOL、TG、LDL水平均高于非冠心病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PCSK9水平與TCH、TG、LDL?C的相關(guān)系數(shù)是0.458，0.460，0.429（P＜0.05）；冠心病組的女性PCSK9水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），冠心病組在＜60歲的年齡階段PCSK9水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.結(jié)論：PCSK9水平可作為預(yù)測(cè)冠心病的一個(gè)血清學(xué)指標(biāo)，且PCKS9水平與血脂水平、年齡、性別密切相關(guān).

【關(guān)鍵詞】PCSK9水平；冠心??；血脂水平；年齡；性別

0　引言

流行病學(xué)調(diào)查顯示，血脂水平異常是造成冠心?。╟oronary heart disease，CHD）死亡率及催患率增加的主要因素.前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型（proprotein convertase subti1isin/kexin type 9，PCSK9）基因是除LDLR和ApoB100之外，第三個(gè)與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關(guān)的基因. PCSK9 cDNA的大小為3617bp，編碼692個(gè)氨基酸組成的PCSK9蛋白，主要在肝臟、腸道表達(dá)，少量表達(dá)于腎臟、皮膚、腦中［1］.PCSK9通過結(jié)合于低密度脂蛋白受體（LDL receptor，LDLR）的表皮生長(zhǎng)因子（epiderma1 growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)域，與LDLR共同內(nèi)化，抑制LDLR的釋放與返回細(xì)胞膜，誘導(dǎo)LDLR進(jìn)入溶酶體內(nèi)降解，細(xì)胞表面LDLR數(shù)量的減少將導(dǎo)致血漿低密度脂蛋白膽固醇（1ow?density1ipoprotein cho1estero1，LDL?C）的水平升高［2］.PCSK9的突變基因于2003年首次被報(bào)道［3］，其突變分為功能獲得型和功能缺失型，功能獲得型突變可增強(qiáng)PCSK9上調(diào)LDL?C的能力［4］，功能缺失型則相反.本實(shí)驗(yàn)擬探討血清PCSK9水平與血脂水平、CHD之間的關(guān)聯(lián)性，為CHD的個(gè)性化治療、療效判斷等提供依據(jù).

1　資料和方法

1.1一般資料 選取廣東省東莞市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科2014-06/2015-06經(jīng)冠脈造影確診的60例CHD患者的血清標(biāo)本和60例非CHD對(duì)照組的血清標(biāo)本，CHD患者中男45例，女15例，年齡（65.13± 14.63）歲；非 CHD患者中男39例，女21例，年齡（49.03±16.91）歲.

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 廣東東莞漢族人，CHD患者有胸痛癥狀，心電圖ST?T改變，冠脈造影顯示左主干、左前降支、左回旋支及右冠狀動(dòng)脈中，至少有一支血管狹窄≥50%.健康人群經(jīng)詢問病史、體檢及心電圖、胸部X線射片等檢查，排除心血管疾病歷史，未發(fā)現(xiàn)血脂、肝功能異常，年齡、性別與CHD患者組相近.

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) 組內(nèi)及組間個(gè)體有血緣關(guān)系者；有糖尿病、肝腎疾病以及其他內(nèi)分泌異常疾病者；健康對(duì)照組檢查發(fā)現(xiàn)有心血管疾病者及其他不合適者.

1.4主要試劑與儀器 試劑：PCSK9 ELISA試劑盒（R&D Systems，Inc），EB（捷倍思），血脂試劑（貝克曼公司）.儀器：離心機(jī)（Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（Bio?TekELX800），微量可調(diào)移液器（Eppendorf公司）；貝克曼全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司）.

1.5方法

1.5.1冠狀動(dòng)脈造影及病變程度評(píng)估 采用Judkin's法，用6F左右造影管以Se1dinger技術(shù)穿刺右股動(dòng)脈途徑進(jìn)行造影.應(yīng)用Gensini積分法［5］對(duì)入選病例的冠脈造影結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：無狹窄，0分；狹窄≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分.不同的血管病變部位有對(duì)應(yīng)的系數(shù)：左主干，×5；前降支近段，回旋支近段，×2.5；前降支中段，×1.5；回旋支開口處，×3.5；前降支第一對(duì)角支、第二對(duì)角支、心尖部，回旋支的鈍緣支、遠(yuǎn)段，右冠狀動(dòng)脈近段、中段、遠(yuǎn)段，后降支，×1；左室后側(cè)支，×0.5.用血管狹窄程度評(píng)分乘以病變部位對(duì)應(yīng)的系數(shù)，每位患者的最終積分為各分支積分之和.

1.5.2標(biāo)本采集 采集CHD組與對(duì)照組的空腹外周靜脈血，3000 r/min離心10 min分離收集血清1000 μL于EP管，于-80℃保存.CHD組于入院第一次生化檢測(cè)當(dāng)天收集標(biāo)本，健康人群血液標(biāo)本于體檢當(dāng)天收集.

1.5.3生化指標(biāo)測(cè)定 收集樣本當(dāng)天完成肝腎功能、血脂等項(xiàng)目測(cè)定.血清總膽固醇（tota1 cho1estero1，TC）、血清甘油三酯（trig1yceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density 1ipoprotein cho1estero1，HDL?C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）均采用酶法檢測(cè).

1.5.4ELISA法檢測(cè)血清中PCSK9水平 Ca1ibrator Di1uent RD5P與去離子水1∶5配 Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液；Human PCSK9 standard干粉加2.0 mL 的Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液，配成40 ng/mL的Human PCSK9 standard標(biāo)準(zhǔn)液；加100 uL的Di1uent RD 1-9到每個(gè)反應(yīng)孔；標(biāo)準(zhǔn)液用Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液做倍比稀釋，得到濃度為0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、40 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液；血清標(biāo)本用Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液稀釋20倍；將50 μL 的Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液、各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液、血清標(biāo)本加到反應(yīng)孔，Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液、各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液每板各加樣兩孔，標(biāo)準(zhǔn)品濃度從低到高；室溫靜置避光2 h后用Wash buffer洗滌四次；加200 μL的Human PCSK9 Conjugate到每個(gè)孔；室溫避光靜置 2 h后，Wash buffer洗滌四次；將 Co1or reagents A與Co1or reagents B混合配制成 Substrate so1ution，15 min內(nèi)將200 μL的Substrate so1ution加到每個(gè)孔，避光孵育30 min；加50 μL的終止液 Stop so1ution，混勻后，30 min內(nèi)酶標(biāo)儀450 nm讀取數(shù)據(jù)，分別用兩板的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出血清標(biāo)本的濃度（圖1、2）.

圖1　第一板的血清PCSK9標(biāo)準(zhǔn)曲線1

圖2　第二板的血清PCSK9標(biāo)準(zhǔn)曲線2

1.5.5他汀藥物治療CHD前后PCSK水平比較 檢測(cè)他汀類藥物治療后3個(gè)月的CHD患者血脂水平，并與治療前的血脂水平進(jìn)行比較.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Pearson分析法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1兩組的PCSK9、血脂水平比較 CHD組的血清PCSK9水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CHD組的TCH、TG、LDL?C均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）.

表1　兩組的PCSK9水平、血脂水平比較（n=60，±s）

表1　兩組的PCSK9水平、血脂水平比較（n=60，±s）

aP＜0.05 vs對(duì)照組；bP＜0.01 vs對(duì)照組.

組別　PCSK9（ng/mL）　TCH（mmo1/L）　TG（mmo1/L）　HDL?C（mmo1/L）　LDL?C（mmo1/L）對(duì)照組　305.59±68.86　4.18±0.63　1.11±0.31　1.72±0.22　2.82±0.55 CHD組　359.96±102.28b　4.83±1.32a　1.45±0.61a　1.10±0.28　3.38±1.12a

2.2PCSK9水平與血脂水平相關(guān)性分析 對(duì)照組與CHD組的 120例標(biāo)本，PCSK9水平（424.88± 100.94 ng/mL）與 TCH（4.34±1.33 mmo1/L）、TG （1.24±0.54 mmo1/L）、LDL?C（2.99±1.05 mmo1/L）的相關(guān)系數(shù)分別是0.458、0.460、0.140、0.429，說明血清PCSK9水平與TCH、TG、LDL?C線性相關(guān)（表2）.

表2　PCSK9水平與血脂水平相關(guān)性分析

2.3CHD組的Gensini積分與PCSK9水平的相關(guān)性 將CHD患者根據(jù)Gensini積分分為三組，輕度組＜25分，中度組25～49分，重度組≥50分，僅輕度組的PCSK9水平與Gensini積分線性相關(guān)（r=0.647，P＜0.05，表3）.

表3　PCSK9水平與血脂水平相關(guān)性分析

2.4不同性別、年齡的PCSK血清學(xué)水平比較 統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)男性與女性在組內(nèi)比較，以及不同年齡階段的組內(nèi)比較，PCSK血清學(xué)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；男性與女性分別進(jìn)行組間比較，女性間有顯著差異［對(duì)照組（49.54±16.84）歲，CHD組（68.26± 11.85）歲，P＜0.05］；不同年齡段進(jìn)行組間比較，在＜60歲年齡段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）.

表4　不同性別、年齡間的PCSK血清學(xué)水平比較

3　討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱CHD，是一種多因素、多基因性疾病，具有遺傳易感性［6］，血脂水平異常是造成CHD死亡率及催患率增加的主要因素.血清中60%～70%的膽固醇通過低密度脂蛋白運(yùn)輸［7］，LDL?C主要通過肝細(xì)胞表面的LDLR清除，LDL?C增高是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)主要危險(xiǎn)因子.

他汀類藥物是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的降脂藥物，其機(jī)制為抑制肝臟膽固醇合成過程中的限速酶3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG?CoA還原酶）的活性.在高膽固醇血癥患者中，他汀類藥物應(yīng)用到最大允許劑量時(shí)可使LDL?C降低50%～60%［8］.但仍有約5%～10%的患者，盡管同時(shí)通過飲食和醫(yī)療，LDL?C仍在70 mg/dL的目標(biāo)以上，且他汀類藥物劑量加倍，LDL?C水平只能再降低6%.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的因素有多方面，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在使用西立伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀等處理人肝癌細(xì)胞HepG2及人原代肝細(xì)胞后，PCSK9呈濃度依賴性表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制考慮為L(zhǎng)DLR啟動(dòng)區(qū)及PCSK9啟動(dòng)區(qū)的SRE?1均能與低膽固醇激活的SREBP?2結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄機(jī)制使LDLR、PCSK9的數(shù)量均增加，因此影響了他汀藥類物降低LDL?C的作用.因此，當(dāng)使用他汀類藥物治療后，出現(xiàn)血清學(xué)PCKS9水平持續(xù)升高時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮更換患者降脂的首選藥，或他汀類藥物與其他降脂藥的聯(lián)合使用.他汀類藥物的副作用主要是肌痛和肝酶升高，美國(guó)國(guó)家脂質(zhì)協(xié)會(huì)的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約12%的患者會(huì)中止他汀治療，其中62%的患者是出于副作用的原因.因此，不能耐受他汀類藥物治療的患者可考慮使用無此副作用的PCKS9抑制劑［9］.賽諾菲Pra1uent及安進(jìn)的Repatha均將上市，有可能成為未來降脂藥物的熱點(diǎn).

PCSK9的基因突變分為功能獲得型和功能缺失型，功能獲得型突變導(dǎo)致嚴(yán)重的高膽固醇血癥和早發(fā)型CHD，增加心腦血管事件的發(fā)生率，功能缺失型則相反.研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9基因變異均存在種族與性別的差異［10-12］，故PCSK9血清學(xué)水平存在個(gè)體化差異，該差異的存在對(duì)CHD的診斷、治療及預(yù)后觀察具有一定的價(jià)值.

研究結(jié)果顯示，CHD組的血清PCSK9水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），提示PCSK9可作為預(yù)測(cè)CHD的一個(gè)血清學(xué)指標(biāo).同時(shí)，血清PCSK9水平與TCH、TG、LDL?C線性相關(guān)，當(dāng)血脂水平高時(shí)，提示進(jìn)行PCSK9水平檢測(cè)，可輔助CHD的診斷［13］.在Gensini積分的輕、中、重三組中，PCSK9均值水平雖然隨著Gensini積分的增加而上升，但僅與輕度組線性相關(guān)（P＜0.05），其機(jī)制尚未可知.CHD組的女性PCSK9水平顯著高于對(duì)照組，該現(xiàn)象考慮與女性的絕經(jīng)期有關(guān)［14］，現(xiàn)已證明體內(nèi)雌激素是重要的血管保護(hù)因子，可使女性的CHD較男性晚發(fā)生10年［15］，但Lakoski等［16］認(rèn)為雌激素水平與PCSK9在絕經(jīng)前的表達(dá)差異無關(guān)，而Persson等［17］的研究卻表明雌激素可以降低血漿中的PCSK9水平，因此雌激素是否影響PCSK9尚需進(jìn)一步研究.CHD組間的PCSK9血清學(xué)水平在＜60歲的年齡段顯著高于對(duì)照組，而≥60歲后無此現(xiàn)象，考慮到CHD是一種多因素、多基因性的疾病，高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙和肥胖以及一些不良的生活習(xí)慣［18］均是其主要致病因素，故該現(xiàn)象可能是PCSK9基因突變導(dǎo)致的CHD發(fā)病年齡較非遺傳因素早所致.

由于CHD組三個(gè)月內(nèi)因CHD復(fù)發(fā)入院的患者僅有2例，無法通過統(tǒng)計(jì)學(xué)比較PCSK9血清學(xué)水平對(duì)他汀類藥物藥物療效的影響，故需要延長(zhǎng)數(shù)據(jù)收集時(shí)間，得到較大容量的樣本后再進(jìn)行比較.

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【中圖分類號(hào)】R541.4

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

文章編號(hào)：2095?6894（2016）06?06?04

收稿日期：2016-05-07；接受日期：2016-05-21

基金項(xiàng)目：東莞市科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項(xiàng)目（2014105101170）

作者簡(jiǎn)介：鐘孟如.E?mai1：X024050@163.com

Study on the assosiation betWeen the level of serum PCSK9 and coronary heart disease of Han people in Dongguan

ZHONG Meng?Ru，LIU Zhong?Min，WAN De?Sheng，LI Wei?Qi，MO Yu?Qian
Laboratory Medicine，Peop1e's Hospita1 of Dongguan，Dongguan 523059，China

【Abstract】AIM：To investigate the assosiation between the 1eve1 of serum PCSK9 and coronary heart disease of Han peop1e in Dongguan.METHODS：The serum samp1es of 60 patients with CHD and 60 peop1e without CHD（the contro1 group）admitted into Peop1e's Hospita1 of Dongguan from June 2014 to June 2015 were se1ected as objects of study.The serum PCSK9 1eve1 was measured by ELISA.The 1eve1s of TC、TG、HDL?C and LDL?C were measured by enzyme chemistry method.RESULTS：The 1eve1 of PCSK9 in CHD patients was higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.01）. The 1eve1s of TCH，TG and LDL?C in CHD patients were higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）；The corre1ation coefficient of PCSK9 and 1ipid 1eve1s in CHD patients were 0.458，0.460，0.429 respective1y （P＜0.05）；The serum PCSK9 1eve1 of fema1e in CHD group was significant1y higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.The serum PCSK9 1eve1 of the patients，who were younger than 60 years o1d in CHD group was significant1y higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.CONCLUSION：The p1asma PCSK9 1eve1s can be used as a new serum marker of coronary heart disease，and the 1eve1 of PCSK9 is c1ose1y corre1ated with 1ipid 1eve1s，age and gender.

【KeyWords】p1asma PCSK9 1eve1s；coronary heart disease；1ipid 1eve1；age；gender.