徐晨婷　李海昌　謝志軍　溫成平（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 浙江 310053）

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基于TGF-β-MAPK信號(hào)通路探討狼瘡定對(duì)SLE的治療作用*

徐晨婷李海昌謝志軍溫成平△
（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 浙江 310053）

目的 觀察狼瘡定對(duì)MRL/lpr狼瘡模型鼠的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）-MAPK信號(hào)通路上的蛋白含量變化的影響。探討狼瘡定治療SLE的內(nèi)在機(jī)制，為治療SLE提供理論依據(jù)。方法 制備MRL/lpr狼瘡模型鼠，取小鼠脾臟組織，提取其淋巴細(xì)胞總蛋白，再對(duì)提取總蛋白行濃度測試，然后根據(jù)蛋白濃度上樣，進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，蛋白表達(dá)情況，進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果 Western blot法對(duì)小鼠各組脾臟淋巴細(xì)胞TGF-β2蛋白進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，正常組TGF-β2表達(dá)極少，而模型組表達(dá)明顯升高，而中藥組表達(dá)明顯下降。正常組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞JNK表達(dá)含量很少，而中藥組表達(dá)很高，但中藥組表達(dá)比模型組明顯下降。正常組Erk表達(dá)很高，狼瘡小鼠模型組表達(dá)下降，中藥組用藥后，Erk表達(dá)仍較少，與模型組區(qū)別度不明顯。結(jié)論 以TGF-β-MAPK信號(hào)通路為基礎(chǔ)，根據(jù)蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，狼瘡定影響MRL/lpr狼瘡模型鼠脾臟淋巴細(xì)胞總蛋白的表達(dá)，可能是狼瘡定治療SLE的機(jī)制。

TGF-β-MAPK信號(hào)通路MRL/lprWestern blot

【Abstract】Objective：To observe the effect of Langchuangding on the change of protein content in TGF-β-MAPK signaling pathway of a given MRL/lpr mouse with lupus，and investigate the inherent mechanism of treatment on SLE to provide a theoretical basis.Methods：MRL/LPR mice model with Lupus was fed and given medicine.Spleen tissues were taken and the lymphocyte of total protein was extracted，and then the extraction of total protein concentration was tested.According to the protein concentration of the sample，protein immunoblot experiments，protein expression were analyzed.Results：According to the protein immunoblot experiment，Langchuangding Decoction had a certain influence on protein expression of spleen lymphocytes in MRL/Lpr mice with lupus.Conclusion：On the basis of TGF-beta-MAPK signaling pathways，according to the protein immunoblot experiment，Langchuangding Decoction has a certain influence on protein expression of spleen lymphocytes in MRL/Lpr mice with lupus.Therefore，Langchuangding Decoction has an influence on MRL/Lpr mice with lupus，which suggests that Langchuangding Decoction has an effect on SLE.

【Key words】TGF-β-MAPK signaling pathway；MRL/lpr；Western blot

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是累及全身多個(gè)系統(tǒng)的自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)炎、腎炎、溶血性貧血、血小板減少及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等［1］。以年輕女性多見，臨床表現(xiàn)為面部蝶形紅斑，多臟器受累，疾病反復(fù)發(fā)作。它與其他自身免疫疾病一樣，免疫系統(tǒng)攻擊自身細(xì)胞和組織，對(duì)皮膚黏膜，關(guān)節(jié)，腎臟，心臟，腦，神經(jīng)等都有不同程度的損害［2］，對(duì)人類的危害極大。

SLE目前無法治愈，西醫(yī)沒有較好的治療方法，一般采用激素或免疫抑制劑治療，但其副作用大，如長期服用激素會(huì)造成高血壓、消化道潰瘍出血、內(nèi)分泌紊亂、骨質(zhì)疏松，免疫抑制劑會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制，肝功能損害［3-6］，同時(shí)治療效果也不突出。因此，研究人員開始研究中藥湯劑對(duì)SLE的治療影響。中醫(yī)認(rèn)為，SLE與肝腎陰虛、外感熱毒、內(nèi)生毒邪及血瘀內(nèi)阻的病機(jī)關(guān)系密切，范永升教授提出解毒祛瘀滋陰法是SLE的基本治法［7］，并提煉出基本方狼瘡定。中醫(yī)治療SLE，對(duì)患者副作用小，同時(shí)對(duì)西藥副作用具有調(diào)理作用。本實(shí)驗(yàn)觀察狼瘡定對(duì) MRL/lpr狼瘡鼠的轉(zhuǎn)化生長因子 β （TGF-β）-MAPK信號(hào)通路上的蛋白含量變化的影響，探討狼瘡定治療SLE的內(nèi)在機(jī)制，為治療SLE提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí)8周齡C57BL/6J雌性小鼠10只，體質(zhì)量（21.8±2.1）g，SPF級(jí)8周齡MRL/lpr雌性小鼠20只，體質(zhì)量（30.5±2.1）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-002。

1.2藥物青蒿12 g，炙鱉甲12 g，升麻9 g，白花蛇舌草15 g，積雪草15 g，干地黃15 g，赤芍12 g，炒薏苡仁15 g，佛手片9 g，生甘草6 g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)制成濃縮液，濃煎為80 mL（質(zhì)量濃度1.5 g生藥/mL）。

1.3主要儀器電熱恒溫水浴鍋 （型號(hào)：DK-S12，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；垂直板電泳裝置 （型號(hào)：R179，BIO-RAD American），轉(zhuǎn)膜裝置 （BIO-RAD American），電泳儀（型號(hào)：042BR08121，BIO-RAD American）；微量移液器（Eppendorf，Germany）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （型號(hào)：5407XKO26772，Eppendorf Germany）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DGG-9123，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)：720BR101492，BIO-RAD American）。

1.4主要試劑上樣緩沖液（4×）：2 mL Tris-HCl （0.5 M，pH 6.8），3.2 mL SDS，0.8 mL β-巰基乙醇，1.6 mL甘油，0.4mL溴酚藍(lán)。10%SDS：稱取10 g SDS，加ddH2O定容至100 mL。電泳緩沖液（10×）：30.25 g Tris+ 144.1 g甘氨酸+2 g SDS用 ddH2O定容至1000 mL 4℃保存。轉(zhuǎn)移緩沖液（1×）：先配轉(zhuǎn)移緩沖液（4×）：12 g Tris+57.6 g甘氨酸+4 g SDS，定容至800 mL，使用時(shí)取200 mL轉(zhuǎn)移緩沖液 （4×）+600 mL ddH2O+200 mL甲醇，定容至1000 mL。TBS（10×）：750 mL ddH2O，12.12 g Tris，88 g NaCl，調(diào)pH8.0，定容至1000 mL。TBST（1×）：50 mL TBS（10×）+0.5 mL Tween-20，ddH2O定容至500 mL。封閉液：5 g脫脂奶粉，溶于100 mL 1×TBST緩沖液，溶解后4℃保存。

1.5動(dòng)物分組及給藥正常組10只C57BL/6J小鼠；模型組10只MRL/lpr小鼠；中藥組10只MRL/lpr小鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始灌胃給藥。正常組和模型組：灌胃生理鹽水，每日1次；中藥組：灌胃狼瘡定濃縮液，灌胃量為每10 g體質(zhì)量1mL（給藥劑量為15 g生藥/kg，為臨床劑量的7.5倍），每日1次；連續(xù)飼養(yǎng)用藥8周后處死。

表1　96孔板試劑加樣量

1.6觀察指標(biāo)1）脾臟淋巴細(xì)胞總蛋白。取MRL/lpr狼瘡鼠脾臟，加入紅細(xì)胞裂解液，用玻璃勻漿器充分研磨，將研磨液于離心管中，10000～14000 g離心5 min，取上清，上清即為淋巴細(xì)胞總蛋白。2）總蛋白濃度檢測。（1）檢測步驟：取1.2 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配置液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)中，充分溶解后配置成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入980 μL稀釋液即可配置成0.5 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)樣品數(shù)量，按體積比50∶1取BCA試劑A、BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混合（BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定）。將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL；加適當(dāng)體積樣品，一般為1 μL，到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置20～30 min。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：見表1。上述試劑加完后，準(zhǔn)確吸取20 μL樣品溶液于96孔板中，加入BCA試劑200 μL，輕搖，于37℃保溫30～60 min，冷卻至室溫后，以空白為對(duì)照，在多功能酶標(biāo)儀上590 nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照，根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。3）蛋白免疫印跡法。（1）SDS-PAGE：檢漏；按表2、3配膠；樣品與樣品處理液（2×）1∶1混勻，于100℃沸水浴煮沸3～5 min，使蛋白質(zhì)變性，與SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物帶上大量負(fù)電荷，消除樣品電荷的影響；上樣量為15～20 μL，用微量進(jìn)樣器加樣；樣品在濃縮膠時(shí)為60 V，到達(dá)分離膠后調(diào)至80 V，當(dāng)條帶跑至分離膠底部1 cm處，停止電泳。（2）轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備：電泳結(jié)束前30 min，將海綿、濾紙12張、NC膜浸泡到轉(zhuǎn)移緩沖液中；將凝膠置于轉(zhuǎn)移緩沖液中漂洗，以洗去SDS，使蛋白變性。（3）轉(zhuǎn)膜（-）海綿+4層濾紙+凝膠+NC膜+4層濾紙+海綿（+）：凝膠與NC膜之間不留氣泡，NC膜一旦與凝膠接觸覆蓋，則不可移動(dòng)，NC膜靠正板；80 V，2 h，時(shí)間長短根據(jù)需轉(zhuǎn)移的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小而定，相對(duì)分子質(zhì)量大時(shí)間長，相對(duì)分子質(zhì)量小時(shí)間短，在轉(zhuǎn)移的過程中，將電泳槽置于冰水中。（4）封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，使NC膜上多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)完全與之結(jié)合。（5）免疫檢測：一抗孵育：加入一抗溶液，置于4℃冰柜搖床上，溫和振蕩過夜；TBST漂洗5 min，重復(fù)3次；二抗反應(yīng)：將二抗稀釋2000倍后與膜室溫下溫和避光振蕩2 h；TBST漂洗5 min，重復(fù)3次；用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜檢測。

表2　配膠方法

2　結(jié)　果

2.1狼瘡定用藥后對(duì)狼瘡模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞TGF-β2的表達(dá)情況見圖1。Western blot法對(duì)各組的淋巴細(xì)胞TGF-β2蛋白進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示，正常組TGF-β2表達(dá)極少，而模型組表達(dá)明顯升高，而中藥組表達(dá)明顯下降。

圖1　小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總蛋白TGF-β2及其β-actin免疫印跡圖

2.2狼瘡定用藥后對(duì)狼瘡模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞JNK的表達(dá)情況見圖2。Western blot方法對(duì)各組的淋巴細(xì)胞JNK蛋白進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示，正常組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞JNK表達(dá)含量很少，而中藥組表達(dá)很高，但中藥組表達(dá)比模型組明顯下降。

圖2　小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總蛋白JNK及其β-actin免疫印跡圖

2.3狼瘡定用藥后對(duì)狼瘡模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Erk的表達(dá)情況見圖3。Western blot方法對(duì)各組的淋巴細(xì)胞Erk蛋白進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示，正常組Erk表達(dá)很高，狼瘡小鼠模型組表達(dá)下降，中藥組用藥后，Erk表達(dá)仍較少，與模型組區(qū)別度不明顯。

3　討　論

SLE是累及全身多個(gè)系統(tǒng)，以年輕女性多見，臨床表現(xiàn)為面部蝶形紅斑，多臟器受累，疾病反復(fù)發(fā)作，對(duì)皮膚黏膜、關(guān)節(jié)、腎臟、心臟、腦、神經(jīng)等都有不同程度損害，對(duì)人類危害極大。SLE目前尚無法治愈，西醫(yī)治療一般采用激素或免疫抑制劑治療，但其副作用大，同時(shí)治療效果也不突出。因此，研究人員開始研究中藥湯劑對(duì)SLE的治療影響。中醫(yī)認(rèn)為，SLE與肝腎陰虛、外感熱毒、內(nèi)生毒邪及血瘀內(nèi)阻的病機(jī)關(guān)系密切，范永升教授提出解毒祛瘀滋陰法是SLE的基本治法［7］，并提煉出基本方狼瘡定。

圖3　小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總蛋白Erk及其β-actin免疫印跡圖

TGF-β是由2個(gè)結(jié)構(gòu)相同或相似的亞單位借二硫鍵連接的雙體。TGF-β廣泛存在于各種細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、生長的功能。TGF-β能夠激活Smads的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路的活化引起細(xì)胞生長抑制，誘導(dǎo)其凋亡［8］。同時(shí)TGF-β活化了多條絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路［9］。MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大部分細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞及核內(nèi)，并引發(fā)細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等，在這個(gè)過程中，具有至關(guān)重要的作用。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3條并行的MAPKs信號(hào)通路：ERK信號(hào)通路，JNK/SAPK通路，p38/MAPK通路［10］。在多種細(xì)胞型中，TGF-β均可使ERK、JNK活化。研究證明，TGF-β可通過MAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上所述，TGF-β激活的MAPK級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞凋亡中具有重要作用。SLE患者的TGF-β-MAPK信號(hào)通路相當(dāng)活躍，介導(dǎo)了大量自身細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞來不及被清除，會(huì)作為自身抗原，引起自身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊自身組織和器官，包括了腎臟損害，這也是SLE致死的主要原因。

狼瘡定全方以青蒿透邪外出、炙鱉甲補(bǔ)陰益腎入絡(luò)搜邪為君，干地黃清熱涼血益陰，白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑，赤芍、積雪草活血散血俱為臣，炒薏苡仁、佛手片健脾理氣化濕為佐，生甘草解毒并調(diào)和諸藥為佐使。諸藥合用，共奏清熱解毒，活血化瘀，益腎養(yǎng)陰之功，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。其中，青蒿中青蒿素及雙氫青蒿素具有明顯的免疫抑制作用，能抑制BXSB狼瘡樣小鼠血清ds-DNA抗體的生成，對(duì)BXSM小鼠LN有明顯的改善作用［11-13］。實(shí)驗(yàn)研究表明狼瘡定能夠減少細(xì)胞凋亡，減輕自身免疫應(yīng)答。

免疫檢測中，一抗作用是特異結(jié)合底物，二抗作用是可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標(biāo)記，作用是檢測一抗。當(dāng)一抗結(jié)合到底物上，就可以通過二抗檢測出來。Western blot結(jié)果圖中雜帶很多可能是一抗的濃度太高對(duì)雜帶有影響，也可能是封閉不好，有非特異結(jié)合。另外上樣量也對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，所以筆者比較了50 μg和100 μg上樣量，用一抗actin孵育，結(jié)果顯示，100 μg上樣量結(jié)果更清晰明亮，所以筆者選擇了100 μg的上樣量，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響。

本研究正常組為正常小鼠，模型組為狼瘡患病小鼠，中藥組為狼瘡定用藥患病小鼠。若中藥組結(jié)果趨于正常組，與模型組有一定的區(qū)別，說明狼瘡定影響此通路，具有治療作用；反之，則說明狼瘡定對(duì)該通路無明顯影響，無明顯治療作用。TGF-β2和JNK的電泳圖顯示中藥組條帶比較淺，明顯區(qū)別于模型組，趨向于正常組，說明狼瘡定影響TGF-β-MAPK信號(hào)通路中的蛋白TGF-β2和JNK的分泌，使其含量趨于正常值。本實(shí)驗(yàn)用Western blot法來研究狼瘡定對(duì)在TGF-β-MAPK信號(hào)通路上的各個(gè)蛋白，主要為TGF-β2、JNK、Erk表達(dá)情況的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示狼瘡定對(duì)某些關(guān)鍵蛋白有顯著影響，如：TGF-β2和JNK。在哺乳動(dòng)物中，TGF-β激活的MAPK級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有3條，其中包括了JNK/SAPK通路和ERK信號(hào)通路。綜上所述，狼瘡定影響JNK/SAPK信號(hào)通路上蛋白表達(dá)，即狼瘡定通過影響TGF-β2表達(dá)，減少細(xì)胞大量凋亡。另外，通過減少JNK表達(dá)，影響JNK/SAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)來控制炎癥因子的產(chǎn)生，也正因?yàn)槿绱?，SLE患者病情得到控制。因此，狼瘡定是通過影響TGF-β-MAPK信號(hào)通路，對(duì)SLE有一定的治療作用。本實(shí)驗(yàn)用狼瘡定對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)［14-15］，檢測TGF-β-MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況，探討狼瘡定對(duì)SLE小鼠的內(nèi)在治療機(jī)制，從而為狼瘡定治療SLE提供了理論依據(jù)。

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Discussion on the Therapeutic Effect of Langchuangding Decoction on SLE Based on TGF-beta-MAPK Signaling Pathway

XU Chenting，LI Haichang，XIE Zhijun，et al.College of Basic Medicine，Zhejiang University of Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China.

R593.24+1

A

1004-745X（2016）05-0769-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.006

國家自然科學(xué)基金課題（81173249）；2015年度中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（201507001-4）
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（電子郵箱：wengcp@163.com）

2015-12-11）