朱國棟　王勤章

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豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞鈣震蕩特性*

朱國棟①王勤章②

目的：探討正常成年豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞（Cajal-like interstitial cells）是否有自發(fā)周期性鈣震蕩（calcium oscillation），以期為膀胱興奮性起搏細胞為Cajal樣間質(zhì)細胞這一學說提供實驗依據(jù)。方法：運用膠原酶V消化法，獲得原代豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞進行培養(yǎng)，采用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，F(xiàn)luo-4AM負載后的Cajal樣間質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子熒光強度的變化采用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)進行記錄，熒光強度的改變代表細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果：培養(yǎng)后的Cajal樣間質(zhì)細胞保持其固有特征，可見胞體為梭形且胞體兩極有兩個細長突起；培養(yǎng)的Cajal樣間質(zhì)細胞有兩類不同的鈣震蕩：一類震幅小而頻率不規(guī)則，另一類震幅大而頻率慢。第二類鈣震蕩與膀胱逼尿肌細胞的鈣震蕩顯著不同。結(jié)論：與消化道起搏細胞Cajal間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）自發(fā)性鈣震蕩類似，成年豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞亦存在自發(fā)鈣震蕩，提示膀胱收縮活動的起搏細胞可能為其中一種類型的膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞。

鈣震蕩；Cajal樣間質(zhì)細胞；膀胱；起搏細胞；激光共聚焦顯微鏡

First-author’s address：Yankuang Group General Hospital，Zoucheng 273500，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.18.001

文獻[1-2]研究證明消化道慢波活動的傳導者和起搏細胞為ICCs，并參與調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉信號傳遞。膀胱興奮性的理論研究主要有兩大學說：肌源性和神經(jīng)源性。Smet等[3]首先描述了在人膀胱和豚鼠膀胱中存在形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫熒光特性與ICCs類似的間質(zhì)細胞，被稱為膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）。由于膀胱Cajal間質(zhì)細胞的發(fā)現(xiàn)使肌源性學說受到更加重視[4-5]。越來越多的研究表明，逼尿肌以及神經(jīng)與Cajal樣間質(zhì)細胞關(guān)系密切，其在電化學信號擴散、神經(jīng)信號傳遞中揮重要作用。膀胱興奮異常很大程度與膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞興奮性有關(guān)[6-8]。臨床上常見的膀胱功能障礙，如膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB）、糖尿病性膀胱、神經(jīng)源性膀胱等的共同發(fā)病機制之一是膀胱逼尿肌興奮性異常[9-11]。由此推測膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞是膀胱收縮活動的起搏細胞，可能就是控制膀胱興奮性的中心環(huán)節(jié)。膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞的功能學研究尚處于探索階段，未見其為起搏細胞的報到。本研究運用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)成像技術(shù)記錄膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞和膀胱逼尿肌細胞鈣離子濃度變化，探討膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞的鈣震蕩特性及相關(guān)生理功能，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物豚鼠10只，1~2 個月齡，雌雄不限。

1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、重組干細胞因子、pluronic F-127、V型膠原酶購自Sigma公司，F(xiàn)BS （Gibco公司），fluo-4AM（Molecular Probes，美國），二甲基亞砜（DMSO，上海生工）。

1.3主要儀器與設(shè)備SW-CJ-2FD超凈工作臺，S/N27709-1462 CO2培養(yǎng)箱，激光共聚焦顯微鏡META.510 Zeiss（德國蔡司公司）。

1.4方法

1.4.1原代細胞培養(yǎng)頸部脫臼法處死豚鼠，75%酒精浸泡10 min，無菌條件下離斷膀胱頸取出膀胱。自膀胱頸部向底部縱行剖開并去除膀胱黏膜，解剖顯微鏡下去除漿膜層，在磷酸鹽緩沖溶液中加雙抗（鏈霉素100 mg/L和青霉素100 U/L）浸泡膀胱肌層10 min。將膀胱肌層剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織小塊，以磷酸鹽緩沖溶液漂洗2次，加入膠原酶Ⅴ溶液（10 g/L），37 ℃培養(yǎng)箱中消化，30 min后見組織塊成絮狀，離心管中離心。新鮮配制的DMEM 培養(yǎng)基溶液（含體積分數(shù)為0.2的胎牛血清）加入沉淀的細胞中，吹打均勻后以1×105/mL的密度接種于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，按照50 ng/mL加入重組SCF，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。24 h后觀察接種細胞，可見膀胱逼尿肌細胞尚未貼壁，有兩個突起的胞體為梭形的細胞貼壁。細胞換液將未貼壁的逼尿肌細胞移至另一培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3 d后見逼尿肌細胞貼壁。

1.4.2熒光標記將用DMSO溶解fluo-4AM，配制成濃度為1 mmol/L的母液，-20 ℃保存。在實驗當天以培養(yǎng)基溶液稀釋母液至終濃度為4 μmol/L，配制成工作液。取出原代細胞培養(yǎng)皿并移除培養(yǎng)基，PBS液沖洗2次，加入熒光染料Fluo-4 AM（4 μmol/L）1.5 mL，同時加入20%（w/v）的pluronic F-127促進fluo-4AM進入細胞內(nèi)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40 min，為使細胞溫度與室溫同，恢復細胞穩(wěn)定性，孵育后室溫下靜放10 min。

1.4.3膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞及膀胱逼尿肌細胞鈣震蕩測定在激光共聚焦顯微鏡下每個培養(yǎng)皿隨機選10個細胞作為測定對象，以熒光強度變化代表鈣離子濃度變化，以200 ms/張圖片速度進行掃描，獲得連續(xù)鈣離子濃度的動態(tài)變化。

1.4.4實驗結(jié)束后期分析處理選定細胞圖像，使用META自帶分析軟件進行處理，展示每個時間點的靜態(tài)圖片并得到每一時間點的鈣離子熒光強度值，并轉(zhuǎn)為相應(yīng)數(shù)據(jù)。對每一時間點的熒光強度值進行統(tǒng)計學的分析處理進行定量分析。細胞內(nèi)鈣離子熒光強度的連續(xù)變化以動畫形式加以顯示。

1.4.5鈣離子震蕩曲線由SPSS 16.0軟件繪制并分析，熒光強度數(shù)據(jù)用（±s）表示。

2　結(jié)果

2.1體外培養(yǎng)的豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞形態(tài)學觀察細胞接種于培養(yǎng)皿第2天，倒置顯微鏡下可見胞體為梭形兩極有兩個突起的貼壁細胞。根據(jù)其免疫熒光特性和形態(tài)證實該類細胞為Cajal樣間質(zhì)細胞。2 d逼尿肌細胞未能貼壁，貼壁能力差，將其轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿，3 d后貼壁，倒置顯微鏡下細胞突起不明顯，呈不規(guī)則形。相同放大倍數(shù)下Cajal樣間質(zhì)細胞明細小于逼尿肌細胞。

2.2運用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)掃描成像技術(shù)觀察膀胱逼尿肌細胞及Cajal樣間質(zhì)細胞鈣震蕩根據(jù)熒光強度的變化見體外膀胱逼尿肌細胞鈣震蕩不規(guī)則，震幅?。?0.61±0.20），顯著低于Cajal樣間質(zhì)細胞第二類鈣震蕩震幅（P<0.05）（圖1）。培養(yǎng)的原代膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞鈣震蕩有2種類型：一類頻率快，震幅小（49.69±0.28）且不規(guī)則（圖2），第二類頻率慢（約為3次/min），震幅大（67.56±0.72）而規(guī)則的鈣震蕩（圖3）。鈣離子是胞漿重要成分，是細胞內(nèi)信號傳遞重要成分Fluo-4 AM染色動態(tài)觀察顯示，鈣震蕩起源于胞體，向突足擴布（圖4）。

圖1　膀胱逼尿肌細胞

圖2　膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞震幅小而不規(guī)則鈣震蕩

圖3　膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞震幅大而規(guī)則鈣震蕩

圖4　膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞鈣震蕩動態(tài)觀察視覺圖

3　討論

ICCs是一類特殊的細胞，分布在消化道平滑肌細胞和自主神經(jīng)末梢之間，與腸運動平滑肌細胞和神經(jīng)末梢組成一個基本功能單位。ICCs在消化道內(nèi)有四類不同的分布位置，近年的研究表明，引起胃腸平滑肌自動節(jié)律性運動的起搏細胞是位于縱行肌和環(huán)行肌之間的ICCs[12-13]，肌間ICCs可以參與神經(jīng)一肌肉信息傳遞過程并把信息傳給相鄰的肌細胞[14]。膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞形態(tài)及免疫組化特性與消化道的ICCs相同，在膀胱的分布與ICCs在消化道中分布相似[15]。膀胱逼尿肌在充盈張力牽拉下才會出現(xiàn)自發(fā)的興奮、收縮，這和胃腸道平滑肌主動自發(fā)興奮不同，膀胱充盈時黏膜上皮在張力牽拉刺激下釋放ATP等物質(zhì)，誘發(fā)膀胱逼尿肌自發(fā)的興奮、收縮，因而認為膀胱黏膜下Cajal樣間質(zhì)細胞同時具有起搏和感受器的作用[16-17]。這些提示Cajal樣間質(zhì)細胞可具有膀胱收縮起搏細胞的功能。鈣離子是機體中最普遍、最重要的第二信使之一，參與包括細胞分裂、代謝、凝血和受精以及突觸傳遞、激素分泌、肌肉收縮、基因轉(zhuǎn)錄等多種生理過程[18]；鈣離子內(nèi)流使慢反應(yīng)細胞具有四相舒張期自動除極的特征[19]。

研究證實，鈣離子震蕩是ICCs慢波功能為基礎(chǔ)[20]，因而研究膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞是否具有鈣震蕩及震蕩特征對于了解其生理功能有極其重要的意義。鈣離子熒光劑是Fluo-4AM，通過培養(yǎng)，能夠輕易進入細胞內(nèi)。本研究在激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀察記錄膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞鈣離子濃度的變化，發(fā)現(xiàn)膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞存在兩種鈣震蕩類型，提示鈣震蕩不規(guī)則而震幅小的細胞可能是起到傳導、耦合信息的作用。膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞鈣震蕩規(guī)則而蕩幅度大的可能是膀胱逼尿肌收縮活動的起搏細胞。與ICCs在胃腸道的作用相符合，不同分布位置的細胞具有不同的功能，這可能與膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞在膀胱的分布有關(guān)[7-8]。本實驗結(jié)果將充實膀胱運動調(diào)控的機制，為以Cajal樣間質(zhì)細胞作為潛在靶點治療膀胱相關(guān)疾病的深入研究提供理論依據(jù)。

[1] Sanders K M，Koh S D，Ward S M.Interstitial cells of cajal as pacemakers in the gastrointestinal tract[J].Annu Rev Physiol，2006（68）：307-343.

[2] Gfroerer S，Rolle U.Interstitial cells of Cajal in the normal human gut and in hirschsprung disease[J].Pediatr Surg Int，2013，29 （9）：889-897.

[3] Smet P J，Jonavicius J，Marshall V R.Distribution of nitric oxide synthase immunoreactive nerves and identification of the cellular targets of nitric oxide in guinea-pig and human urinary bladder by cGMP immunohistochemistry[J].Neuroscience，1996，71（2）：337-348.

[4] Brading A F，Brain K L.Ion channel modulators and urinary tract function[J].Handb Exp Pharmacol，2011（202）：375-393.

[5] Torres Y P，Granados S T，Latorre R.Pharmacological consequences of the coexpression of BK channel alpha and auxiliary beta subunits[J].Front Physiol，2014，5：383.

[6] Wang Y，F(xiàn)ang Q，Lu Y，et al.Effects of mechanical stretch on interstitial cells of Cajal in guinea pig bladder[J].J Surg Res，2010，164（1）：e213-219.

[7] Schwentner C，Oswald J，Lunacek A，et al.Loss of interatitial cells of Cajal and gap junction protein connexin 43 at the vesicoureteral junction in children with vesicoureteral reflux[J].J Urol，2005，174（5）：1981-1986.

[8] Rothberg B S.The BK channel：a vital link between cellular calcium and electrical signaling[J].Protein Cell，2012，3（12）：883-892.

[9] Bragg R，Hebel D，Vouri S M，et al.Mirabegron：a Beta-3 agonist for overactive bladder[J].Consult Pharm，2014，29（12）：823-837.

[10] Arrellano-Valdez F，Urrutia-Osorio M，Arroyo C，et al.A comprehensive review of urologic complications in patients with diabetes [J].Springerplus，2014，3（1）：549.

[11] Petkov G V.Central role of the BK channel in urinary bladder smooth muscle physiology and pathophysiology[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2014，307（6）：R571-R584.

[12] Edwards F R，Hirst G D.An electrical description of the generation of slow waves in the antrum of the guinea-pig[J].J Physiol，2005，564（Pt1）：213-232.

[13] Kito Y，Ward S M，Sanders K M.Pacemaker potentials generated by interstitial cells of Cajal in the murine intestine[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C710-20.

[14] Iino S，Horiguchi K.Interstitial cells of cajal are involved in neurotransmission in the gastrointestinal tract[J].Acta Histochem Cytochem，2006，39（6）：145-153.

[15] Davidson R A，McCloskey K D.Morphology and localization interstitial cells in the guinea pig bladder：Structural relationships with smooth mnscle and neurous[J].J Urol，2005，173（4）：1385-1390.

[16] Biers S M，Reynard J M，Doore T，et al.The functional effects of a c-kit tyrosine inhibitor on guinea-pig and human detrusor[J]. BJU Int，2005，97（3）：612-616.

[17] Kubota Y，Kojima Y，Shibata Y，et al.Role of KIT- positive interstitial cells of Cajal in the urinary bladder and possible therapeutic target for overactive bladder[J].Adv Urol，2011，2011（1687-6369）：816 342.

[18] Ganong W F.Review of medical physiology[M].New York：McGraw-Hill，2001：369-382.

[19]唐尚杰，郭濤，杜云惠.食管內(nèi)心臟電生理檢查[M].昆明：云南科技出版社，2005：3-4.

[20] Nakayama S，Ohya S，Liu H N，et al.Sulphonylurea receptors differently modulate ICC pacemaker Ca2+activity and smooth muscle contractility[J].J Cell Sci，2005，118（Pt 18）：4163-4173.

Calcium Oscillation Characteristics of Interstitial Cells of Cajal in Guinea Pig Bladder

ZHU Guodong，WANG Qin-zhang.//Medical Innovation of China，2016，13（18）：001-004

Objective：To ascertain the spontaneous and cyclical calcium oscillation in Cajal-like interstitial cells of Cajal in the bladder of adult guinea-pig.Method：The V-type enzyme collagenase was used to separate primary cells from myoblast of the preparation muscle tissue，primary cells were cultured.Using fluo-4 AM dye the Cells.The change of calcium fluorescence intensity was recorded with laser scanning microscope imaging. The changes of the intracellular calcium concentration was on behalf with the Fluorescence intensity.Result：The Cajal-like interstitial cells maintained its inherent characteristics by primary cultivation.We could see that the cell had a spindle cell body with two slender bipolars.In the Cajal-like interstitial cells of bladder：there were 2 different types of spontaneous calcium，small irregular calcium oscillation and large oscillation slow calcium oscillation.The second type of calcium oscillation was completely different from those of smooth muscle cells.Conclusion：We have confirmed the existence of the spontaneous calcium oscillation in the Cajal-like interstitial cells in the bladder of adult guinea-pig，that like the pacemaker cells of interstitial cells of Cajal in the digestive tract.Implying that part of the Cajal-like interstitial cells may be the pacemaker cells of contraction or activity of bladder.

Calcium oscillation；Cajal-like cells；Bladder；Pacemaker cell；Laser scanning confocal microscopy

國家自然科學基金（30860281）

①兗礦集團有限公司總醫(yī)院山東鄒城273500

②石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

朱國棟

（2016-03-11）（本文編輯：程旭然）