鄭鐵鑫，張影，邢育鋼，柴華，尹堯（哈藥集團生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產工藝關鍵技術研究

鄭鐵鑫，張影，邢育鋼，柴華，尹堯
（哈藥集團生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產過程中，存在培養(yǎng)菌數低，凍干死亡率高等問題，影響產品的產量。本文針對仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產工藝關鍵技術進行研究，通過篩選接種量、培養(yǎng)基配方與通氣量的參數關系；優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝，采用自動添加40%葡萄糖補充碳源并作為調節(jié)pH值的手段；使用分光光度法與凍干工藝結合作為收獲標準，從而達到提高培養(yǎng)菌數，降低凍干死亡率。本研究為生產高效、安全、穩(wěn)定的仔豬副傷寒活疫苗產品提供有力地技術支持。

仔豬副傷寒活疫苗；生產工藝；菌數

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.003

仔豬副傷寒活疫苗由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的房曉文等選用抗原性良好的豬霍亂沙門氏菌強毒株在含有醋酸鉈的普通肉湯中傳代培養(yǎng)，經傳數百代后，篩選出一株毒力弱而免疫原性良好的弱毒菌株，命名為豬霍亂沙門氏桿菌C500弱毒株，于1965年開始試用，1976年被批準列入獸醫(yī)生物制品規(guī)程，已在全國許多生物制品廠生產，用C500弱毒菌株制成仔豬副傷寒活疫苗，經田間試驗和區(qū)域試驗證明疫苗安全有效，該疫苗在我國大范圍推廣使用，使我國仔豬副傷寒得到了有效控制，取得了可觀的經濟效益和社會效益［1］。

我公司生產的仔豬副傷寒活疫苗從固體培養(yǎng)，到現在的微生物發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，生產量不斷增大，生產工藝趨于穩(wěn)定，現在隨著技術的提高，我公司經過不斷創(chuàng)新，通過對培養(yǎng)基配方以及相應培養(yǎng)條件的優(yōu)化改進，使產品由原來的平均27頭份/瓶增加到43頭份/瓶。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1生產用種子豬霍亂沙門氏菌弱毒株C500，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2效檢攻毒菌株豬霍亂沙門氏菌C78-2強毒株，由中國獸藥監(jiān)察所提供。

1.1.3培養(yǎng)基普通瓊脂、普通肉湯、40%葡萄糖溶液、酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P），均由本公司培養(yǎng)基班組提供。

1.1.4實驗動物大耳白家兔，由本公司動物實驗室提供。

1.2設備

1.1.1上海高機生物工程公司 BIOF-6200B微生物發(fā)酵罐。

1.2.2日本島津UV-2550分光光度計。

1.2.3上海彼愛姆光學儀器制造有限公司顯微鏡。

1.3方法

1.3.1生產用種子的制備按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（以下簡稱《規(guī)程》）的標準規(guī)定的方法和要求進行一級種子繁殖、鑒定和二級種子繁殖，二級種子平均菌數為19×108CFU/mL［2］，二級種子按培養(yǎng)量1%、2%、3%準備，檢驗純粹后備用。

1.3.2普通肉湯按《規(guī)程》方法制造，pH值為7.6左右，121℃蒸汽滅菌40 min。

1.3.3半合成培養(yǎng)基將蛋白胨、牛肉膏、NaCl等按不同比例設計成3種配方，用蒸餾水溶解，用8%的NaOH溶液調整pH值為7.6左右，分裝，121℃蒸汽滅菌40 min。

1.3.4培養(yǎng)接種后開始以100 r/min進行培養(yǎng)，過程中采用分段攪拌方式，自動調節(jié)由100 r/min增加至200 r/min；培養(yǎng)過程中通過采用自動添加40%葡萄糖進行調節(jié)pH值的方法，控制培養(yǎng)環(huán)境酸堿度在pH7.4左右，使整個培養(yǎng)過程達到自動化精準控制。

1.3.5培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選將種子液（A變量因素）按培養(yǎng)基量的1%、2%、3%接種至對應3種半合成培養(yǎng)基（C變量因素）中，37.5℃，通氣量（B變量因素）采用固定12 m3/h；固定20 m3/h；從12 m3/h逐漸加到20 m3/h三種方式。

1.3.6培養(yǎng)終點的選擇從1.3.5項計數結果中選擇合適的一組，其它培養(yǎng)條件不變，分別對設定收獲時間進行取樣，利用分光光度法檢測樣品在600 nm處的吸收值，并對樣品進行菌數測定，針對各個樣品進行分裝凍干，檢測凍干后菌數情況。

1.3.7發(fā)酵罐批次生產驗證從1.3.5項計數結果選擇合適的一組搭配，從1.3.6項選擇合適的培養(yǎng)時間，培養(yǎng)溫度37.5℃，攪拌速度100～200 r/min，罐壓0.05 MPa，進行發(fā)酵罐大量生產試驗。分別于培養(yǎng)結束和冷凍真空干燥后取樣計數，計算凍干存活率［3］，并按《規(guī)程》方法進行安全性檢驗。

2　結果

2.1培養(yǎng)的優(yōu)化改進

2.1.1通過L9（33）正交試驗A1B1C1400億/mL、A1B2C2395億 /mL、A1B3C3360億 /mL、A2B1C2380億 /mL、A2B2C3380億/mL、A2B3C1410億/mL、A3B1C3385億/mL、A3B2C1445億/mL、A3B3C2375億/mL，極差分析結果可以看出，三個參數效果是RC＞RA＞RB，同時也可以看出A3B2C1達到445億/mL為較優(yōu)組合（見表1）。

表1　選用L9（33）正交試驗表前三項進行現場實驗，計算培養(yǎng)菌數

2.1.2通過分光光度法檢測培養(yǎng)18 h樣品的吸收值趨于最高，18～21 h期間吸收值只有小幅增長；培養(yǎng)至19 h，培養(yǎng)菌數最高，而培養(yǎng)18 h的凍干死亡率最低，綜合考慮凍干前菌數，凍干后菌數，凍干死亡率以及分光光度法值幾項參數，培養(yǎng)至18 h為最佳培養(yǎng)時間（見表2）。

表2　各時間點的吸收值（600nm）、凍干前菌數（108CFU/mL）、凍干后菌數（108CFU/mL）

2.2發(fā)酵罐應用試驗結果

根據極差分析法與分光光度法，優(yōu)化結果進行發(fā)酵罐應用試驗，三個批次試驗結果表明，采用改進后方法仔豬副傷寒活疫苗培養(yǎng)菌數平均達到543×108CFU·mL-1，凍干存活率可達到74%（見表3），與以往生產結果相比培養(yǎng)菌數增高，凍干存活率較穩(wěn)定，安全性好［3］。

表3　改進前后發(fā)酵罐培養(yǎng)結果比較

3　小結與討論

1）根據試驗結果，綜合考慮凍前培養(yǎng)菌數和凍干存活率兩項因素，在采用發(fā)酵罐進行培養(yǎng)的條件下，確定了仔豬副傷寒活疫苗生產工藝中的一些關鍵性技術參數。

2）參數自動化設定調節(jié)方式，降低批間次差異，使工藝更加穩(wěn)定。

3）采用極差分析方法，更加科學的選擇試驗參數方案；引入分光光度法，對培養(yǎng)終點的選擇提供理論數據。

4）分光光度法在試驗中的成功引入，對此種方法的科學性提供理論基礎，將此種方法應用于其它產品的試驗中提供科學依據。■（編輯：趙曉松）

［1］楊紅云，伊鴻，康興，等.仔豬副傷寒C500活疫苗純粹檢驗中可疑菌落的鑒定［J］.中國獸藥雜志，1999，33（1）：30-32.

［2］楊紅云，康興，張小萍，等.仔豬副傷寒活疫苗生產工藝的改進［J］.中國獸藥雜志，2002，36（6）：49～50.

［3］中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇一〇年版［S］.

Study on Key Technologies of the Production Process for Piglet Paratyphoid Live Vaccine（C500 Strain）

Zheng Tiexin，Zhang Ying，Xing Yugang，Chai Hua，Yin Yao
（Harbin Pharmaceutical Group Bio-vaccine Co.，Ltd，Harbin Heilongjiang，150069）

Low cultured bacterial and lyophilized high mortality and other problems exist in the piglet paratyphoid live vaccine（C500 strain）production process，affecting the yield of the product.In this paper，the key technologies of manufacturing process for piglet paratyphoid live vaccine（C500 strain）were studied to solve these problems by screening parameters related to inoculation amount and media formulations and ventilation volume，optimizing the fermentation process，adding 40%glucose automatically as carbon source and a means of adjusting the pH value and combining spectrophotometric method and freeze-drying process as the product harvest standards.This study provides strong technical support to produce highly efficient，safe and stable piglet paratyphoid live vaccine products.

piglet paratyphoid live vaccine，manufacturing process，bacterial count

鄭鐵鑫（1982-），男，籍貫山東，理學學士，獸醫(yī)師，從事獸用生物制品生產。