張海燕（三河市畜牧水產(chǎn)局河北三河065200）

學(xué)術(shù)研究

甘草添加劑對(duì)綿羊支氣管黏膜中杯狀細(xì)胞數(shù)量及IgA分泌量的影響

張海燕
（三河市畜牧水產(chǎn)局河北三河065200）

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究甘草的主要藥理作用，對(duì)其藥用價(jià)值和發(fā)揮藥效的主要成分進(jìn)行進(jìn)一步研究，研究甘草添加劑對(duì)綿羊呼吸道系統(tǒng)免疫功能的影響。

甘草添加劑；支氣管黏膜；杯狀細(xì)胞；IgA

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.043

1　試驗(yàn)方法

1.1甘草粉的制備

稱(chēng)取150 g的甘草粉，置于燒杯中，第1次加1 000 mL蒸餾水浸泡1 h后煎煮，加熱至沸后文火維持30 min，用4層紗布過(guò)濾，濾出煎液，濾渣用500 mL水量再煎煮2次，合并3次濾液，濃縮至500 mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒁陨细魅芤簻y(cè)定前分別用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，留濾液備用，用液相色譜法測(cè)定甘草酸含量。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物分組

將試驗(yàn)用綿羊隨機(jī)分為三組，每組4只，分別為空白對(duì)照組、低劑量組和高劑量組。實(shí)驗(yàn)組綿羊每只每日早上飼喂甘草粉與精料混合物?？瞻讓?duì)照組所飼喂的精料中不加甘草粉，連續(xù)飼喂30 d。

1.3杯狀細(xì)胞體積及數(shù)量的檢測(cè)

具體步驟：取材→固定→蒸餾水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→撈片→烤片→脫蠟→蒸餾水沖洗→用阿爾新藍(lán)染液染色（30 min）→流水沖洗（2 min）→蒸餾水漂洗→蘇木素復(fù)染→脫水→透明→封片→顯微鏡觀察、照相。

1.4IgA分泌量的檢測(cè)

1）放血處死綿羊，使用手術(shù)刀將肺組織切成1.5 cm×1 cm×0.3 cm左右的小塊，用10%中性福爾馬林固定24 h后修塊到適當(dāng)大小，再固定14 d。

2）將固定好的組織塊用自來(lái)水沖洗2 d，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，具體操作步驟如下：組織塊→50%乙醇（2～3 h）→60%乙醇（2～3 h）→75%乙醇（2～3 h）→85%乙醇（2～3 h）→95%乙醇（1 h）→100%乙醇（40 min）→二甲苯、乙醇（1∶1）（30 min）→二甲苯（30 min）→52℃蠟杯（60 min）→55℃蠟杯（60 min）。

3）切片、撈片與烤片：將已溶化的石蠟倒入包埋框（小紙盒），迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中，冷卻凝固成塊狀（即包埋），將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成8μm薄片，放到42℃溫水中燙平，再貼到載玻片上，再放60℃恒溫箱中烘烤24 h。

4）脫蠟：二甲苯I（15 min）→二甲苯II（10 min）→100%乙醇I（5 min）→100%乙醇II（5 min）→95%乙醇（5 min）→90%乙醇（5 min）→70%乙醇（5 min）。

5）沖洗：蒸餾水沖洗3次，2 min/次；pH 7.2 PBS沖洗3次，5 min/次。

6）阻斷氧化酶活性：擦掉切片組織周?chē)囊后w，用PAP筆在組織周?chē)?huà)圈，放入底部盛有PBS的濕盒中，滴加3%H2O2阻斷劑于組織上，室溫避光20 min。PBS液沖洗3次，5 min/次。

7）抗原修復(fù)：熱修復(fù)96℃，30 min，冷卻后PBS 洗3次，2 min/次。

8）血清封閉：進(jìn)口羊血清工作液滴加在組織上，37℃孵育30 min，甩掉血清，勿沖洗。

9）滴加一抗：滴加50倍稀釋的一抗，37℃1 h，PBS（pH：7.2-7.6）洗3次，2 min/次。

10）滴加二抗：滴加生物素化兔抗鼠IgG，陰性對(duì)照組滴加等量PBS緩沖液代替一抗，20～37℃，20 min。PBS（pH：7.2-7.6）洗3次，2 min/次。

11）滴加試劑SABC，20～37℃，20 min，PBS （pH：7.2-7.6）4次，5 min/次。

12）DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取蒸餾水1 mL，加試劑A 1滴，搖勻，再加試劑B和試劑C 各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色30 min。

13）蘇木素復(fù)染、各級(jí)酒精脫水，透明。14）中心樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察、照相。

2　結(jié)果

2.1甘草品質(zhì)鑒定結(jié)果

利用HPLC對(duì)野生脹果甘草粉的甘草酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為3.1±0.6%，屬于優(yōu)質(zhì)甘草。

2.2杯狀細(xì)胞體積及數(shù)量變化

未飼喂甘草組與試驗(yàn)組相比，杯狀細(xì)胞體積和數(shù)量都較??；實(shí)驗(yàn)組綿羊甘草飼喂量高的，杯狀細(xì)胞數(shù)量和體積明顯多于低劑量組。

2.3IgA分泌量的變化

未飼喂甘草組與試驗(yàn)組相比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯偏少；與空白組相比，低劑量組陽(yáng)性細(xì)胞明顯較多；與低劑量組相比，高劑量組陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量又明顯增多。

2.4圖像分析結(jié)果

表1　杯狀細(xì)胞及IgA圖像IOD值測(cè)算結(jié)果（±s）

表1　杯狀細(xì)胞及IgA圖像IOD值測(cè)算結(jié)果（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

?

飼喂甘草組杯狀細(xì)胞和IgA分泌量都顯著高于空白組（P＜0.01）且高劑量組明顯高于低劑量組（P＜0.01）。

3　結(jié)論

甘草作為飼料添加劑具有增加綿羊支氣管黏膜杯狀細(xì)胞體積、數(shù)量和IgA分泌量的作用。

4　討論

本試驗(yàn)主要探究不同飼喂量的甘草添加劑對(duì)綿羊支氣管黏膜杯狀細(xì)胞的功能的影響。由于試驗(yàn)步驟多且繁復(fù)，因此必須要求在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)要有嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的態(tài)度，如所需試劑、儀器、各類(lèi)緩沖液等必須提前準(zhǔn)備好，以防造成時(shí)間上的沖突，在包埋過(guò)程中軟蠟和硬蠟的比例、PBS緩沖液pH值的校正、滴加抗體的時(shí)間、濕盒的溫度、DAB顯色的時(shí)間等每個(gè)步驟都必須嚴(yán)格按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，否則都會(huì)影響試驗(yàn)效果。10%中性福爾馬林比普通福爾馬林對(duì)組織滲透性強(qiáng)，固定均勻?qū)M織膨脹約5%，經(jīng)酒精脫水時(shí)有較大的收縮，能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長(zhǎng)期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝?，不利于染色，特別是細(xì)胞核的著色，經(jīng)自來(lái)水沖洗6～24 h后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。

在阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)杯狀細(xì)胞體積及數(shù)量變化的試驗(yàn)中，由于阿爾新藍(lán)帶正電荷，屬陽(yáng)離子染料，在pH 2.5條件下，其陽(yáng)離子可與酸性糖共軛物中的羧基或硫酸根結(jié)合而著色，但不能和核酸的磷酸根結(jié)合，其染色特點(diǎn)為特異性強(qiáng)，染色深而牢固，因此得出的試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性反應(yīng)很明顯。但免疫組化試驗(yàn)測(cè)IgA分泌量的試驗(yàn)卻失敗了兩次，第一次是配制PBS緩沖液的過(guò)程中沒(méi)有進(jìn)行pH值校正，導(dǎo)致結(jié)果不明顯。第二次是復(fù)染過(guò)程中忘了過(guò)鹽酸（1∶1的鹽酸酒精，6 s，脫色）。除了這些個(gè)人原因之外，這次實(shí)驗(yàn)具有很?chē)?yán)格的時(shí)間性，所有步驟都是嚴(yán)格按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間和驟進(jìn)行，在試驗(yàn)過(guò)程，我們相互配合，相互幫助，嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，最終做出了較為理想的結(jié)果。

試驗(yàn)的不足之處在于我認(rèn)為試驗(yàn)組取得不夠完整，當(dāng)甘草添加劑的飼喂量高于或低于某一個(gè)臨界值時(shí)，其結(jié)果可能會(huì)發(fā)生變化，不再是甘草飼喂量與杯狀細(xì)胞的體積變化及IgA分泌量呈正比。這方面可以做更進(jìn)一步的研究?！觯ň庉嫞黑w曉松）

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社.2000：65～66.

［2］胡金鋒，葉仲林，沈鳳嘉.云南甘草化學(xué)成分的研究（Ⅰ）［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)1994，04：6～8.

［3］金宏.淺談甘草藥理作用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11（1）78～79.

［4］陳少峰，余勝民等.甘草止咳祛痰作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（11）：173～177.

Effects of Licorice additives on numbers of goblet cells and IgA secretion of sheep bronchial mucosa

Zhang Haiyan
（Sanhe animal husbandry and Fisheries Bureau，Sanhe Hebei，065200）

By exploring the main pharmacological effects of licorice and the main component of medicinal value and efficacy，to study Licorice additive effects on the immune function of the respiratory system in sheep.

Licorice additives；Bronchial mucosa；Goblet cell；IgA