張寧，郭莉，韓昱，趙博偉（，河北省畜牧獸醫(yī)研究所河北保定07000；.保定市冀農(nóng)動物藥業(yè)有限公司河北保定07000；.吉林大學(xué)吉林長春00；.河北省畜牧獸醫(yī)局河北石家莊0500）

中西藥復(fù)方制劑治療雞傳染性鼻炎的研究

張寧1，郭莉2，韓昱3，趙博偉4
（1，河北省畜牧獸醫(yī)研究所河北保定071000；2.保定市冀農(nóng)動物藥業(yè)有限公司河北保定071000；3.吉林大學(xué)吉林長春130012；4.河北省畜牧獸醫(yī)局河北石家莊050031）

采用超微粉碎技術(shù)將篩選出的中藥組方制成超微粉與氫溴酸東莨菪堿混合，研制出一種治療雞傳染性鼻炎的中西藥復(fù)方制劑，并以磺胺類藥物作為對照，進(jìn)行臨床試驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)：該復(fù)方制劑治療效果最佳，生產(chǎn)性能恢復(fù)良好；磺胺類藥物治療后復(fù)發(fā)率達(dá)60%，而該復(fù)方制劑治療后復(fù)發(fā)率為0。

雞傳染性鼻炎；雞副嗜血桿菌；中藥超微粉；氫溴酸東莨菪堿

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.044

傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum，Hpg）引起的，臨床上以打噴嚏、鼻腔流出黏性分泌物、流淚、結(jié)膜發(fā)炎、顏面及眼周圍腫脹或水腫為主要特征。副雞嗜血桿菌分為A、B和C三個血清型，每個血清型的滅活菌體之間缺乏免疫保護(hù)。目前我國A型菌株的流行占主導(dǎo)地位，部分地區(qū)有B型和C型Hpg的存在。

隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，雞傳染性鼻炎在我國發(fā)生、流行呈上升趨勢。由于本病潛伏期短，傳播迅速，流行期長，產(chǎn)蛋雞感染后產(chǎn)蛋量下降10%～40%，生長雞生長停滯，肉雞因氣囊炎導(dǎo)致屠宰加工中廢棄增加，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展。目前治療雞傳染性鼻炎的常用西藥磺胺類，影響產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率、受精率；易造成腎腫、腎出血，降低抵抗力；易產(chǎn)生抗藥性，易復(fù)發(fā)。

鑒于上述雞傳染性鼻炎給養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害及當(dāng)前治療方法的研究現(xiàn)狀，研制一種藥效高、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、便于應(yīng)用的中西藥復(fù)方制劑是非常必要的。本研究擬通過超微粉碎技術(shù)對中藥進(jìn)行粉碎，使藥效充分發(fā)揮，并與改善微循環(huán)的西藥氫溴酸東莨菪堿相結(jié)合，為臨床迅速治療和控制該病的流行提供方法。

1　中藥對副雞嗜血桿菌抑制作用及耐藥性誘導(dǎo)作用的試驗(yàn)研究

1.1試驗(yàn)菌株及藥物

副雞嗜血桿菌A型Hpg-1：購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

組方一：益母草、防風(fēng)、甘草、訶子各100 g，辛荑、桔梗、黃芩、半夏80 g。組方二：金銀花100 g、白芷250 g、防風(fēng)150 g、蒼術(shù)150 g、黃岑80 g、甘草80 g。組方三：黃芩120 g、麻黃120 g、辛夷花100 g、金蕎麥100 g、魚腥草80 g、桔梗50 g、甘草50 g。組方四：魚腥草300 g，黃皮葉200 g，紫蘇50 g，蒲公英50 g，金銀花50 g，板藍(lán)根50 g，大青葉80 g，甘草50 g。組方五：黃芩150 g，玄參100 g，升麻100 g，黃連90 g，牛蒡子90 g，陳皮60 g，甘草60 g，柴胡60 g，桔梗60 g，薄荷30 g，僵蠶90 g。（以上中藥材購于安國市祁州中草藥材有限公司。）

復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉：購于獸藥經(jīng)營公司。

1.2試驗(yàn)動物

健康商品雞，試驗(yàn)期間飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料，自由飲水。

1.3藥物制備

稱取潔凈干燥藥材剪碎后置于燒杯中，加蒸餾水沒過藥材1 cm左右，浸泡20 min后加10倍于藥材量的水，置于電爐加熱，煮沸30 min后用紗布過濾，再加5倍于藥量的水沒過濾渣，煮沸30 min后過濾，將兩次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀75℃濃縮至1 g/mL，流通蒸汽滅菌20 min，放入4℃冰箱備用。

1.4中藥復(fù)方的篩選

采用管碟法對中藥復(fù)方進(jìn)行篩選。將每個處方的藥液分成兩份，一份是混合均勻后試驗(yàn)，另一份靜置12 h，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)。在平皿中注入10 mL熱融的培養(yǎng)基作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放至45～50℃，加入適量副雞嗜血桿菌，搖勻，加5 mL于底層上，均勻攤布，作為菌層。冷卻后，每個平皿中等距離放置干熱滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm），加入等量藥物，37℃厭氧培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈的大小。如此進(jìn)行三次，取平均值。

1.5中藥最低抑菌濃度MIC（Minimum inhibitory concentrations）的測定

方法一，采用CLS推薦的瓊脂稀釋法（Agar Dilution Method）測定藥液的最低抑菌濃度。瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50℃的培養(yǎng)基中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，每毫升培養(yǎng)基中含藥液濃度約為500 mg、250 mg、125 mg、62.5 mg、31.25 mg、15.625 mg。藥物平板置備好后，接種受試菌0.1 mL，菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋跤笥^察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。

方法二，采用管碟法對藥液進(jìn)行MIC測定。先將藥液進(jìn)行梯度稀釋1∶2（500 mg/mL），1∶4（250 mg/mL），1∶8（125 mg/mL），1∶16（62.5 mg/mL），1∶32（31.25 mg/mL），1∶64（15.625 mg/mL）；在平皿中注入10 mL熱融的培養(yǎng)基作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放至45～50℃，加入適量副雞嗜血桿菌，搖勻，加5 mL于底層上，使均勻攤布，作為菌層。冷卻后，每個平皿中等距離放置干熱滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm），加入等量但不同濃度的藥液，孵育后觀察抑菌圈的情況，以產(chǎn)生抑菌圈的藥液所含最低藥物濃度為MIC。

1.6結(jié)果與分析

1.6.1中藥組方抑菌效果五個組方中除了方一對副雞嗜血桿菌沒有抑菌效果外，其它四個組方均不同程度有抑菌性。其中方三抑菌效果最佳，結(jié)果（見表1，圖1）。

1.6.2中藥最低抑菌濃度MIC結(jié)果對中藥組方進(jìn)行最低抑菌濃度MIC的測定，結(jié)果顯示，組方三和組方四的抑菌效果最佳，二者比較組方三用兩種方法測得最低抑菌濃度均能達(dá)到31.25 mg/mL，而方四用兩種方法測得的MIC分別是62.5 mg/mL和31.25 mg/mL，可見組方三略好于組方四。組方一抑菌效果最差，結(jié)果（見表2）。

表1　五個中藥組方體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖1　五個中藥組方體外抑菌試驗(yàn)圖

表2　中藥組方對雞副嗜血桿菌體外最低抑菌濃度MIC的測定（mg/mL）

2　中西復(fù)方制劑對副雞嗜血桿菌的臨床療效試驗(yàn)

2.1攻毒菌液的制備

用生理鹽水校正細(xì)菌濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，對試?yàn)雞進(jìn)行眶下竇接種0.2 mL/只，即攻毒劑量約3×107cfu/只。

2.2試驗(yàn)分組

1）中藥粗粉試驗(yàn)A組：設(shè)三個劑量組（A-1組用藥劑量為1 g/只，A-2組用藥劑量為3 g/只，A-3組用藥劑量為5g/只），于日糧中混飼，連續(xù)飼喂至控制病情穩(wěn)定。

2）中藥微粉試驗(yàn)B組：設(shè)三個劑量組（B-1組用藥劑量為1 g/只，B-2組用藥劑量為3 g/只，B-3組用藥劑量為5 g/只），于日糧中混飼，連續(xù)飼喂至控制病情穩(wěn)定。

3）中西藥復(fù)方試驗(yàn)C組：即中藥微粉與西藥氫溴酸東莨菪堿聯(lián)合應(yīng)用，設(shè)三個劑量組（中藥微粉的劑量分別為：C-1組用藥劑量為1 g/只，C-2組用藥劑量為3 g/只，C-3組用藥劑量為5 g/只；氫溴酸東莨菪堿的用量均為0.015 mg/只），微粉于日糧中混飼，氫溴酸東莨菪堿集中混飲，連續(xù)使用至控制病情穩(wěn)定。

4）化藥對照D組：化藥為復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉，按照獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)使用，混飲，每1 L水，1～2 g，連用3～5 d。

200只170日齡健康商品蛋雞，無傳染性鼻炎感染史，產(chǎn)蛋率在80%，隨機(jī)分組，每組各20只。

2.3藥物治療試驗(yàn)

試驗(yàn)用雞，除健康對照組外，其余各組攻毒，攻毒后觀察發(fā)病情況，出現(xiàn)臨床癥狀后開始治療。

治療結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)2個月，正常喂料飲水，觀察各組雞只的復(fù)發(fā)情況。

2.4療效評價(jià)

精神狀態(tài)，食欲，臨床癥狀，死亡率，產(chǎn)蛋率，復(fù)發(fā)情況及病理剖檢。

2.5結(jié)果與分析

攻毒24 h后，各組雞只均表現(xiàn)精神沉郁，采食量輕微減少，個別雞只出現(xiàn)眼結(jié)膜炎，打噴嚏的癥狀；48 h后，各組雞只采食量明顯下降，產(chǎn)蛋率輕微下降，半數(shù)以上雞只出現(xiàn)面部、眼瞼不同程度水腫，甩鼻或撓鼻現(xiàn)象；72 h后，各組雞只的發(fā)病率均達(dá)到90%～100%，開始用藥治療。

A組3個劑量水平中、高劑量治療時(shí)間均為10 d，即大部分癥狀消除，采食量恢復(fù)，精神狀態(tài)良好；低劑量組治療12 d后臨床癥狀消除，但停藥1周后，又有個別雞只復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率在20%，又進(jìn)行連續(xù)用藥6 d痊愈，精神狀態(tài)、采食量及其它臨床癥狀消失，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束未再復(fù)發(fā)。

B組和C組的低劑量治療時(shí)間一致，均耗時(shí)8 d；B組的中、高劑量組和C組的高劑量組治療時(shí)間為7 d；C組的中劑量組用藥5 d后痊愈；且B組和C組均未見病情復(fù)發(fā)。

D組為磺胺藥物對照組，按照國家標(biāo)準(zhǔn)劑量用藥，4 d后基本痊愈，無死淘；但停藥2周后，病情反復(fù)，高達(dá)60%的復(fù)發(fā)率，連續(xù)用藥5 d痊愈；停藥10 d后，又復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率30%，于是選擇C-2治療方案，4 d痊愈，試驗(yàn)結(jié)束前未再復(fù)發(fā)。

磺胺組治療效果最迅速，但極易復(fù)發(fā)，經(jīng)過3次治療才將病情控制，綜合耗時(shí)最長；中藥組方中，相同劑量比較，微粉的治療時(shí)間整體上比粗粉組短，中西藥結(jié)合的微粉中劑量組治療周期最短；從產(chǎn)蛋率的恢復(fù)情況看，微粉組的效果要好于粗粉組；中西藥結(jié)合微粉組產(chǎn)蛋恢復(fù)整體上好于中藥微粉組；從復(fù)發(fā)情況來看，磺胺藥組復(fù)發(fā)兩次，復(fù)發(fā)率分別為60%和30%，粗粉組低劑量復(fù)發(fā)一次，復(fù)發(fā)率為20%，其它中藥組無論是中高劑量粗粉組，還是微粉組，亦或中西藥結(jié)合微粉組共8組，未見復(fù)發(fā)情況出現(xiàn)。綜合各項(xiàng)數(shù)據(jù)，中西藥結(jié)合微粉組中劑量，治療周期短，效果明顯，產(chǎn)蛋率恢復(fù)值高，且不復(fù)發(fā)（見表3）。

表3　藥物臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較

3　抗菌中藥組方及與氫溴酸東莨菪堿復(fù)方的急性毒性試驗(yàn)

中藥毒理學(xué)試驗(yàn)研究是預(yù)測中藥制劑安全性的一個重要手段。通過毒理試驗(yàn)了解中藥制劑的毒性反應(yīng)、毒性強(qiáng)度、毒害發(fā)展過程及毒性作用是否具有可逆性。安全性試驗(yàn)是開發(fā)研制新藥不可缺少的環(huán)節(jié)，為了檢驗(yàn)中藥制劑和聯(lián)合用藥的安全性，做急性毒性試驗(yàn)和耐受性試驗(yàn)是必要的。

3.1試驗(yàn)動物

健康昆明小鼠100只，20±2 g，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25～35℃，濕度為60%，飼以固體飼料，自由飲水。

3.2試驗(yàn)用藥及給藥劑量

中藥基礎(chǔ)給藥劑量為2 mL/kg（臨床用量2g/kg的2倍），西藥基礎(chǔ)給藥劑量為0.13 mg/kg（臨床用量的13倍），按照1∶1.4的等比級數(shù)設(shè)2 mL/kg+ 0.13 mg/kg、2.8 mL/kg+0.18 mg/kg、3.92 mL/kg+0.25 mg/kg、5.49mL/kg+0.36 mg/kg、7.68 mL/kg+0.50 mg/ kg、10.76 mL/kg+0.70 mg/kg、15.06 mL/kg+0.98 mg/kg 7個給藥劑量組，另外在設(shè)1個高劑量組即20 mL/kg+1.0 mg/kg（中藥劑量為臨床擬推薦劑量的40倍，西藥用量為臨床擬推薦劑量的100倍）以及一個空白對照組共計(jì)9個試驗(yàn)組。

3.3試驗(yàn)方法

將90只健康小鼠，隨機(jī)分為9個組，每組5只雄性小鼠和5只雌性小鼠。其中8個給藥組，1個作為空白對照組。

禁食8 h（不禁水）后，各給藥組均按每只小鼠的體重計(jì)算出給藥量，每只小鼠均用金屬胃管經(jīng)口灌服給藥一次?？瞻讓φ战M的小鼠自由采食和飲水。

3.4臨床觀察及觀察指標(biāo)

各組小鼠給藥后連續(xù)觀察1周，隨時(shí)觀察小鼠精神、食欲、飲水、活動及有無中毒情況并及時(shí)記錄小鼠的臨床表現(xiàn)及動物死亡數(shù)。

3.5結(jié)果

給藥組小鼠全部存活且小鼠的采食、飲水、精神狀態(tài)、活動情況及大小便等均未出現(xiàn)明顯異常，與空白對照小鼠的采食、飲水、精神狀態(tài)、活動情況及大小便等相同，說明該中西藥復(fù)方對小鼠的臨床表現(xiàn)無影響。本次試驗(yàn)沒有小鼠死亡情況出現(xiàn)。

4　最大耐受劑量試驗(yàn)

根據(jù)《新藥中藥藥理毒理研究的技術(shù)要求補(bǔ)充說明》，并參照《獸藥試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范匯編》及《新藥臨床前安全評價(jià)與實(shí)驗(yàn)》，中藥制劑因藥物濃度或給藥體積過大，無法測出LD50時(shí)，可給予動物能夠接受的最大濃度下的最大體積進(jìn)行急性毒性測定，并可在24 h內(nèi)口服多次（2～4次），以觀察7 d內(nèi)產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

4.1中藥組方最大耐受劑量試驗(yàn)

4.1.1材料健康昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25～35℃，濕度為60%，飼以固體飼料，自由飲水。

中藥組方水煎提取2次，30 min/次，8層紗布過濾，合并濾液，濃縮至2∶1（即1 mL煎液相當(dāng)于原生藥2 g）備用。

4.1.2試驗(yàn)方法取健康小鼠20只，雌雄各半，禁食8 h，給藥總劑量為2 mL/只/20 g，8 h內(nèi)分2次用金屬胃管經(jīng)口灌服給藥，每次1 mL/只/20 g。給藥后，小鼠自由進(jìn)食、飲水，給藥后24 h內(nèi)嚴(yán)密觀察受試動物情況，以后觀察次數(shù)可逐漸減少。另設(shè)不用藥對照組。

連續(xù)觀察7 d，隨時(shí)觀察小鼠精神、食欲、飲水、活動及有無中毒情況并及時(shí)記錄小鼠的臨床表現(xiàn)及動物死亡數(shù)。對死亡小鼠及時(shí)剖檢，觀察各臟器的變化。第8天斷頭處死全部存活小鼠，剖檢，逐一觀察記錄臟器的變化。

4.2中藥組方與西藥氫溴酸東莨菪堿聯(lián)用最大耐受劑量試驗(yàn)

4.2.1材料及劑量健康昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25～35℃，濕度為60%，飼以固體飼料，自由飲水。

將精密稱量的氫溴酸東莨菪堿溶解于中藥液中，灌胃劑量2 mL/只+0.04 mg/只，其中：中藥組方用量2 mL/只（每只小鼠體重約20 g，即約100 mL/kg的2倍濃縮液，相當(dāng)于臨床用量2 g/kg的100倍），西藥用量0.04 mg/只，即2 mg/kg相當(dāng)于臨床用量的200倍。

4.2.2試驗(yàn)方法同3.3。

4.2.3結(jié)果與分析小鼠給藥后，有一半數(shù)量的小鼠表現(xiàn)活動顯著減少，采食和飲水顯著減少；24 h后小鼠的行為、活動、呼吸、飲水、采食、精神狀態(tài)、大小便及對外刺激反應(yīng)均正常，且無一動物死亡。連續(xù)觀察7 d，第8天捕殺全部存活小鼠，進(jìn)行肉眼病理學(xué)觀察，通過觀察臟器顏色、形狀、大小等，中藥組方最大耐受量組及中西藥復(fù)方最大耐受量組均未見異常變化。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，該中藥組方在2倍濃縮下，最大允許容量2 mL/20 g/d，小鼠的最大耐受劑量大于100 mL/kg（以非濃縮液計(jì)算，即以中藥散劑計(jì)算為200 g/kg）；該中藥散劑的靶動物雞1 d的臨床用藥推薦劑量約為2 g/kg?？梢娦∈蠊喾撝兴幍淖畲竽褪軇┝繛榘袆游镉盟巹┝康?00倍左右；配合西藥氫溴酸東莨菪堿（用量即2 mg/kg相當(dāng)于臨床用量0.01 mg/kg的200倍）的條件下仍無任何不良反應(yīng)。表明該制劑用藥安全。

5　討論

化藥治療雞傳染性鼻炎，見效快但極易復(fù)發(fā)。本研究從現(xiàn)代中獸醫(yī)理論出發(fā)，選定的組方中各味藥材中均含有治療雞傳染性鼻炎的有效成分。麻黃的主要成分為麻黃堿、偽麻黃堿等生物堿，能松弛支氣管平滑肌、緩解支氣管平滑肌痙攣的作用等。辛夷花有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及收縮鼻黏膜血管的作用。黃芩有效成分為黃芩苷、黃芩素等，體外抗菌試驗(yàn)對傷寒桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、溶血性鏈球菌等有抑制作用。魚腥草（有效成分癸酰乙醛）對多種革蘭陽性細(xì)菌和陰性細(xì)菌（如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、卡他球菌、白喉?xiàng)U菌、變形桿菌、志賀、施氏、福氏及宋內(nèi)痢疾桿菌、腸炎桿菌等）均有不同程度的抑制作用。金蕎麥含野蕎麥苷，水解后生成對香豆酸、阿魏酸及葡萄糖；另含有雙聚原矢車菊甙元；金蕎麥對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌均有抑制作用。桔梗含有桔梗皂甙，具有祛痰鎮(zhèn)咳的作用。甘草含有甘草次酸、甘草甜素等，甘草次酸有明顯的中樞性鎮(zhèn)咳作用；此外甘草甜素、甘草次酸鹽尚有抗炎癥及抗過敏、抗菌、等作用；甘草甜素對某些藥物中毒、食物中毒、體內(nèi)代謝產(chǎn)物中毒都有一定的解毒能力。

臨床試驗(yàn)和急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，磺胺類藥物治療迅速，但極易復(fù)發(fā)，而中藥微粉組方加氫溴酸東莨菪堿組安全無毒，治療效果明顯，用藥周期短，生產(chǎn)性能恢復(fù)得比較好，且不復(fù)發(fā)?！觯ň庉嫞黑w曉松）

Study on the Treatment of Avian Infectious Coryza with Compound Preparation of Chinese and Western medicine

Zhang Ning1，Guo Li2，Han Yu3，Zhao Bowei4
（1.Hebei Research Iustitute of Animal Science and Veterinary Medicine，Baoding HeBei 071000，；2.BaodingJinong agricultural animal pharmaceutical Co.，Ltd.Baoding HeBei 071000；3.Jilin University，Changchun JiLin 130012；4. Hebei Animal Husbandry and Veterinary Bureau，ShiJiazhuang HeBei 050031）

Grind traditional Chinese prescriptions medicine screened and scopolamine hydrobromide into ultra fine powder using ultrafine grinding technology，a compound preparation of Chinese and Western medicine for curing avian infectious coryza is developed.Sulfa drugs used as controls for clinical trials.The results confirmed:This compound preparation has best treatment，the avian performance recovered well. After sulfa drugs，avian infectious coryza recurrence rate was 60%，while the compound preparation after treatment relapse rate was zero.

avian infectious coryza，Haemophilus gallinarum，herbal superfine powder，Scopolamine hydrobromide

項(xiàng)目來源：河北省畜牧獸醫(yī)局資助項(xiàng)目：2011-1-03。

張寧（1976-），女，漢族，河北省博野縣人，高級獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)傳染病預(yù)防研究工作。