邢媛媛　李大彪　李紅磊　于永強(qiáng)　王衛(wèi)云

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

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催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

邢媛媛李大彪*李紅磊于永強(qiáng)王衛(wèi)云

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

本試驗(yàn)旨在探討催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。選取中國(guó)荷斯坦奶牛BMECs為試驗(yàn)材料，經(jīng)純化培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中添加不同濃度催乳素[0(對(duì)照)、100、300、500和1 000 ng/mL]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力；利用試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)甘油三酯的含量；采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明：1)催乳素濃度為100、300 ng/mL時(shí)，BMECs相對(duì)增殖率顯著高于對(duì)照組與其他試驗(yàn)組(P<0.05)。2)與對(duì)照組相比，300 ng/mL催乳素能夠顯著提高BMECs乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)、脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)基因表達(dá)量及甘油三酯的含量(P<0.05)，硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因表達(dá)量有增加的趨勢(shì)。3)與對(duì)照組相比，100、300 ng/mL催乳素能夠顯著提高哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、催乳素受體(PRLR)基因表達(dá)量(P<0.05)；300 ng/mL催乳素能顯著提高αS1酪蛋白(CSN1S1)基因表達(dá)量(P<0.05)。綜上所述，100～300 ng/mL的催乳素對(duì)BMECs乳脂和乳蛋白合成有較好的促進(jìn)效果。

奶牛乳腺上皮細(xì)胞；催乳素；細(xì)胞活力；甘油三酯；乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因

催乳素(prolactin,PRL)是一種多肽類(lèi)激素，與其受體結(jié)合后引發(fā)催乳素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)乳腺發(fā)育，發(fā)動(dòng)并維持泌乳及促進(jìn)乳脂和乳蛋白合成分泌等功能[1-2]。關(guān)于催乳素對(duì)泌乳性能的研究前人已經(jīng)取得了一定的成果。體內(nèi)研究表明，催乳素對(duì)單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物都可以刺激乳腺發(fā)育和促進(jìn)泌乳。Wall等[3]連續(xù)3周給牛注射少量催乳素(1 μg/kg，2次/d)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)奶量增加；Plaut等[4]發(fā)現(xiàn)催乳素能夠增加乳成分中β-乳球蛋白的含量；而給泌乳奶牛注射催乳素抑制劑溴麥角隱亭可使產(chǎn)奶量下降[5]。研究表明，敲除雌性鼠催乳素或催乳素受體(PRLR)基因，乳腺發(fā)育停止。催乳素基因缺陷導(dǎo)致產(chǎn)奶量持續(xù)降低，48 h內(nèi)乳腺泌乳細(xì)胞數(shù)目減少20%～25%[6]。泌乳期間，用溴麥角環(huán)肽使催乳素缺失也能迅速誘使DNA出現(xiàn)梯型帶和細(xì)胞調(diào)亡，甚至使泌乳停滯[7]，Ben-Jonathan等[8]的研究指出，催乳素可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物乳蛋白的合成，也可以增加乳脂和乳糖的合成。體外研究表明，催乳素與胰島素、生長(zhǎng)激素一樣直接影響細(xì)胞的增殖和激素分泌的作用，且這種作用與濃度有關(guān)[9-10]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成乳脂和乳蛋白的過(guò)程，不論是在基因轉(zhuǎn)錄階段還是蛋白質(zhì)翻譯階段，催乳素的調(diào)控作用都是非常重要的。在泌乳過(guò)程中，催乳素可以刺激一些氨基酸的吸收，用于乳蛋白的合成[11]，催乳素與乳腺分泌細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，刺激乳蛋白(尤其是酪蛋白)和酶(如乳糖合成酶)mRNA產(chǎn)生，加速葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)乳糖及乳脂的合成[1,12]。研究證實(shí)，在BMECs的培養(yǎng)基中添加催乳素，可以促使花生四烯酸短暫而快速地釋放，而花生四烯酸可以刺激酪蛋白分泌。催乳素與生長(zhǎng)激素、胰島素、瘦素等其他激素關(guān)系密切，它們之間有許多交叉活性。有研究報(bào)道，用催乳素刺激培養(yǎng)的泌乳期奶牛乳腺組織，瘦素基因表達(dá)量增加。有催乳素作用時(shí)瘦素可促進(jìn)脂肪酸合成，沒(méi)有催乳素刺激這種作用就會(huì)喪失[13]，并且催乳素協(xié)同卵巢類(lèi)固醇激素，促進(jìn)乳腺小葉腺泡的生長(zhǎng)和上皮細(xì)胞增殖[14]，同時(shí)添加胰島素可以促進(jìn)乳蛋白的合成[15]。在乳脂合成的過(guò)程中，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)在細(xì)胞調(diào)控因子通路中處于樞紐位置，可以通過(guò)結(jié)合脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)和胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)等靶基因，影響脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、從頭合成和酯化過(guò)程[16]。

目前我國(guó)奶牛的良種率已達(dá)到95%以上，但乳中乳脂、乳蛋白含量均低于發(fā)達(dá)國(guó)家，未能發(fā)揮奶牛應(yīng)有的遺傳潛力，乳營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)低下已成為制約我國(guó)奶業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的瓶頸[16]。為了探討催乳素對(duì)BMECs乳脂和乳蛋白的影響，本研究以BMECs為模型，研究不同濃度催乳素對(duì)BMECs活力和胞內(nèi)甘油三酯(triglyceride,TAG)含量的影響，以及對(duì)乳脂和乳蛋白信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在為調(diào)控乳脂和乳蛋白合成提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

DMEM/F12、胎牛血清、氫化可的松、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液均購(gòu)自Gibco公司，表皮生長(zhǎng)因子、催乳素、膠原酶Ⅱ、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、四甲基偶氮唑鹽(thiazoly blue tetrazolium bramide,MTT)、二甲基亞砜均購(gòu)自Sigma公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone)、總RNA提取試劑盒RNA isoplus、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒Prime ScriptTMRT reagent kit、實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取健康的中國(guó)荷斯坦奶牛的BMECs進(jìn)行體外培養(yǎng)，經(jīng)純化后，收集第2代的乳腺上皮細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)60%～70%時(shí)，先用無(wú)血清無(wú)激素含有50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素和1 ng/mL兩性霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)基過(guò)渡16 h以上(饑餓處理)，然后添加含有不同催乳素濃度[0(對(duì)照)、100、300、500和1 000 ng/mL]的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2 mmol/L谷氨酰胺、1 ng/mL氫化可得松及5 μg/mL胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定濃度，制備RT-qPCR反應(yīng)液，應(yīng)用RT-qPCR方法，檢測(cè)乳脂合成相關(guān)基因[乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FASN)、二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)、SCD]、乳脂合成相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子[FABP3、PPARγ、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)]、乳蛋白合成相關(guān)基因[αS1酪蛋白(CSN1S1)、κ-酪蛋白(CSN3)]、信號(hào)通路相關(guān)基因[哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)、蛋白激酶B(AKT)]及PRLR的表達(dá)，各基因表達(dá)量用2-△△Ct值表示[17]。

1.3測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的獲取與純化

選取處于泌乳高峰期體況良好的荷斯坦奶牛進(jìn)行試驗(yàn)，從奶牛乳腺組織取樣，剪取腺泡豐富的乳腺組織約50 g，利用膠原酶Ⅱ消化法獲得原代乳腺上皮細(xì)胞。待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底的80%左右時(shí)，利用乳腺上皮細(xì)胞和成纖維上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感度不同來(lái)純化乳腺上皮細(xì)胞并傳代。傳至第1代凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2BMECs細(xì)胞活力的檢測(cè)

利用MTT法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞的活力。按照1×104個(gè)/孔的密度將細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，進(jìn)行饑餓處理16 h，之后分別添加含不同濃度催乳素的DMEM/F12誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)每組均設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)孔為1個(gè)重復(fù)；在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL；4 h后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，振蕩10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD)。

細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR)=試驗(yàn)組OD490 nm/對(duì)照組OD490 nm。

1.3.3BMECs內(nèi)TAG含量的測(cè)定

將第2代的BMECs用胰蛋白酶/EDTA消化后，以8×105個(gè)/瓶的密度接種于最大生長(zhǎng)面積75 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底80%時(shí)，進(jìn)行饑餓處理，16 h后添加含有催乳素的誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用胰蛋白酶/EDTA消化細(xì)胞，用TAG試劑盒測(cè)定BMECs中TAG的含量。試驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)瓶為1個(gè)重復(fù)。

1.3.4BMECs中乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)量的測(cè)定

將第2代細(xì)胞懸浮液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶10 mL含有8×105個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后，先用無(wú)血清無(wú)激素含有青-鏈霉素和兩性霉素B的培養(yǎng)基過(guò)渡16 h，然后分別添加含不同濃度催乳素的DMEM/F12誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用胰蛋白酶/EDTA消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液128×g離心10 min，棄去上清液，用PBS清洗，細(xì)胞總RNA的提取采用試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用分光光度計(jì)測(cè)定提取的總RNA的濃度及OD260 nm/OD280 nm，反轉(zhuǎn)錄PCR按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。本試驗(yàn)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。試驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)瓶為1個(gè)重復(fù)。

表1　引物序列及參數(shù)

續(xù)表1基因Genes序列SequencesGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.硬脂酰輔酶A去飽和酶SCDF:5'-TCCTGTTGTTGTGCTTCATCC-3'R:5'-GGCATAACGGAATAAGGTGGC-3'AY241993脂肪酸結(jié)合蛋白3FABP3F:5'-GAACTCGACTCCCAGCTTGAA-3'R:5'-AAGCCTACCACAATCATCGAAG-3'DN518905過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γPPARγF:5'-ATGTCTCATAATGCCATCAGGTT-3'R:5'-GATAACAAACGGTGATTTGTCTGTC-3'NM_181024固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白1SREBP-1F:5'-CGCTCTTCCATCAATGACAA-3'R:5'-TTCAGCGATTTGCTTTTGTG-3'NM_001113302催乳素受體PRLRF:5'-GATGACTGTGAGGACCAGCA-3'R:5'-AAGGCCATGTGGAAGATTTG-3'NM_174155

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行計(jì)算和整理，RT-qPCR試驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。利用SAS 9.0軟件的one-way ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1催乳素對(duì)BMECs增殖的影響

催乳素對(duì)BMECs RGR的影響見(jiàn)表2。100和300 ng/mL催乳素組RGR顯著高于對(duì)于其他各組(P<0.05)，500 ng/mL催乳素組顯著高于對(duì)照組和1 000 ng/mL催乳素組(P<0.05)，1 000 ng/mL催乳素組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2　催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2催乳素對(duì)BMECs乳脂合成的影響

催乳素對(duì)BMECs內(nèi)TAG含量的影響見(jiàn)表3。100和500 ng/mL催乳素能夠促進(jìn)BMECs內(nèi)TAG合成，但影響不顯著(P>0.05)；300ng/mL催乳素組與對(duì)照組相比顯著提高了TAG含量(P<0.05)；1 000 ng/mL催乳素組TAG含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3　催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

2.3催乳素對(duì)BMECs乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

催乳素對(duì)BMECs乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響見(jiàn)表4。與對(duì)照組相比，催乳素組ACC基因表達(dá)量升高，其中300和500 ng/mL催乳素組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；100 ng/mL催乳素組FASN基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，300和500 ng/mLFASN基因表達(dá)量高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；催乳素組SCD基因表達(dá)量隨催乳素濃度的增加呈先增加后下降趨勢(shì)，300 ng/mL催乳素組高于對(duì)照組，隨后降低，500和1 000 ng/mL催乳素組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)于DGAT基因的表達(dá)量而言，各催乳素組均高于對(duì)照組，其中300 ng/mL顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，添加100、300、500與1 000 ng/mL催乳素提高了SREBP-1的基因表達(dá)量，但統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著(P>0.05)；300 ng/mL催乳素組PPARγ的基因表達(dá)量高于100、500和1 000 ng/mL催乳素組(P<0.05)，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，500和1 000 ng/mL催乳素組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；300 ng/mL催乳素組FABP3基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組及其他催乳素組(P<0.05)。

表4　催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4催乳素對(duì)BMECs乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

催乳素對(duì)BMECs乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響見(jiàn)表5。隨著催乳素濃度的增加，mTOR基因表達(dá)量先增加隨后降低，100、300和500 ng/mL催乳素組顯著高于與對(duì)照組(P<0.05)；100 ng/mL催乳素組4EBP1和S6K1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而300、500和1 000 ng/mL催乳素組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著濃度的增加表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；100、300和500 ng/mL催乳素組STAT5基因表達(dá)量高于對(duì)照組，1 000 ng/mL催乳素組低于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)分析差異均不顯著(P>0.05)；各催乳素組AKT基因表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；300 ng/mL催乳素組CSN1S1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組與其他試驗(yàn)組(P<0.05)，100 ng/mL催乳素組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；300 ng/mL催乳素組CSN3基因表達(dá)量高于其他各組，但統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著(P>0.05)；100和300 ng/mL催乳素組PRLR基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而500和1 000 ng/mL催乳素組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

3　討　論

3.1催乳素對(duì)BMECs增殖的影響

在反芻動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，催乳素具有維持乳腺細(xì)胞數(shù)量及分化狀態(tài)的作用[18]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，低濃度(100～500 ng/mL)催乳素能夠促進(jìn)BMECs的增殖，而高濃度(1 000 ng/mL)催乳素對(duì)BMECs增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。有研究表明,長(zhǎng)期處于高濃度激素環(huán)境下對(duì)乳腺上皮細(xì)胞有損傷[19]，由于催乳素的濃度過(guò)大造成乳腺上皮細(xì)胞催乳素反應(yīng)性降低，PRLR基因表達(dá)量減少，進(jìn)而使催乳素作用減弱。田青等[20]研究表明，催乳素能顯著促進(jìn)BMECs增殖，在48 h之前，50 ng/mL的催乳素能起到很好的促細(xì)胞增殖效果，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，需要催乳素的濃度為500 ng/mL。本研究得出，催乳素濃度為100～500 ng/mL，BMECs的RGR較高，而更高劑量的催乳素會(huì)抑制BMECs的增殖活性，這與前人研究結(jié)果相一致。STAT5與AKT介導(dǎo)的信號(hào)通路有維持細(xì)胞生長(zhǎng)并保護(hù)細(xì)胞免受不同細(xì)胞凋亡因子影響的作用。從STAT5與AKT的基因表達(dá)量可看出，100～500 ng/mL催乳素組高于對(duì)照組，1 000 ng/mL催乳素組則低于對(duì)照組，這與細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果相一致。

表5　催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.2催乳素對(duì)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)及TAG合成的影響

乳品質(zhì)的形成與飼糧營(yíng)養(yǎng)水平及組成息息相關(guān)，是多基因共同作用的結(jié)果。乳汁中的酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、幾乎所有的短鏈和中鏈脂肪酸都由乳腺上皮細(xì)胞合成[21]，而乳腺上皮細(xì)胞的增殖、分化與泌乳功能主要受催乳素、糖皮質(zhì)激素和胰島素等多種激素的調(diào)節(jié)。Ma等[22]通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)使MAC-T細(xì)胞低表達(dá)SREBP-1基因，研究了SREBP-1基因?qū)χ舅岷铣蛇^(guò)程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，SREBP-1基因的低表達(dá)會(huì)降低脂肪酸的攝取和從頭合成過(guò)程；抑制SREBP-1基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致脂肪酸代謝相關(guān)基因ACC、FASN、FABP3、SCD的表達(dá)量降低。PPARγ有可能是SREBP-1活性在乳腺組織中的調(diào)節(jié)因子[23]。Kadegowd等[24]研究了PPARγ基因?qū)δ膛Ｈ橹铣傻恼{(diào)節(jié)作用，使用PPARγ激動(dòng)劑Rosiglitazone后，脂肪酸攝取基因(CD36)、脂肪酸內(nèi)源合成與轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(ACC、FASN、SREBP-1)和TAG合成基因(SCD)的表達(dá)量均上調(diào)，這表明PPARγ與SREBP-1在脂肪合成細(xì)胞調(diào)控因子通路中處于樞紐位置，可以通過(guò)結(jié)合其靶基因，影響脂肪酸的合成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，300 ng/mL催乳素組SREBP-1和PPARγ基因表達(dá)量高于對(duì)照組，由乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)量可以看出，SREBP-1和PPARγ基因的表達(dá)量升高會(huì)促進(jìn)脂肪酸代謝相關(guān)基因ACC、FABP3、DGAT的表達(dá)，這與前人研究結(jié)果相一致，也與本試驗(yàn)300 ng/mL催乳素顯著促進(jìn)BMECs內(nèi)TAG合成的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

ACC和FASN是乳脂合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，孫曉靜[25]研究發(fā)現(xiàn)，400 ng/mL催乳素顯著促進(jìn)ACC與FASN的表達(dá)。本試驗(yàn)研究表明，催乳素在100～500 ng/mL內(nèi)促進(jìn)ACC與FASN的表達(dá)，這與前人研究結(jié)果一致。SCD是催化飽和脂肪酸合成單不飽和脂肪酸的限速酶，F(xiàn)ABP3在奶牛乳腺組織中一個(gè)很重要的作用是為SCD提供脂肪酸[23]，DGAT可能是TAG合成的唯一限速酶，SCD對(duì)于中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸(C10～C16)的作用更加明顯，而DGAT對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸(≥C18)的作用更加明顯[26]，而這些脂肪酸成為T(mén)AG合成酶的底物。Bionaz等[24]在對(duì)奶牛乳腺乳脂合成相關(guān)的基因進(jìn)行定量分析后，發(fā)現(xiàn)SCDmRNA的豐度是所有檢測(cè)基因中最高的，而且高豐度的SCDmRNA與其他脂肪合成基因，如與ACC、FASNmRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究相符，300 ng/mL催乳素組ACC、FASN、SCD、DGAT、FABP3基因表達(dá)量均提高。Shao等[27]研究表明，催乳素顯著增加了乳腺組織中α-乳清蛋白和β-酪蛋白的基因表達(dá)量，并且極顯著提高了SREBP-1、FASN、ACC和SCD的基因表達(dá)量。本研究得出，100～300 ng/mL催乳素促進(jìn)了乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，而濃度過(guò)大反而抑制上述基因的表達(dá)。結(jié)果提示，催乳素能夠通過(guò)調(diào)控以PPARγ與SREBP-1為核心的乳脂合成相關(guān)的信號(hào)通路，調(diào)控脂肪酸合成關(guān)鍵酶及相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響TAG的分泌與脂肪的合成，這種調(diào)節(jié)作用具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。

3.3催乳素對(duì)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

乳蛋白的產(chǎn)出并不只依賴(lài)于氨基酸的供給和乳腺對(duì)氨基酸的攝取，同樣依賴(lài)于內(nèi)分泌激素。當(dāng)前，人們關(guān)注的重點(diǎn)是在基因轉(zhuǎn)錄水平上Janus激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和蛋白質(zhì)翻譯水平上mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)乳蛋白合成的調(diào)控作用。用體外培養(yǎng)的乳腺組織研究證實(shí)，與STAT5的結(jié)合對(duì)于激素誘導(dǎo)的酪蛋白基因表達(dá)是必須的[28]。高濃度或生理范圍的催乳素、生長(zhǎng)激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)均能提高體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織的STAT5-DNA結(jié)合活性[29]。

PRLR激活的JAK2-STAT5途徑能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞分化及乳蛋白基因表達(dá)，而STAT5能激活A(yù)KT在乳腺中特異表達(dá)。mTOR信號(hào)通路上游受到AKT磷酸化的正調(diào)節(jié)，下游可促進(jìn)S6K1和4EBP1的磷酸化，調(diào)節(jié)翻譯起始，這2條下游通路是2條平行的信號(hào)通路，分別控制特定亞基的mRNA翻譯過(guò)程。AKT調(diào)節(jié)脂肪合成主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SREBP-1通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并進(jìn)一步促進(jìn)SREBP-l靶基因ACC、FAS、FABP等的表達(dá)[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，100 ng/mL催乳素組促進(jìn)了JAK-STAT及mTOR信號(hào)通路中各正向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量，這與前人研究結(jié)果一致。

CSN1S1、CSN3是2個(gè)主要酪蛋白的基因，BMECs這2個(gè)基因表達(dá)水平與乳蛋白的合成有很強(qiáng)的相關(guān)性[31]。Boutinaud等[32]用催乳素抑制劑處理奶牛9周降低了PRLRmRNA表達(dá)水平，同時(shí)α-乳白蛋白和CSN3基因表達(dá)量也隨之降低。Burgos等[33]通過(guò)體外培養(yǎng)奶牛乳腺腺泡證實(shí)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素可能通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)控乳蛋白合成，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)補(bǔ)充糖皮質(zhì)激素、胰島素、催乳素能顯著促進(jìn)mTOR上游AKT的磷酸化。催乳素在刺激乳蛋白的合成的同時(shí)，也提高了mTOR底物S6K1和4EBP1的磷酸化水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明，300 ng/mL催乳素組CSN1S1及PRLR表達(dá)量高于對(duì)照組。結(jié)果提示，催乳素通過(guò)JAK-STAT5與磷酯酰肌醇-3(PI3)/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)體外培養(yǎng)BMECs乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，且100～300 ng/mL內(nèi)作用效果較好。

4　結(jié)　論

催乳素對(duì)乳脂和乳蛋白合成的調(diào)控有一定的劑量依賴(lài)關(guān)系，低濃度時(shí)隨著催乳素濃度的增加呈正向調(diào)控關(guān)系，100～300 ng/mL的濃度作用效果最好，而高濃度(1 000 ng/mL)的催乳素對(duì)奶牛乳腺乳脂和乳蛋白的合成有一定抑制作用。

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(責(zé)任編輯王智航)

, associate professor, E-mail: dkyldb@imau.edu.cn

Effects of Prolactin on Gene Expressions Involved in Milk Fat and Milk Protein Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

XING YuanyuanLI Dabiao*LI HongleiYU YongqiangWANG Weiyun

(College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

The aim of this study was to determine the effects of prolactin on gene expressions involved in milk fat and milk protein synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs). mammary epithelial cells of Chinese Holstein cows were used, after purification culture, different concentrations [0 (control), 100, 300, 500 and 1 000 ng/mL] of prolactin were added in culture medium for a 24 h cultivation. Cell viability was detected by thiazoly blue tetrazolium bramide (MTT); triglyceride (TAG) content was measured by using TAG determination kit; gene expressions involved in milk fat and milk protein synthesis were measured by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The results showed as follows: 1) 100 and 300 ng/mL prolactin significantly promoted the proliferation of BMECs compared with control and other experimental groups (P<0.05). 2) The content of TAG in BMECs and gene expressions of acetyl-CoA carboxylase (ACC), diacylgycerol acyltransferase (DGAT), fatty acid-binding protein 3 (FABP3) were significantly higher in 300 ng/mL prolactin group compared with those in control group (P<0.05), and gene expressions of stearoyl-coenzyme A desaturase (SCD) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) tended to be higher. 3) Compared with control group, 100 and 300 ng/mL prolactin significantly upregulated gene expressions of mammalian target of rapamycin (mTOR) and prolactin receptor (PRLR) (P<0.05), and 300 ng/mL prolactin significantly upregulated αS1 casein (CSN1S) gene expression (P<0.05). In conclusion, 100 to 300 ng/mL prolactin is an optimal level considering its improvement effects on milk fat and milk protein synthesis.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2439-2447]

bovine mammary epithelial cells; prolactin; cell viability; triglyceride; genes related in milk fat and milk protein synthesis

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.015

2016-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360559)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉胖С钟?jì)劃”(NJYT-14-B05)

邢媛媛(1991—)，女，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn)人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理及瘤胃微生態(tài)研究。E-mail： xingyuanyuan2014@163.com

李大彪，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： dkyldb@imau.edu.cn

S826

A

1006-267X(2016)08-2439-09