張　霞　孫海洲　?！〉ぁ≮w存發(fā)　李勝利艷　城　凌樹禮　珊　丹　任曉萍

(1.內(nèi)蒙古富源牧業(yè)有限責(zé)任公司，呼和浩特010070；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031)

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飼糧營養(yǎng)水平對絨山羊小腸感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量、血液理化指標(biāo)及激素含量的影響

張霞1,2孫海洲2*桑丹2趙存發(fā)2李勝利2艷城2凌樹禮2珊丹2任曉萍2

(1.內(nèi)蒙古富源牧業(yè)有限責(zé)任公司，呼和浩特010070；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031)

本試驗(yàn)旨在適當(dāng)降低飼糧氮水平條件下，通過飼糧添加N-氨甲酰谷氨酸(NCG)及小腸灌注葡萄糖，研究其對絨山羊小腸感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量、血液理化指標(biāo)及激素含量的影響。選用27只體況良好、裝有永久性瘤胃和十二指腸瘺管的內(nèi)蒙古白絨山羊羯羊，按年齡和體重相近原則隨機(jī)分成9組，每組3只。飼糧分為3個(gè)處理：低氮[粗蛋白質(zhì)(CP)10.5%]、低氮+NCG(0.20 g/d)和高氮(CP 13.5%)；每個(gè)處理的山羊分別進(jìn)行3個(gè)水平的十二指腸葡萄糖灌注：0、20和40 g/d。飼養(yǎng)試驗(yàn)(15 d預(yù)試期、15 d正試期)結(jié)束后，屠宰取空腸和十二指腸組織，通過實(shí)時(shí)定量PCR法測定營養(yǎng)感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量，測定血液理化指標(biāo)、血清和空腸相關(guān)激素含量。結(jié)果表明：1)在基礎(chǔ)飼糧條件(無葡萄糖灌注)下，隨著飼糧氮水平的下降，空腸和十二指腸鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(SGLT1)的mRNA相對表達(dá)量，血漿尿素氮、葡萄糖含量，血清瓜氨酸、胰島素含量，血清和空腸胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽2(GLP-2)和促胰島素肽(GIP)含量減少，而空腸和十二指腸溶質(zhì)載體家族7成員9(SLC7A9)、溶質(zhì)載體家族7成員1(SLC7A1)的mRNA相對表達(dá)量增加。2)增加適宜過瘤胃葡萄糖后，隨著飼糧氮水平的下降，SGLT1、味覺受體1型1、味覺受體1型2、味覺受體1型3 mRNA相對表達(dá)量呈增加趨勢。3)低氮飼糧條件下灌注20 g/d葡萄糖,額外飼喂NCG能夠緩解飼糧氮水平降低引起的空腸和十二指腸SGLT1 mRNA相對表達(dá)量，血漿尿素氮、葡萄糖含量，血清瓜氨酸含量，血清和空腸GLP-1、GLP-2和GIP含量的下降。結(jié)果提示，適當(dāng)降低飼糧氮水平，補(bǔ)飼NCG和增加過瘤胃葡萄糖(十二指腸灌注20 g/d)對絨山羊機(jī)體代謝及腸道營養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)均有促進(jìn)作用。

山羊；腸道營養(yǎng)感應(yīng)因子；葡萄糖；N-氨甲酰谷氨酸

腸道的耗氧量占整個(gè)機(jī)體的25%，是動(dòng)物消化食物、吸收營養(yǎng)的主要場所；是一個(gè)可以調(diào)節(jié)控制胃腸道功能的獨(dú)立整合系統(tǒng)，故有“第二大腦”之稱。同時(shí)，腸道也被作為化學(xué)傳感接口，負(fù)責(zé)將胃腸道管腔環(huán)境生成的信息傳遞到大腦和身體的其余各個(gè)部分[1]。早在1964年，Mcintyre等[2]發(fā)現(xiàn)口服葡萄糖比靜脈注射更能有效地提高血漿胰島素(INS)含量，從而證實(shí)胃腸道在感應(yīng)和傳導(dǎo)營養(yǎng)信號中起到積極作用。Lam等[3]提出了“胃腸化學(xué)感應(yīng)”，指出其直接研究的意義是提高動(dòng)物采食量，增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，提高腸道的屏障功能，促進(jìn)腸道健康，從而綜合提高家畜生產(chǎn)力[4]。

飼糧中碳水化合物在小腸主要是以葡萄糖的形式吸收并利用。葡萄糖從小腸運(yùn)送到血液主要是通過2條途徑：主動(dòng)運(yùn)輸和易化擴(kuò)散[5]。主動(dòng)運(yùn)輸?shù)耐緩绞侵肝挥谀c上皮細(xì)胞刷狀緣膜上的鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(SGLT1)通過位于基底外側(cè)的鈉/鉀-ATP酶(Na+/K+-ATPase)所維持的電化學(xué)梯度，偶聯(lián)葡萄糖或半乳糖和水，將2分子的鈉從細(xì)胞腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中[6]。異化擴(kuò)散途徑是位于頂膜和基底外側(cè)膜的一種對葡萄糖具有低親和力的葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(GLUT2)來完成的[7]。

此外，存在于口腔中的味覺感應(yīng)器于2002年在腸道中發(fā)現(xiàn)并首次報(bào)道[8]。味覺感應(yīng)器是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的2個(gè)類型，即味覺受體1型(T1R)和味覺受體2型(T2R)[9-10]。甜味感應(yīng)器是由T1R家族中的2個(gè)成員T1R2和T1R3以異源二聚體的形式組成，主要用于檢測腸道中單糖(如葡萄糖、半乳糖和果糖)[11]。而T1R1和T1R3以異源二聚體的形式用于感應(yīng)鮮味(咸味)，由于此二聚體形式可識別谷氨酸產(chǎn)生的“鮮味”，故可用于識別腸道中可利用的L-氨基酸[12]。T2R家族是苦味感應(yīng)家族，至少由30個(gè)GPCR成員組成。甜味、鮮味和苦味感受器是通過GPCR的α-味導(dǎo)素(α-gustducin)來聯(lián)系，并在A、K和L細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)[9-10]，通過分泌相關(guān)激素[胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽2(GLP-2)、膽囊收縮素(CCK)等]促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

目前，低氮養(yǎng)殖理念已逐步深入到畜禽養(yǎng)殖中，但由于反芻動(dòng)物較復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)，使其在該領(lǐng)域相關(guān)研究進(jìn)展相對較慢。而在碳水化合物對飼糧的調(diào)控技術(shù)研究和功能性氨基酸研究的層次從單一化到多方位的提升的過程中，關(guān)于飼糧中蛋白質(zhì)(氨基酸)和葡萄糖互作對機(jī)體代謝的影響的基礎(chǔ)性研究顯得尤為重要。為此，本試驗(yàn)通過測定不同氮及葡萄糖水平且添加N-氨甲酰谷氨酸(NCG)的飼糧對絨山羊血液理化指標(biāo)及相關(guān)激素含量的影響，并通過實(shí)時(shí)定量PCR就絨山羊小腸中營養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行測定，旨在研究低氮水平下添加NCG并灌注適量的葡萄糖對絨山羊小腸葡萄糖吸收的影響，從而合理配制飼糧，減少資源浪費(fèi)，降低飼糧成本。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

1.1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用27只體況良好，體重為(50.07±5.97) kg有永久性瘤胃瘺管和十二指腸瘺管的內(nèi)蒙古白絨山羊半同胞羯羊，按年齡和體重相近的原則隨機(jī)分為9組，每組3只。飼糧分為3個(gè)處理：低氮[粗蛋白質(zhì)(CP)10.5%]、低氮+NCG(0.20 g/d[13-14])和高氮(CP 13.5%)，分別記作LN、LN+NCG、HN；每個(gè)處理的山羊分別進(jìn)行3個(gè)水平的十二指腸葡萄糖灌注：0、20和40 g/d，分別記作0 g/d G、20 g/d G和40 g/d G。試驗(yàn)操作流程參考本團(tuán)隊(duì)前期的研究論文[15-18]。

試驗(yàn)飼糧配制參照NRC(2007)[19]，其組成及其營養(yǎng)水平見表1。NCG購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，并由北京菲迪飼料科技有限責(zé)任公司進(jìn)行過瘤胃包被處理(過瘤胃保護(hù)率≥92%)。

1.1.2飼養(yǎng)管理

將稱重后的試驗(yàn)羊只放入飼養(yǎng)籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，于每日在07:00和16:00先粗后精等量飼喂2次，自由飲水。準(zhǔn)確記錄每日試驗(yàn)羊只的采食量和剩料量，試驗(yàn)預(yù)試期和正試期均為15 d。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1血清、血漿樣品采集

連續(xù)采集正試期的第8～10天試驗(yàn)羊只血樣，每天08：00由頸靜脈采血20 mL，其中10 mL緩慢注入涂有肝素(750 IU)的離心試管(始終置于冰盒)中，在30 min內(nèi)，于4 ℃ 2 000×g條件下離心15 min分離血漿樣本，制備樣品置于-25 ℃保存，待測血漿葡萄糖、尿素氮含量。另采取的10 mL血液于試管中，在離心力為4 500×g的離心機(jī)離心10 min，制備血清樣品，吸取血清至離心管中，加蓋冷藏(-20 ℃保存),待測血清GLP-1、GLP-2、葡萄糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)和CCK、胰島素和瓜氨酸(citrulline)的含量。結(jié)果為3 d平均值。

表1　試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kilogram of premix contains the following：Fe(FeSO4·7H2O)170 g，Cu(CuSO4·5H2O)70 g，Mn(MnSO4·5H2O)290 g，Zn(ZnSO4·7H2O)240 g，Co(CoCl2·6H2O)510 mg，KI 200 mg，NaSeO3130 mg，VA 620 000 IU，VD3324 000 IU，VE 540 IU，VK3150 mg，VB120.9 mg，VB5450 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 750 mg，葉酸 folic acid 15 mg。

2)營養(yǎng)水平均為計(jì)算值，方法參考英國AFRC(1993)及美國Feedstuff飼料成分分析表(2007版)[20-21]；非結(jié)構(gòu)性碳水化合物=1-中性洗滌纖維-粗蛋白質(zhì)-粗脂肪-粗灰分。Nutrient levels were measured in reference to AFRC(1993, British) andFeedstuffsIngredientAnalysisTableinFeedstuff，2007 ed. (USA); NFC=1-NDF-CP-EE-ash.

1.2.2測定腸道組織激素時(shí)的樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)試驗(yàn)組選取具有代表性的1只羊進(jìn)行屠宰，取近空腸中段約10 cm，用溫生理鹽水沖洗干凈后，迅速將空腸分為長度約2 cm的腸段放入凍存管中，存于-80 ℃冰箱，測定相關(guān)激素含量時(shí)，取空腸組織樣品，制成組織勻漿，測定GLP-1、GLP-2、GIP、CCK含量。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR樣品采集

按照實(shí)時(shí)定量PCR樣品測定時(shí)樣品采集的方法，切開腹腔取出全部小腸,剪開腸系膜,將部分十二指腸、空腸前段剖開腸管，之后并用溫生理鹽水沖洗干凈,迅速分裝后放于液氮保存，以備測定。之后分別測定不同組別羊只空腸和十二指腸中堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體[溶質(zhì)載體家族7成員9(SLC7A9)、溶質(zhì)載體家族7成員1(SLC7A1)]、小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(SGLT1、GLUT2)及營養(yǎng)感應(yīng)因子(T1R1、T1R2、T1R3)的mRNA的相對表達(dá)量。

1.3樣品分析

1.3.1血漿葡萄糖含量

血漿葡萄糖含量使用全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼-庫爾特公司)進(jìn)行測定。

1.3.2血清胰島素和瓜氨酸，血清和空腸GLP-1、GLP-2、GIP、CCK含量

血清中GLP-1、GLP-2、GIP、CCK、胰島素測定采用ELISA法測定，試劑盒由北京鑫方程生物技術(shù)有限公司提供。空腸組織樣品中GLP-1、GLP-2、GIP、CCK測定，需要將空腸組織樣品進(jìn)行組織勻漿[每1 g樣品加入9 mL磷酸緩沖鹽溶液(pH為7.4)，稀釋倍數(shù)為10倍]后，按照測定血清中該指標(biāo)方法進(jìn)行。血清中瓜氨酸的含量亦采用ELISA法測定，試劑盒由江萊化學(xué)科技(上海)有限公司提供。

1.4試驗(yàn)儀器及試劑

酶標(biāo)儀(芬蘭，Labsystems Multiskan MS，352)；洗板機(jī)(芬蘭，Thermo Labsystems， AC8)；離心機(jī)(微量高速離心機(jī)，TG16W)；培養(yǎng)箱(隔水式恒溫培養(yǎng)箱，GNP-9080)；高速冷凍離心機(jī)(德國，Eppendorf，5417)；微量紫外分光光度計(jì)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司，Biodropsis)；低溫離心機(jī)(德國，Eppendorf，5810)；PCR儀(美國，Illumina Eco)；凝膠成像系統(tǒng)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國，ABI，MP3005)；超低溫冰箱(美國，Thermo Forma)。

反轉(zhuǎn)錄RCR、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、Ex-Taq預(yù)混Mix均由日本TaKaRa公司生產(chǎn)；未特殊說明

的試劑均為分析純。

1.5引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的SLC7A9(XM_005692243.1)、SLC7A1(XM_005687542.1)、SGLT1(NM_001009404.1)、GLUT2(XM_004003162.1)以及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA序列均由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)并合成，營養(yǎng)感應(yīng)因子T1R1(XM_005690745.1)、T1R2(Gene ID:102171940)、T1R3(XM_005690861.1)利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表2。

表2　引物信息

1.6樣品總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法提取空腸和回腸的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測得A260/A280值在1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳法評價(jià)總RNA的質(zhì)量。參照PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟將樣品總RNA都以相同濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系總體積為25 μL：5×PrimeScript Buffer 5 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1.25 μL，Oligo dT Primer 1.25 μL，Random Primer 1.25 μL，總RNA 2.5 μL， RNase-free water 13.75 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.7實(shí)時(shí)定量PCR

參照TaKaRa試劑盒說明書，采用反應(yīng)采用兩步法，其條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。獲取各個(gè)基因每個(gè)樣品的閾值循環(huán)(Ct)，每個(gè)基因樣品做3個(gè)重復(fù)。以GAPDH基因作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR獲取各基因達(dá)到熒光閾值所對應(yīng)的Ct，采用2-△△Ct法計(jì)算出目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.0軟件的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05作為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01作為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1空腸和十二指腸基因相對表達(dá)量

由表3可知，基礎(chǔ)飼糧條件(0 g/d G)下，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量呈現(xiàn)的規(guī)律如下：1組和4組山羊空腸中SGLT1的mRNA相對表達(dá)量顯著低于7組(P<0.05)，而這2組間差異不顯著(P>0.05)；而就GLUT2的mRNA相對表達(dá)量而言，空腸中4組顯著高于7組和1組(P<0.05)，而后2組間差異不顯著(P>0.05)。而相比之下，堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的規(guī)律性更為明顯，1組和4組的SLC7A1和SLC7A9 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于7組(P<0.05)。1組和4組空腸中營養(yǎng)感應(yīng)因子T1R1和T1R3 mRNA相對表達(dá)量顯著高于7組(P<0.05)，各組間空腸中T1R2 mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

基礎(chǔ)飼糧條件下，山羊過瘤胃葡萄糖增加20 g/d(20 g/d G)時(shí)，2組和5組空腸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1和GLUT2的mRNA相對表達(dá)量均顯著高于8組(P<0.05)。就堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體而言，2組和5組空腸中的SLC7A9 mRNA相對表達(dá)量顯著高于8組(P<0.05)；5組空腸中SLC7A1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于2組和8組(P<0.05)，且后2組間差異不顯著(P>0.05)?？漳c中各營養(yǎng)感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量沒有呈現(xiàn)一致的規(guī)律性。

基礎(chǔ)飼糧條件下，山羊過瘤胃葡萄糖增加40 g/d(40 g/d G)時(shí)，3組和6組空腸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1的mRNA相對表達(dá)量顯著高于9組(P<0.05)；而3組和6組中的GLUT2的mRNA相對表達(dá)量卻顯著低于9組(P<0.05)。而3組、6組氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量都顯著高于9組(P<0.05)。對于空腸中營養(yǎng)感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量，3組和6組中T1R1和T1R3 mRNA相對表達(dá)量顯著高于9組(P<0.05)；而各組間空腸中T1R2 mRNA相對表達(dá)量與T1R1和T1R3變化規(guī)律不一致。

由表4可知，基礎(chǔ)飼糧條件下，1組和4組中山羊十二指腸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1 mRNA相對表達(dá)量總體呈現(xiàn)顯著低于7組(P<0.05)，而這2組間差異不顯著(P>0.05)；而就GLUT2 mRNA相對表達(dá)量而言，十二指腸中1組顯著高于4組和7組(P<0.05)。十二指腸中堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體及營養(yǎng)感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量呈現(xiàn)一致的規(guī)律性，即：1組和4組高于7組。

基礎(chǔ)飼糧條件下，山羊過瘤胃葡萄糖增加20 g/d時(shí)，十二指腸中2組和5組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1的mRNA相對表達(dá)量顯著高于8組(P<0.05)；GLUT2結(jié)果卻相反，8組高于2組和5組。堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體及營養(yǎng)感應(yīng)因子mRNA在十二指腸中相對表達(dá)量的結(jié)果呈現(xiàn)一致性，即：5組顯著高于2組和8組(P<0.05)。

基礎(chǔ)飼糧條件下，山羊過瘤胃葡萄糖增加40 g/d時(shí)，3組十二指腸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT2 mRNA相對表達(dá)量顯著低于9組(P<0.05)。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體3組、6組、9組間無顯著差異(P>0.05)。營養(yǎng)感應(yīng)因子T1R1、T1R2、T1R3 mRNA相對表達(dá)量6組顯著高于3組、9組(P<0.05)。

2.2血液理化指標(biāo)

由表5可知，基礎(chǔ)飼糧條件下，4組的血漿尿素氮含量顯著低于1組和7組(P<0.05)，后2組間差異不顯著(P>0.05)；1組和4組血清瓜氨酸含量都有低于7組的趨勢，組間差異不顯著(P>0.05)；而4組和7組血漿葡萄糖含量呈現(xiàn)高于1組的趨勢，組間差異不顯著(P>0.05)；且4組和7組血清胰島素含量顯高于1組(P<0.05)。

而1組和4組間相比而言，4組中血漿葡萄糖、血清胰島素含量較1組高，說明低氮水平飼喂條件下添加NCG后能促進(jìn)糖異生作用加強(qiáng)，這可能是由于NCG的添加促進(jìn)了精氨酸族氨基酸的合成，從而使血漿葡萄糖和胰島素都有所上調(diào)。

基礎(chǔ)飼糧條件下，山羊過瘤胃葡萄糖增加20或40 g/d時(shí)，2組、3組、5組和6組血漿葡萄糖和血清胰島素含量都高于1組和4組，可能是由于外源葡萄糖灌注提高了血漿葡萄糖含量，進(jìn)而導(dǎo)致血清胰島素含量也隨之升高。

表3　飼糧營養(yǎng)水平對山羊空腸各基因mRNA相對表達(dá)量的影響

相同葡萄糖水平、同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。表4同。

In the same column, a comparison was made between different level of G perfusion. Values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as Table 4.

表4　飼糧營養(yǎng)水平對山羊十二指腸各基因mRNA相對表達(dá)量的影響

續(xù)表4組別Groups處理Treatments鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1SGLT1葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體2GLUT2溶質(zhì)載體家族7成員1SLC7A1溶質(zhì)載體家族7成員9SLC7A9味覺受體1型1T1R1味覺受體1型2T1R2味覺受體1型3T1R38HN+20g/dG1.00±0.05b1.00±0.03a1.00±0.06b1.00±0.09b1.00±0.09b1.00±0.07c1.00±0.04b3LN+40g/dG0.67±0.140.82±0.11b0.99±0.140.94±0.051.03±0.14b0.87±0.10c0.61±0.06c6LN+NCG+40g/dG0.88±0.080.95±0.04ab1.22±0.110.84±0.153.42±0.27a1.29±0.04a1.19±0.07a9HN+40g/dG1.00±0.051.00±0.06a1.00±0.091.00±0.011.00±0.12b1.00±0.08b1.00±0.04b

表5　飼糧營養(yǎng)水平對山羊血液理化指標(biāo)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.3空腸和血清激素含量

由表6可知，基礎(chǔ)飼糧條件下，與7組相比，1組和4組空腸GLP-1和GLP-2的含量顯著降低，即隨飼糧氮水平升高空腸GLP-1和GLP-2含量降低(P<0.05)。就空腸GIP和CCK的含量而言，并未隨著飼糧氮水平的變化而呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。

山羊過瘤胃葡萄糖增加20和40 g/d時(shí)，2組和3組的空腸GLP-1和GLP-2的含量都顯著高于1組(P<0.05)，而5組和6組GLP-1和GLP-2的含量也顯著高于4組(P<0.05)。然而3組和6組結(jié)果卻分別低于2組和5組。同樣CCK和GIP的含量仍未隨著葡萄糖灌注含量的變化而呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。

3　討　論

3.1飼糧營養(yǎng)水平對絨山羊營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體與腸道感應(yīng)因子mRNA相對表達(dá)量的影響

T1R2/T1R3這一異源二聚體用于感受腸道糖類和人工甜味劑的功能受體，可以檢測腸道中可利用的葡萄糖，同樣對于胃腸道中的GLP-1、酪酪肽(PYY)的分泌也有促進(jìn)作用。研究結(jié)果表明，在高葡萄糖情況下，作為的甜味受體T1R2/T1R3可促進(jìn)腸上皮頂膜GLUT2的表達(dá)，從而提高葡萄糖的吸收能力，且位于小腸腸腔中的葡萄糖可以激活腸內(nèi)分泌細(xì)胞(EEC)的T1R2和T1R3，同時(shí)引起GLP-1的釋放[22]。EEC激素通過上調(diào)SGLT1表達(dá)和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞頂端GLUT2表達(dá)從而影響葡萄糖吸收。因此，高碳水化合物飼糧和甜味劑能上調(diào)依賴于味蕾組織中的一種G蛋白(Gg)和T1R1的SGLT1的表達(dá)[23]。

表6　飼糧營養(yǎng)水平對山羊空腸和血清激素含量的影響

本試驗(yàn)中，基礎(chǔ)飼糧條件下，山羊十二指腸中灌注20和40 g/d葡萄糖時(shí)，山羊空腸和十二指腸中營養(yǎng)感應(yīng)因子T1R2和T1R3 mRNA相對表達(dá)量整體呈增加的趨勢。同時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1 mRNA相對表達(dá)量也相應(yīng)有所提高，此結(jié)論與上述研究結(jié)果相似。但是，GLUT2的變化卻并沒有呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，與上述結(jié)果不同，該不一致性可能由于動(dòng)物類別的不同所致。如相關(guān)研究稱，在高葡萄糖飼糧條件下，大鼠腸道內(nèi)頂膜上GLUT2表達(dá)量會增加，但迄今為止，同樣的高糖飼糧條件下卻沒有引起山羊頂膜上GLUT2表達(dá)量的增加[24]。

在動(dòng)物的飼糧中，攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，并非所有的蛋白質(zhì)都要水解為游離的氨基酸才能被機(jī)體所利用，許多蛋白質(zhì)的代謝物都能直接通過胃腸道黏膜進(jìn)入體循環(huán)。然而，此過程的實(shí)現(xiàn)需要蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物的感應(yīng)受體和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的介導(dǎo)。堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體是飼糧中的堿性氨基酸從腸腔進(jìn)入腸細(xì)胞及循環(huán)系統(tǒng)的主要通路，通過調(diào)節(jié)腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)量從而為機(jī)體提供充足的氨基酸，此途徑是避免腸道吸收障礙的有效方法之一。近年來，相關(guān)報(bào)道指出飼糧氮水平或蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物如氨基酸類通過復(fù)雜代謝通路調(diào)節(jié)氨基酸載體轉(zhuǎn)運(yùn)[25-26]，這主要是說明蛋白質(zhì)及其代謝產(chǎn)物激活了蛋白質(zhì)和肽類感應(yīng)器，從而使得EEC釋放相關(guān)激素(CCK、GLP-1)，最終刺激氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性從而促進(jìn)小腸對氨基酸的吸收代謝。

T1R1/T1R3是一種異二聚體膜受體，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)及其代謝物的感應(yīng)受體，又因T1R1/T1R3能識別谷氨酸產(chǎn)生的“鮮味”，故又被稱為“鮮味感應(yīng)器”[12]。目前研究表明，該受體能夠感應(yīng)20種L-氨基酸，但是不同物種體內(nèi)的感受器對于氨基酸的種類是有特異性反應(yīng)的。如鼠T1R1/T1R3對20種L-氨基酸都有反應(yīng),但人T1R1/T1R3只選擇性地對谷氨酸鈉(MSG)和天冬氨酸(Asp)有反應(yīng)。

NCG是N-乙酰谷氨酸(NAG)的類似物，可參與到動(dòng)物體內(nèi)尿素循環(huán)。研究表明，NCG可以促進(jìn)谷氨酰胺或脯氨酸合成瓜氨酸，進(jìn)而促進(jìn)精氨酸的合成[27]，NCG因此也被稱為精氨酸的內(nèi)源激活劑。本試驗(yàn)在低氮飼糧中添加NCG來研究功能性氨基酸對腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和營養(yǎng)感應(yīng)因子表達(dá)的影響得到了較為滿意結(jié)果。本試驗(yàn)中，基礎(chǔ)飼糧水平下，在LN+NCG處理的山羊的十二指腸和空腸中營養(yǎng)感應(yīng)因子T1R1和T1R3的mRNA相對表達(dá)量整體呈現(xiàn)高于LN處理的趨勢。需要指出的是本試驗(yàn)只是就單一感應(yīng)因子的mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，而動(dòng)物體內(nèi)的鮮味感受器是以異源二聚體的形式才能發(fā)揮作用，此外，T1R3不僅是鮮味感受器的成分之一，同樣也是腸道中甜味受體(T1R2/T1R3)中成員之一，所以本試驗(yàn)結(jié)果只能初步判斷NCG的添加對感應(yīng)因子的表達(dá)量有一定的影響，倘若需要更加準(zhǔn)確判定，則需結(jié)合其他手段(如免疫組化法)和其他指標(biāo)(如小腸上皮內(nèi)分泌細(xì)胞釋放的相關(guān)激素)協(xié)助完成，本試驗(yàn)并未進(jìn)行詳細(xì)論斷。本試驗(yàn)結(jié)果同樣也顯示，LN和LN+NCG處理十二指腸和空腸中的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SLC7A1和SLC7A9 mRNA相對表達(dá)量整體呈現(xiàn)高于HN處理的趨勢，這主要是由于降低山羊飼糧氮水平可以促進(jìn)山羊體內(nèi)內(nèi)源氮的合成[28]，而且與減少飼糧氮水平能促進(jìn)山羊氮代謝的結(jié)果相吻合。而這2個(gè)處理中LN+NCG處理在十二指腸和空腸中SLC7A1和SLC7A9 mRNA相對表達(dá)量都高于LN處理，這主要是因?yàn)楦袘?yīng)因子T1R1和T1R3 mRNA相對表達(dá)量增加所致，作為“鮮味感應(yīng)器”的T1R2/T1R3可以通過氨基酸的刺激而激活，從而促使EEC釋放CCK和GLP-1等相關(guān)激素，而將信號傳導(dǎo)到氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，從而使得氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)量也隨之增加。

3.2飼糧營養(yǎng)水平對絨山羊血液理化指標(biāo)及空腸和血清激素含量的影響

本試驗(yàn)通過測定血漿葡萄糖和血清胰島素的含量來粗略地推斷飼喂不同氮水平、十二指腸葡萄糖不同灌注水平及NCG添加對山羊葡萄糖代謝的影響。反芻動(dòng)物體內(nèi)的血漿葡萄糖主要受肝臟糖異生的作用來調(diào)節(jié)，動(dòng)物采食的飼糧對血漿葡萄糖含量的調(diào)節(jié)是屬于次要的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，十二指腸中灌注葡萄糖時(shí)，LN、LN+NCG處理山羊血漿葡萄糖和血清胰島素含量都呈低于HN處理的趨勢，這可能主要是由于肝臟糖異生作用的減弱[29]。在低氮飼糧飼喂體系中，糖異生作用的減弱主要是基于非必需氨基酸的減少，如瓜氨酸[30]。本試驗(yàn)中，基礎(chǔ)飼糧條件下，LN和LN+NCG處理中的血清瓜氨酸含量呈現(xiàn)低于HN處理的趨勢。此結(jié)果進(jìn)一步說明上述推斷是可能的。眾所周知，瓜氨酸不僅與尿素合成途徑有關(guān)，而且也參與機(jī)體的糖異生途徑。大幅降低大鼠飼糧氮水平，其肝臟中瓜氨酸的合成量明顯下降；同時(shí)，大鼠血液葡萄糖和胰島素含量也呈相應(yīng)的下降趨勢[31-32]。此結(jié)論與人類食用嚴(yán)重缺乏蛋白質(zhì)飲食時(shí)Lariviere等[33]的研究結(jié)果相一致。本試驗(yàn)中，分別在山羊十二指腸中灌注0、20和40 g/d的3個(gè)不同水平的葡萄糖，十二指腸灌注20和40 g/d葡萄糖時(shí)，2組和5組血漿葡萄糖和血清胰島素含量整體呈現(xiàn)高于8組的趨勢。推斷得出，隨著飼糧氮水平的降低，血漿中氨基酸的含量也隨之減少，因而對絨山羊糖異生作用產(chǎn)生負(fù)面影響，而使得血漿葡萄糖含量下降，那么依賴葡萄糖的相關(guān)激素分泌也相應(yīng)減少。而在低氮飼糧中添加NCG后可有效提高血漿氨基酸和相關(guān)激素的含量，進(jìn)一步證實(shí)NCG可以促進(jìn)機(jī)體非必需氨基酸的合成。

研究證實(shí)，甜味劑(葡萄糖、蔗糖和三氯蔗糖)以劑量依賴方式對腸道內(nèi)分泌細(xì)胞株NCI-716 GLP釋放有促進(jìn)作用。同時(shí)腸道中GLP-1的釋放依賴于SGLT1的參與[34]。在敲除T1R3基因大鼠的飼糧中添加甜味劑后，并沒有引起GLP-1和GIP的分泌[23,35]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌注20和40 g/d葡萄糖后HN、LN和LN+NCG處理中的血清GLP-1含量都較基礎(chǔ)飼糧水平下升高，且LN+NCG+20 g/d G處理為最高。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，一方面可能是由于小腸葡萄糖中含量升高時(shí)，使得血漿葡萄糖含量上升，因而葡萄糖依賴性激素(GLP-1和GLP-2)也隨之增加，而另一方面可能是由于該處理中山羊小腸中的SGLT1和T1R3 mRNA相對表達(dá)量最高所致。綜合得出，低氮飼糧條件下，十二指腸中灌注葡萄糖可以緩解血漿葡萄糖含量的下降。然而，過量灌注葡萄糖后對機(jī)體依賴葡萄糖的相關(guān)激素的含量并未顯著上升，這可能是由于機(jī)體并不能完全吸收過量的過瘤胃葡萄糖，但是適宜灌注葡萄糖可以改善低氮對機(jī)體代謝的影響。且增加適宜的過瘤胃葡萄糖后，添加NCG的對血漿葡萄糖、GLP-1、GLP-2的影響更為明顯。

蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物是CCK釋放強(qiáng)烈的刺激因子，蛋白質(zhì)對CCK刺激作用遠(yuǎn)比碳水化合物更為明顯[36]。蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物(如肽類和氨基酸)刺激胃腸道“鮮味感應(yīng)器”后，引起味覺細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，導(dǎo)致CCK、PYY和GLP的釋放，而這些胃腸激素可以激活迷走神經(jīng)和相應(yīng)的靶細(xì)胞[37]。然而，本文中的結(jié)果卻并未與此結(jié)論相吻合，CCK含量并未因飼糧氮水平、葡萄糖灌注水平的變化或NCG的添加而呈現(xiàn)一定的規(guī)律。該結(jié)果可能是由于CCK主要是在十二指腸分泌的，而本試驗(yàn)中所測定的是空腸組織中的含量，而關(guān)于該方面的研究目前尚未定論。

4　結(jié)　論

適當(dāng)降低飼糧氮水平，補(bǔ)飼NCG和增加過瘤胃葡萄糖(十二指腸灌注20 g/d)對絨山羊機(jī)體代謝及腸道營養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)均有促進(jìn)作用。

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(責(zé)任編輯王智航)

, professor, E-mail: sunhaizhou@china.com

Effects of Dietary Nutrient Level on mRNA Relative Expression Levels of Nutrient Sensing Factors, Blood Physiochemical Indexes and Hormone Contents of Cashmere Goats

ZHANG Xia1,2SUN Haizhou2*SANG Dan2ZHAO Cunfa2LI Shengli2YAN Cheng2LING Shuli2SHAN Dan2REN Xiaoping2

(1. Inner Mongolia Fuyuan Farming Co., Ltd., Hohhot 010070, China; 2. Institute of Animal Nutrition and Feed,Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China)

To study the effects of N-carbamylglutamic acid (NCG) supplementation and intestinal infusion of glucose on mRNA relative expression levels of nutrient sensing factors, blood physiochemical indexes and hormone contents of cashmere goats under the condition of decreasing dietary nitrogen level. Twenty seven healthy Inner Mongolia cashmere wethers with permanent rumen fistula and duodenal cannulas were used. In accordance with the principle of similar age and body weight, twenty seven goats were divided into nine groups with three goats per group. There were 3 dietary treatments, which were low nitrogen [crude protein (CP) 10.5%]， low nitrogen +NCG (0.20 g/d) and high nitrogen (CP 13.5%); meanwhile, goats in each treatment were infused glucose at 3 levels, which were 0, 20 and 40g/d. After feeding experiment (15 d of pre-experiment and 15 d of formal experiment), goats were slaughtered to collect jejunum and duodenum tissues, the mRNA relative expression levels of intestinal nutrient sensing factor were determined by real-time PCR method, and blood physiochemical indexes, and serum and jejunal hormone contents were determined. The results showed as follows: 1) under the condition of basal diet (without glucose infusion), with the decrease of dietary nitrogen level, the mRNA relative expression level of sodium-glucose cotransporter 1 (SGLT1) in jejunum and duodenum, plasma urea nitrogen (UN) and glucose contents, serum citrulline and insulin contents, and serum and jejunal contents of glucagon-likepeptide 1 (GLP-1), glucagon-likepeptide 2 (GLP-2) and glucose insulinotropic peptide (GIP) were declined, but the mRNA relative expression levels of solute carrier family 7 member 9 (SLC7A9) and solute carrier family 7 member 1 (SLC7A1) were increased. 2) After increase proper amount glucose, with the decease of dietary nitrogen level, the mRNA relative expression levels ofSGLT1, taste 1 receptor member 1 (T1R1), taste 1 receptor member 2 (T1R2) and taste 1 receptor member 3 (T1R3) tended to be increased. 3) Under the condition of low dietary nitrogen level and 20 g/d glucose infusion, extra supplementation of NCG could help relieve the decrease of the mRNA relative expression level ofSGLT1 in jejunum and duodenum, plasma UN and glucose contents, serum citrulline content, and serum and jejunal contents of GLP-1, GLP-2 and GIP induced by the decreasing dietary nitrogen level. The results indicate that under the condition of decreasing dietary nitrogen level at proper extent, NCG supplementation and increasing rumen-passed glucose (duodenal infusion 20 g/d glucose) can improve metabolism and intestinal nutrient sensing of cashmere goats.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2607-2618]

goat; intestinal nutrient sensing factor; glucose; N-carbamylglutamic acid

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.034

2016-02-02

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303059)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303062)；國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)(CARS-40-12)；內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2013CXJJM05)

張霞(1988—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail： zhangxia19880818@163.com

孫海洲，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： sunhaizhou@china.com

S826

A

1006-267X(2016)08-2607-12