薛艷鋒　郝力壯*　劉書(shū)杰*　柴沙駝　張曉衛(wèi)　趙索南

(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海高原牦牛研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016；2.海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，海晏810200)

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飼糧銅含量對(duì)牦牛體外瘤胃發(fā)酵的影響

薛艷鋒1郝力壯1*劉書(shū)杰1*柴沙駝1張曉衛(wèi)1趙索南2

(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海高原牦牛研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016；2.海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，海晏810200)

為了探究牦牛飼糧中微量元素銅的適宜含量，本試驗(yàn)以甘氨酸銅作為添加形式，以牦牛飼糧為底物進(jìn)行體外瘤胃發(fā)酵，底物銅含量分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/kg，共發(fā)酵48 h。測(cè)定發(fā)酵后的產(chǎn)氣量、瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及消化酶活力。結(jié)果表明：當(dāng)?shù)孜镢~含量為15.0 mg/kg時(shí)，干物質(zhì)消化率(DMD)，微生物蛋白質(zhì)(MCP)、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度，脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶 (TYS)、纖維素酶(CLS)活力均達(dá)到最大值，分別為63.858%、4.289 g/L、24.475 mmol/L、0.470 mmol/L、8.977 mmol/L、1.159 mmol/L、1.607 mmol/L、81.583 mmol/L、0.504 U/mL、84.167 U/mL、79.956 U/mL，乙酸/丙酸最低為2.045；當(dāng)銅含量為10.0 mg/kg時(shí)，MCP、乙酸濃度達(dá)到最大值，分別為4.289 g/L、51.075 mmol/L，且其他指標(biāo)也都處于較高水平。綜合得出，在體外條件下，牦牛飼糧推薦銅含量為10.0～15.0 mg/kg。

牦牛；甘氨酸銅；體外產(chǎn)氣技術(shù)；消化酶活力；揮發(fā)性脂肪酸

牦牛作為環(huán)境條件極其惡劣(寒、旱、缺氧、強(qiáng)輻射)的青藏高原地區(qū)優(yōu)勢(shì)畜種，是當(dāng)?shù)啬撩裆娴奈镔|(zhì)基礎(chǔ)和經(jīng)濟(jì)支柱[1-2]。但牦牛面臨著寒冷的冬季和漫長(zhǎng)的枯草期，不僅冬季掉膘嚴(yán)重，而且凍死、餓死的現(xiàn)象也屢見(jiàn)不鮮，嚴(yán)重制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此深入研究牦牛營(yíng)養(yǎng)、制訂飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)、合理補(bǔ)飼勢(shì)在必行。關(guān)于牦牛能量[3]和蛋白質(zhì)[4]營(yíng)養(yǎng)方面已經(jīng)有一定研究基礎(chǔ)，但牦牛微量元素營(yíng)養(yǎng)方面的研究基本上處于空白狀態(tài)。

銅是動(dòng)物機(jī)體所必需的微量元素之一[5]，參與造血和髓蛋白的合成[6-7]，促進(jìn)骨和膠原的形成[8]，參與被毛色素沉積，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[9-10]，促進(jìn)家畜生長(zhǎng)[11-12]?；A(chǔ)飼糧中銅往往處于缺乏狀態(tài)，但添加過(guò)量又會(huì)影響牦牛消化代謝、生長(zhǎng)繁殖和生產(chǎn)性能，甚至影響牦牛機(jī)體的健康狀況。楊鳳[6]指出動(dòng)物飼糧中的微量元素銅、錳、碘、鐵、鋅處于臨界缺乏狀態(tài)，而實(shí)際生產(chǎn)中大多數(shù)以預(yù)混料的形式向動(dòng)物飼糧中添加過(guò)量的微量元素復(fù)合物來(lái)滿(mǎn)足動(dòng)物的需求，這樣雖然彌補(bǔ)了動(dòng)物飼糧中微量元素的缺乏，起到了一定的積極作用，但卻不能最大程度地發(fā)揮動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。

楊紅建[13]推薦肉牛飼糧中銅的添加量為10 mg/kg。Perry等[14]認(rèn)為在較低的鉬水平下，奶牛對(duì)銅的需要量為10～20 mg/kg。馬長(zhǎng)星[15]報(bào)道，體重在300～650 kg、妊娠250 d的青年母牛銅需要量為12～16 mg/kg。因此本試驗(yàn)以甘氨酸銅作為微量元素銅的添加形式，采用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究銅含量為5.0～25.0 mg/kg時(shí)對(duì)人工瘤胃發(fā)酵的影響，旨在篩選牦牛飼糧中微量元素銅的最適含量，為完善牦牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)補(bǔ)飼提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選擇3頭健康、體況接近、裝有永久性瘤胃瘺管的成年閹牦牛作為瘤胃液供體動(dòng)物。試驗(yàn)飼糧包括精料和粗料(燕麥青干草)，精粗比6∶4，單頭飼喂，每日2次(08:00、18:00)，自由飲水。飼喂15 d之后，清晨空腹采集瘤胃液。

1.2體外產(chǎn)氣的試驗(yàn)方法

清晨空腹采集3頭牛的瘤胃液，混勻之后4層紗布過(guò)濾，參考Menke等[16]的方法配制人工瘤胃發(fā)酵液，通入二氧化碳達(dá)到厭氧狀態(tài)，使用自動(dòng)分液器分裝到裝有200 mg底物的培養(yǎng)管中(每管30 mL)，轉(zhuǎn)入(39.0±0.5) ℃的人工瘤胃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至2、4、6、8、12、16、20、24、30、36、48 h各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，取出培養(yǎng)管，快速讀取活塞所處的刻度值(mL)并記錄。發(fā)酵48 h結(jié)束后，將培養(yǎng)管轉(zhuǎn)移到冰水浴中終止發(fā)酵。同時(shí)設(shè)定無(wú)發(fā)酵底物的空白管?，F(xiàn)場(chǎng)測(cè)定發(fā)酵液pH和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度，備份發(fā)酵液，冷凍保存，用于測(cè)定消化酶活力，微生物蛋白質(zhì)(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，收集發(fā)酵殘?jiān)?05 ℃烘干12～24 h，測(cè)定干物質(zhì)消化率(DMD)。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)和《牦牛營(yíng)養(yǎng)研究論文集》[2]，按照150 kg牦牛日增重500 g設(shè)計(jì)牦牛基礎(chǔ)飼糧的精料配方，以燕麥青干草作為粗料，精粗比6:4配制發(fā)酵底物。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。首先通過(guò)原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵底物中銅的含量為4.395 mg/kg，然后在5個(gè)處理的發(fā)酵底物中以甘氨酸銅(含銅量20%)的形式分別添加0.605、5.605、10.605、15.605、20.605 mg/kg的銅，從而使5個(gè)處理中銅的總含量分別達(dá)到5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/kg。采用體外發(fā)酵技術(shù)研究不同銅含量對(duì)牦牛瘤胃發(fā)酵的影響。

1.4測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1銅含量

銅含量參考GB/T 13885—2003[17]，使用北京普析TAS-990 AFG型原子吸收分光光度計(jì)，采用火焰法測(cè)定。本試驗(yàn)所做出的銅含量標(biāo)準(zhǔn)曲線擬和公式為：

Abs=0.100 30Conc+0.000 466 67

(r=0.999 9，n=4)。

式中：Conc為銅含量(μg/mL)；Abs為吸光度值，波長(zhǎng)為324.8 nm。

1.4.2產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和DMD

根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)記錄的產(chǎn)氣量計(jì)算總產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)氣速率。

總產(chǎn)氣量(mL)=試驗(yàn)管總產(chǎn)氣量-

空白管總產(chǎn)氣量;

甲烷產(chǎn)量(mL)=總產(chǎn)氣量×甲烷所占百分比;

產(chǎn)氣速率(mL/h)=階段產(chǎn)氣量/時(shí)間間隔。

DMD(%)={[樣本干物質(zhì)(DM)重-

殘?jiān)麯M重+空白管DM重]/

樣本DM重}×100。

1.4.3pH和NH3-N、MCP濃度

pH采用HANNA HI221型臺(tái)式酸度計(jì)測(cè)定。

NH3-N濃度采用馮宗慈等[18]改進(jìn)的比色法測(cè)定；本試驗(yàn)所作出的NH3-N濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線擬和公式為：

Y=0.043 1X+0.024 1(r=0.995，n=5)。

式中：Y為NH3-N濃度(mg/dL)，X為吸光度值，波長(zhǎng)為625.0 nm。

MCP濃度測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)定原理：蛋白質(zhì)分子中的肽鍵(—CONH—)能與堿性銅溶液作用，發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，形成紫色復(fù)合物，因此可以測(cè)定顯色反應(yīng)后溶液的吸光度值(波長(zhǎng)為540 nm)，計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)的濃度。

雙縮脲試劑的配制：將試劑1中的粉劑加超純水稀釋到100 mL，試劑2中的粉劑加超純水稀釋到200 mL，然后將稀釋后的試劑1、試劑2按照1∶2的比例配成雙縮脲試劑，4 ℃保存。操作方法：準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液0.20 mL，加入0.80 mL的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制成20%的勻漿液，在2 500 r/min的條件下離心10 min，取上清液50 μL進(jìn)行測(cè)定；具體操作步驟見(jiàn)表1。使用TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(提前預(yù)熱30 min)在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定各管吸光度值，比色皿光徑1 cm，超純水調(diào)零。

MCP計(jì)算公式如下：

MCP(g/L)=(Am-AK)/(As-Ak)×Ck×w。

式中：Am為測(cè)定管吸光度值；AK為空白管吸光度值；AVs為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值；Ck為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度56.3 g/L；w為稀釋倍數(shù)。

表1　雙縮脲反應(yīng)操作流程

1.4.4VFA濃度

VFA濃度測(cè)定參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，對(duì)樣品進(jìn)行前處理。發(fā)酵瘤胃液經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，取5 mL于干凈的離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于Tube管中，準(zhǔn)確加入0.2 mL、25%的偏磷酸溶液，混勻之后，靜置10 min充分反應(yīng)后，在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的Tube管中，-80 ℃凍存，備用。

VFA的測(cè)定方法：用島津2014氣相色譜儀分析。測(cè)定條件：FID檢測(cè)器，色譜柱為毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；色譜柱升溫程序，初始60 ℃，以10 ℃/min升溫至120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升溫至180 ℃，保留5 min；汽化溫度250 ℃；檢測(cè)溫度250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL，載氣為高純氮?dú)?99.99 %)，壓力0.7 MPa，檢測(cè)器氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa，毛細(xì)管柱壓力0.6～0.8 MPa，分流比40。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。

表2　VFA濃度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線中：Y為進(jìn)樣的峰面積；X為組分濃度(mmol/L)。

In standard curves:Ywas peak area of the sample;Xwas the concentration of the fraction(mmol/L).

1.4.5消化酶活力

淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶(TYS)、纖維素酶(CLS)活力測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定?；盍挝欢x：每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)AMS活力單位；每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物作用1 min，每消耗1 μmol底物為1個(gè)LPS活力單位；每毫升含酶溶液在37 ℃、pH=8.0的條件下，每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度值(波長(zhǎng)為253 nm)變化0.003即為1個(gè)TYS活力單位；每毫升含酶溶液每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個(gè)CLS活力單位。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和DMD

從表3中可以看出，以甘氨酸銅作為添加劑時(shí)，隨著銅含量的升高，瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量呈現(xiàn)出先上升后達(dá)到穩(wěn)定的趨勢(shì)，銅含量在10.0～20.0 mg/kg時(shí)，總產(chǎn)氣量處于穩(wěn)定狀態(tài)，在75.0 mL左右波動(dòng)，只有銅含量達(dá)到25.0 mg/kg時(shí)的總產(chǎn)氣量顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，其他各組之間總產(chǎn)氣量差異均不顯著(P>0.05)。隨著銅含量的升高，甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在銅含量為10.0 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值10.54 mL，顯著高于銅含量為5.0、20.0、25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與銅含量為15.0 mg/kg時(shí)的甲烷產(chǎn)量10.42 mL之間差異不顯著(P>0.05)。隨著銅含量的升高，DMD出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)銅的含量為15.0 mg/kg時(shí)，DMD達(dá)到最大值63.858%，并且顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。

表3　底物銅含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量和DMD的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant different (P>0.05). The same as below.

從圖1中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，5組的產(chǎn)氣速率都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，最后產(chǎn)氣速率趨近于0，在5～9 h之間產(chǎn)氣速率達(dá)到最大值，呈現(xiàn)單峰形狀。

圖1　底物銅含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣速率的影響

2.2pH和NH3-N、MCP濃度

從表4中可以看出，以甘氨酸銅作為添加劑時(shí)，隨著銅含量的升高，體外發(fā)酵后pH呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，銅含量在10.0～15.0 mg/kg時(shí)，pH達(dá)到穩(wěn)定趨勢(shì)，并且顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。各組體外發(fā)酵后pH處于6.71～7.16之間，都屬于牦牛瘤胃液pH正常范圍之內(nèi)。隨著銅含量的升高，體外發(fā)酵后的NH3-N濃度出現(xiàn)先穩(wěn)定后降低的趨勢(shì)，當(dāng)銅的含量在5.0～15.0 mg/kg時(shí)NH3-N濃度處于穩(wěn)定居高的狀態(tài)，都在10.00 mg/dL之上，當(dāng)銅的含量在20.0～25.0 mg/kg時(shí)NH3-N濃度略低，在10.00 mg/dL之下。銅含量為5.0 mg/kg時(shí)NH3-N濃度顯著高于銅含量為20.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。隨著銅含量的升高，體外發(fā)酵后MCP濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在銅含量為10.0～15.0 mg/kg時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，都為4.289 g/L，顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)的MCP濃度(P<0.05)。

2.3VFA濃度

從表5中可以看出，以甘氨酸銅作為添加劑時(shí)，隨著銅含量的升高，發(fā)酵后乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)的濃度都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。乙酸的濃度在銅含量為10.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值51.075 mmol/L；丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA的濃度都在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值，分別為24.475、0.470、8.977、1.159、1.607、81.583 mmol/L。乙酸/丙酸出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最小值2.045。當(dāng)銅含量為10.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后乙酸濃度顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后丙酸濃度顯著高于其他所有組(P<0.05)，銅含量為10.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后丙酸濃度顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后異丁酸濃度差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后丁酸濃度都顯著高于其他各組(P<0.05)，且這2組之間差異顯著(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后異戊酸濃度都顯著高于其他各組(P<0.05)，這2組之間差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后戊酸濃度都顯著高于其他各組(P<0.05)，且這2組之間差異顯著(P<0.05)；當(dāng)銅含量為10.0和15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后TVFA濃度都顯著高于銅含量為5.0和25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，這2組之間差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，體外發(fā)酵后乙酸/丙酸顯著低于銅含量為5.0、10.0、20.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。

表4　底物銅含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵pH和NH3-N、MCP濃度的影響

表5　底物銅含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵VFA濃度的影響

2.4消化酶活力

從表6中可以看出，隨著銅含量升高，體外發(fā)酵后AMS活力出現(xiàn)先保持較高水平后下降再上升的趨勢(shì)，LPS、TYS和CLS活力都出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。AMS活力在銅含量為5.0 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.531 U/mL，但與銅含量為10.0、25.0 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)，這3組顯著高于其他2組(P<0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，LPS活力達(dá)到最大值0.504 U/mL，顯著高于其他所有組(P<0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，TYS活力達(dá)到最大值84.167 U/mL，顯著高于銅含量為5.0、20.0、25.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與銅含量為10.0 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)銅含量為15.0 mg/kg時(shí)，CLS活力達(dá)到最大值79.956 U/mL，與銅含量為25.0 mg/kg時(shí)差異不顯著，且這2組都顯著高于銅含量為5.0 mg/kg時(shí)(P<0.05)。

表6　底物銅含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵消化酶活力的影響

3　討　論

瘤胃氣體發(fā)酵產(chǎn)物主要包括二氧化碳、甲烷、氫氣、VFA等[21]，來(lái)源于飼糧中有機(jī)物質(zhì)的降解，總產(chǎn)氣量的多少反映飼糧的降解程度[22]，產(chǎn)氣量越高，表明飼糧發(fā)酵越充分，為機(jī)體提供的能量越多，越有利于動(dòng)物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量隨著底物銅含量的升高而增加，由此可見(jiàn)，添加甘氨酸銅有利于瘤胃發(fā)酵。產(chǎn)氣速率出現(xiàn)先上升后下降的單峰趨勢(shì)，這是由于發(fā)酵初期，發(fā)酵底物中的可溶性糖等成分易于被微生物所利用，迅速產(chǎn)生氣體，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，可發(fā)酵成分越來(lái)越少，產(chǎn)氣速率也慢慢降低，最終趨近于0。pH是瘤胃發(fā)酵的綜合反映，受發(fā)酵底物類(lèi)型、有機(jī)酸沉淀等各種因素的影響[23]，只有當(dāng)pH處于正常范圍之內(nèi)，才能夠保證瘤胃發(fā)酵、飼料降解的正常進(jìn)行。本試驗(yàn)不同銅含量下體外發(fā)酵后的pH都在反芻動(dòng)物瘤胃液pH正常范圍5.6～7.5之內(nèi)。

DMD直接反映飼糧在瘤胃中的降解程度，本試驗(yàn)中，隨著銅含量的提高，DMD先增大后減小，在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值63.858%，由此可見(jiàn)銅含量15.0 mg/kg最有利于飼料的降解。這與瘤胃消化道酶活力的測(cè)定結(jié)果基本吻合，其中LPS、TYS和CLS 3種消化酶的活力都在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值。只有AMS的活力出現(xiàn)了先降低后升高的趨勢(shì)，并且DMD在銅含量為10.0 mg/kg的時(shí)候也處于較高水平。因此從瘤胃消化酶活力和DMD的角度看，當(dāng)銅的含量在10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，最有利于飼糧的降解。本試驗(yàn)中所測(cè)定的牦牛瘤胃消化酶活力與張海濤等[24]測(cè)定的犢牛瘤胃內(nèi)AMS活力0.29～1.74 U/mL，劉彩娟等[25]測(cè)定的奶牛瘤胃中CLS活力71.43～99.05 U/m，Moharrery等[26]測(cè)定的奶牛十二指腸中AMS活力0.70～31.99 U/mL、LPS活力0.15～0.81 U/mL都基本上處于同一水平；只有TYS活力遠(yuǎn)高于Moharrery等[26]測(cè)定的奶牛十二指腸中TYS活力5.55～11.42 U/mL、王杰[27]測(cè)定的羊瘤胃中TYS活力18.09～24.56 U/mL，而達(dá)到32.713～84.167 U/mL。Goodrich等[28]給瘤胃液中添加不同含量的銅進(jìn)行體外培養(yǎng)的試驗(yàn)表明，銅對(duì)纖維素的降解有很大的促進(jìn)作用。Saxena等[29]的研究也表明，飼糧中添加銅可以促進(jìn)瘤胃微生物對(duì)纖維素的降解作用，而本試驗(yàn)中添加銅也顯著提高了牦牛瘤胃體外發(fā)酵后CLS活力，這將對(duì)瘤胃微生物降解纖維素起到積極的作用。

NH3-N來(lái)源于飼糧中蛋白質(zhì)的降解，主要用于微生物合成MCP[30]，在瘤胃中基本處于動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)中5組的NH3-N濃度都處于正常范圍0.35～29.0 mg/dL[31-32]之內(nèi)，并且隨著銅含量的提高，NH3-N濃度出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但當(dāng)銅含量在10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，NH3-N濃度還處于整體較高值。MCP提供了反芻動(dòng)物機(jī)體40%～60%的蛋白質(zhì)需要量，隨著銅含量的提高，MCP濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且在銅含量為10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值。由此可見(jiàn)，銅含量為10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，最有利于NH3-N和MCP的形成。當(dāng)銅含量較低的時(shí)候，可能是由于微生物合成MCP的能力較弱，從而使MCP濃度處于較低水平，并且也導(dǎo)致NH3-N轉(zhuǎn)化成MCP的反應(yīng)受到抑制，從而使NH3-N濃度處于較高的水平。

VFA是反芻動(dòng)物重要的能量物質(zhì)，提供了反芻動(dòng)物60%～80%的消化能[33-34]。本試驗(yàn)中丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA的濃度都在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值，乙酸的濃度在銅含量為10.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最大值。同時(shí)，對(duì)于反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，動(dòng)物機(jī)體所需要的能量主要來(lái)源于肝臟組織糖異生作用產(chǎn)生的葡萄糖，而丙酸是糖異生作用的重要前體物質(zhì)，是一種高效酸，乙酸/丙酸越低，表明丙酸所占比例也越大，越利于反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)，本試驗(yàn)中乙酸/丙酸的比例在銅含量為15.0 mg/kg的時(shí)候達(dá)到最低值。由此可見(jiàn)，銅含量為10.0～15.0 mg/kg的時(shí)候，最有利于能量物質(zhì)的生成，最有利于牦牛的生長(zhǎng)。

4　結(jié)　論

綜上所述，體外條件下，對(duì)于生長(zhǎng)期牦牛，若以甘氨酸銅作為銅元素的添加形式，牦牛飼糧銅含量在10.0～15.0 mg/kg時(shí)，有利于瘤胃發(fā)酵和飼糧降解。而本試驗(yàn)牦牛飼糧中的微量元素銅的基礎(chǔ)含量只有4.395 mg/kg，遠(yuǎn)低于牦牛對(duì)銅的需要量10.0～15.0 mg/kg，處于極度缺乏狀態(tài)，必須額外補(bǔ)充微量元素銅，才能更大限度地改善牦牛瘤胃發(fā)酵，提高生長(zhǎng)性能。

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(責(zé)任編輯王智航)

s: HAO Lizhuang, associate professor, E-mail： lizhuanghao1122@foxmail.com; LIU Shujie， professor, E-mail： mkylshj@126.com

Effects of Dietary Copper Content on Rumen Fermentation of YaksinVitro

XUE Yanfeng1HAO Lizhuang1*LIU Shujie1*CHAI Shatuo1ZHANG Xiaowei1ZHAO Suonan2

(1. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province, Qinghai Plateau Yak Research Center, Qinghai Academy of Science and Veterinary Medicine of Qinghai University, Xining 810016, China; 2. Academy of Science and Veterinary Medicine of Haibei Prefecture, Haiyan 810200, China)

To find an optimal content of copper in diet for yaks, cupric glycinate was used as additive, and diet for yaks was used as a substrate forinvitrorumen fermentation in the present study. Copper contents in substrates were designed as 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0 mg/kg, respectively. The fermentation lasted for 48 h. After fermentation, gas production, rumen fermentation parameters and digestive enzyme activities were measured. The results showed as follows: when the content of copper in substrate was 15.0 mg/kg, dry matter digestibility (DMD), the concentrations of microbial protein (MCP), propionic acid, isobutyric acid, butyric acid, isovaloric acid, valeric acid and total volatile fatty acids, as well as the activities of lipidase, trypsinase , cellulase reached the highest, which were 63.858 %, 4.289 g/L, 24.475 mmol/L, 0.470 mmol/L, 8.977 mmol/L, 1.159 mmol/L, 1.607 mmol/L, 81.583 mmol/L, 0.504 U/mL, 84.167 U/mL and 79.956 U/mL, respectively; when the content of copper in substrate was 10.0 mg/kg, acetic acid/propionic acid reached the lowest, which was 2.045; when the content of copper was 10.0 mg/kg, MCP and acetic acid concentrations reached the highest, which were 4.289 g/L and 51.075 mmol/L, respectively, and the values of other indexes were also on high level. Therefore, underinvitroconditions, the copper content recommended in yak’s diet is between 10.0 and 15.0 mg/kg.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2599-2606]

yak; cupric glycinate;invitrogas production technique; digestive enzyme activity; volatile fatty acid

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.033

2016-02-27

“973”國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB722906)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD13B01)；國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2015DFG31870)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201203008)；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT13074)；青海省重大科技平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2013-Z-Y03)

薛艷鋒(1990—)，男，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail： 945982845@qq.com

郝力壯，副研究員，E-mail： lizhuanghao1122@foxmail.com；劉書(shū)杰，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： mkylshj@126.com

S823

A

1006-267X(2016)08-2599-08