孫巍巍　葛　婷　成艷芬　朱偉云

(江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學消化道微生物實驗室，南京210095)

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杜長大肥育豬大腸食糜養(yǎng)分分析及不同蛋白質(zhì)水平對豬盲腸微生物體外發(fā)酵特性的影響

孫巍巍葛婷成艷芬朱偉云*

(江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學消化道微生物實驗室，南京210095)

本試驗旨在用體外法研究不同蛋白質(zhì)水平對杜長大肥育豬盲腸微生物發(fā)酵特性的影響。試驗首先采集10頭杜長大肥育豬大腸不同區(qū)段食糜，測定其主要養(yǎng)分含量，以確定食糜碳水化合物與粗蛋白質(zhì)添加比例；然后以3頭豬盲腸食糜為接種物，酪蛋白水解物為發(fā)酵底物進行體外發(fā)酵試驗。試驗組蛋白質(zhì)水平分別為1.00、1.75和2.50 mg/mL，每組4個重復，37 ℃體外發(fā)酵24 h，測定產(chǎn)氣量、pH以及氨態(tài)氮、菌體蛋白和短鏈脂肪酸含量。結(jié)果顯示：1)豬盲腸食糜各養(yǎng)分含量在一定范圍內(nèi)變化，碳水化合物與粗蛋白質(zhì)含量比范圍為1.86～3.24，平均值為2.66。2)隨著蛋白質(zhì)水平的升高，產(chǎn)氣量顯著增加(P<0.05)，氨態(tài)氮、總短鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸、乙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸含量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明：豬大腸食糜中碳水化合物與粗蛋白質(zhì)含量比在一定范圍內(nèi)變化，而盲腸微生物對蛋白質(zhì)的發(fā)酵能力隨底物蛋白質(zhì)水平的升高而增強。

豬大腸；蛋白質(zhì)水平；盲腸微生物；發(fā)酵特性

人和動物的腸道中存在著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，它們與宿主的營養(yǎng)代謝和健康密切相關(guān)。單胃動物小腸中雖然具有很高的微生物多樣性，但是大腸中微生物的數(shù)量遠遠多于小腸，如生長育肥豬的盲腸、結(jié)腸和直腸是微生物聚集的主要區(qū)段[1]。豬等單胃動物攝取的食物大部分在小腸被消化吸收，然而仍有一部分會進入后腸，被微生物發(fā)酵利用[2]。一般認為，盲腸和結(jié)腸中微生物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)有益于宿主健康，而微生物發(fā)酵蛋白質(zhì)主要產(chǎn)生氨、酚類、吲哚類等潛在有害物質(zhì)[3]。單胃動物后腸微生物的發(fā)酵速度和產(chǎn)物含量主要受后腸食糜蛋白質(zhì)和碳水化合物水平的影響[4]。雖然有很多學者研究了進入后腸的蛋白質(zhì)種類及水平在大腸發(fā)酵中的作用，然而鑒于腸道環(huán)境的復雜性，蛋白質(zhì)水平對豬后腸發(fā)酵模式的影響并不清晰[5]。

Morita等[6]在以小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)，提高蛋白質(zhì)水平可以促進SCFA的產(chǎn)生；Htoo等[7]研究顯示，將蛋白質(zhì)水平從24%降低到20%時，顯著降低了盲腸中SCFA的含量；然而Opapeju等[8]研究結(jié)果表明，降低蛋白質(zhì)水平不影響豬后腸中SCFA的含量。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，生豬養(yǎng)殖造成的環(huán)境氮污染日趨嚴重，其中66%的氮污染來自養(yǎng)殖過程中糞尿等排泄物[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，降低飼糧蛋白質(zhì)水平同時補充晶體氨基酸，不影響生長性能，并且可以減少尿氮的排泄量[7]。因此，研究蛋白質(zhì)在豬后腸的轉(zhuǎn)化機制，提高蛋白質(zhì)飼料的利用率，是促進動物健康、減少氮污染的有效措施。本文首先測定了正常飼喂條件下杜長大肥育豬大腸不同區(qū)段食糜養(yǎng)分組成，然后在體外條件下研究了不同蛋白質(zhì)水平對豬盲腸微生物發(fā)酵特性的影響，以期為研究豬后腸蛋白質(zhì)代謝提供參考。

1　材料與方法

1.1底物、培養(yǎng)基及接種物的制備

底物及培養(yǎng)基：蛋白質(zhì)底物為酪蛋白水解物(北京索來寶科技有限公司，C8210，總含氮量約為13.1%)；培養(yǎng)基參考Dai等[10]的方法配制。

接種物的制備：試驗選用體重60 kg左右的健康杜長大三元豬3頭，飼喂基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1，自由飲水。屠宰后分離盲腸，立刻帶回實驗室，稱取等量新鮮食糜，用滅菌的磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)1∶5(質(zhì)量體積比)稀釋，振蕩混勻，用4層滅菌紗布過濾，將濾液裝進血清瓶后密封，放進37 ℃的水浴鍋備用。全部操作過程通CO2保持厭氧環(huán)境。

1.2試驗設(shè)計

首先采集10頭杜長大肥豬盲腸、結(jié)腸前段和結(jié)腸后段食糜，測定其中水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量，利用以下公式推算食糜中碳水化合物(包括粗纖維和無氮浸出物)的含量。

碳水化合物(%)=100-[水分(%)+

粗蛋白質(zhì)(%)+粗灰分(%)+粗脂肪(%)]。

然后根據(jù)食糜養(yǎng)分測定結(jié)果進行體外發(fā)酵試驗，分為試驗組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+接種物+底物)和負對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+接種物)，試驗組蛋白質(zhì)水平分別為1.00、1.75和2.50 mg/mL，每組4個重復。除負對照組外，試驗組均以酪蛋白水解物作為唯一氮源。

1.3體外發(fā)酵指標的測定

產(chǎn)氣量的測定參照Theodorou等[11]的方法；SCFA含量測定參照秦為琳[12]的方法；菌體蛋白(microbial protein,MCP)含量測定參照Makkar等[13]的方法；氨態(tài)氮含量測定參照梁劍光等[14]的方法。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步統(tǒng)計處理后，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 8 000 IU,VB120 mg，VB2100 mg,VB620 mg,VB120.03 mg, VD35 000 IU,VE 250 mg,VK320 mg,生物素 biotin 0.15 m,葉酸 folic acid 5.0 mg,D-泛酸D-pantothenic acid 200 mg,煙酸 nicotinic acid 400 mg,Cu (as copper sulfate) 1 250 mg,Fe (as ferrous sulfate) 1 000 mg,Mn (as manganese sulfate) 500 mg,Zn (as zinc sulfate) 1 000 mg,Se (as sodium selenite) 5 mg。

2)代謝能為計算值，其余為實測值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

2　結(jié)　果

2.1豬大腸食糜養(yǎng)分分析

由表2可知，豬大腸食糜中各養(yǎng)分含量變異性較大。盲腸粗蛋白質(zhì)含量變化范圍為1.40%～3.24%，平均含量為2.59%；碳水化合物含量變化范圍為3.49%～8.49%，平均含量為6.81%；碳水化合物與粗蛋白質(zhì)含量比(C/N)為1.86～3.24。結(jié)腸粗蛋白質(zhì)含量相對于盲腸明顯升高，結(jié)腸前段和結(jié)腸后段粗蛋白質(zhì)平均含量分別為4.05%和4.96%；而碳水化合物與粗蛋白質(zhì)含量比則與盲腸相似，平均值分別為2.57和2.78。根據(jù)食糜養(yǎng)分分析結(jié)果，確定體外發(fā)酵C/N=1.60(小于1.86)為高蛋白質(zhì)水平組；C/N=4.00(大于3.24)為低蛋白質(zhì)水平組，C/N=2.28(1.86～3.24)為中蛋白質(zhì)水平組。

表2　豬大腸不同區(qū)段食糜養(yǎng)分含量(鮮樣基礎(chǔ))

2.2不同蛋白質(zhì)水平對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

由圖1可知，試驗組產(chǎn)氣量隨時間延長呈逐漸上升趨勢，前12 h發(fā)酵迅速，產(chǎn)氣量在3和9 h之間產(chǎn)氣量呈線性(R2=0.999)增加，24 h以后基本趨于穩(wěn)定。3和6 h 3個試驗組累計產(chǎn)氣量差異不顯著(P>0.05)；9、12、18和24 h低蛋白質(zhì)水平組與中蛋白質(zhì)水平組累計產(chǎn)氣量差異不顯著(P>0.05)，高蛋白質(zhì)水平組相對于其他2組的產(chǎn)氣量顯著增加(P<0.05)。

2.3不同蛋白質(zhì)水平對體外發(fā)酵pH及氨態(tài)氮和MCP含量的影響

由表3可知，氨態(tài)氮含量隨著蛋白質(zhì)水平的升高極顯著增加(P<0.01)，且呈線性變化(R2=0.998)。MCP含量隨底物蛋白質(zhì)水平的升高顯著增加(P<0.05)，高蛋白質(zhì)水平組MCP含量顯著高于低蛋白質(zhì)水平組(P<0.05)。底物蛋白質(zhì)水平對pH沒有顯著影響(P>0.05)。

2.4不同蛋白質(zhì)水平對體外發(fā)酵SCFA含量的影響

由表4可知，中蛋白質(zhì)水平組和高蛋白質(zhì)水平組總SCFA和乙酸含量顯著高于低蛋白質(zhì)水平組(P<0.05)。丁酸、戊酸、支鏈脂肪酸、異丁酸和異戊酸含量隨蛋白質(zhì)水平的提高逐漸增加，且各組間差異顯著(P<0.05)。蛋白質(zhì)水平對丙酸含量沒有顯著影響(P>0.05)。

*表示在此時間點高蛋白質(zhì)水平組與低蛋白質(zhì)水平組和中蛋白質(zhì)水平組差異顯著 (P<0.05)。

* indicated that the high protein level group was significantly different with low protein level group and middle protein level group (P<0.05).

圖1不同蛋白質(zhì)水平體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量動態(tài)變化曲線

Fig.1Dynamic change curves of gas production of different protein levels during 24 hinvitrofermentation

3　討　論

3.1不同蛋白質(zhì)水平對體外發(fā)酵特性的影響

pH是反映底物發(fā)酵狀況的綜合指標之一，本試驗中pH在6.80～6.83內(nèi)變化，適合豬盲腸微生物生長。產(chǎn)氣量是反映微生物對底物利用和發(fā)酵特性的重要指標，產(chǎn)氣的快慢反映了微生物對底物的利用速度。本試驗發(fā)酵的前3 h產(chǎn)氣緩慢，可能是因為微生物適應(yīng)底物和降解需要時間，減緩了微生物的生長速度；之后產(chǎn)氣量迅速增加，表明微生物生長迅速，可能是因為發(fā)酵中使用的酪蛋白水解物和葡萄糖都溶于水且易于被微生物降解利用。產(chǎn)氣量隨蛋白質(zhì)水平升高而增加，說明提高蛋白質(zhì)水平可促進微生物的發(fā)酵作用。產(chǎn)氣來源于微生物發(fā)酵底物生成SCFA的過程，故發(fā)酵過程中產(chǎn)氣速度和累計產(chǎn)氣量在一定程度上反映了微生物的總體活力和SCFA的產(chǎn)生情況[15]。

表3　不同蛋白質(zhì)水平對體外發(fā)酵pH及氨態(tài)氮和MCP含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表4同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4.

表4　不同蛋白質(zhì)水平對體外發(fā)酵SCFA含量的影響

SCFA是單胃動物后腸微生物發(fā)酵的重要終產(chǎn)物，SCFA主要由碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生，但同時蛋白質(zhì)也是產(chǎn)生SCFA的重要發(fā)酵底物[16]，90%以上的SCFA可以被迅速吸收[17]，為宿主腸上皮細胞和機體其他組織提供能量。在本試驗中觀察到低蛋白質(zhì)水平組SCFA含量顯著低于高蛋白質(zhì)水平組，可能是因為在碳源充足的條件下，氮源成為限制微生物生長的主要因素。Morita等[6]在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，以易消化的酪蛋白作為對照，增加飼糧抗消化蛋白質(zhì)的水平，可以提高小鼠盲腸中總SCFA含量。Getachew等[18]在體外試驗中也發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣量和SCFA含量隨著氮源水平的升高而增加。這與本試驗結(jié)果一致，說明氮源水平是影響微生物發(fā)酵的重要因素，提高氮源水平，可能會促進SCFA的產(chǎn)生。Liu等[19]研究顯示，提高飼糧蛋白質(zhì)水平可以增加盲腸與結(jié)腸食糜中乙酸含量，本試驗結(jié)果與之印證。乙酸可以作為脂肪合成的前提物質(zhì)或者肌肉組織的能源物質(zhì)，并具有促進糖生成的作用，乙酸含量增加可以為動物機體提供能量。支鏈脂肪酸只能由支鏈氨基酸發(fā)酵產(chǎn)生[16]，可以作為蛋白質(zhì)發(fā)酵的標志性產(chǎn)物。本試驗觀察到，異丁酸和異戊酸含量隨蛋白質(zhì)水平升高而增加，說明隨著蛋白質(zhì)水平的提高，微生物對蛋白質(zhì)的利用加強。丁酸是腸上皮細胞優(yōu)先利用的能源物質(zhì)，Walker等[20]在一項以人的糞便為接種物的體外發(fā)酵試驗中發(fā)現(xiàn)，提高蛋白質(zhì)水平會升高丁酸含量，這與本試驗結(jié)果相一致。說明以多肽作為氮源，在同等碳源條件下，提高氮源水平，可以顯著增加丁酸含量。

3.2不同蛋白質(zhì)水平下盲腸微生物對含氮物的利用特性

氮源是微生物生長所必須的營養(yǎng)元素，腸道微生物對蛋白質(zhì)和多肽的利用是一個復雜的過程，多數(shù)微生物優(yōu)先利用氨基酸和氨作為氮源，部分微生物可以利用蛋白質(zhì)或多肽進行生長[5]。本試驗以酪蛋白水解物作為氮源，氨態(tài)氮含量反映了微生物對蛋白質(zhì)降解和對氨態(tài)氮攝取利用的綜合能力。有研究顯示，腸道食糜和糞樣中氨態(tài)氮含量隨蛋白質(zhì)攝入量的增加而升高[3,21]，本試驗結(jié)果與之相符，說明微生物對蛋白質(zhì)的降解作用隨蛋白質(zhì)水平升高而加強。在動物腸道中，高濃度的氨影響腸上皮細胞正常的能量代謝，增加腸上皮細胞間的通透性和減弱腸黏膜的屏障功能[22]，這被認為是高蛋白質(zhì)飼糧引起仔豬腹瀉的主要原因。

在瘤胃中微生物的生長活動受可發(fā)酵碳水化合物、氨基酸、核酸、肽、氨態(tài)氮、礦物質(zhì)等多種因素的影響，其中碳水化合物和氮源是微生物生長所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)，體外發(fā)酵系統(tǒng)與瘤胃類似。Hristov等[23]研究發(fā)現(xiàn)，體外條件下瘤胃MCP的合成速率與氮源水平和蛋白質(zhì)降解速率呈線性正相關(guān)，這與本試驗結(jié)果一致。MCP含量增加，說明提高蛋白質(zhì)水平促進了微生物的生長和對氨的利用，而將氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為MCP有利于動物腸道健康，同時也降低了糞尿的氮，減少了氮污染。

4　結(jié)　論

① 杜長大肥育豬大腸中碳水化合物和粗蛋白質(zhì)含量比在一定范圍內(nèi)變化。

② 體外條件下提高氮源水平，可以增加盲腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFA。

③ 微生物對蛋白質(zhì)的發(fā)酵作用會隨底物蛋白質(zhì)水平的升高而增強，但同時也會升高氨態(tài)氮含量。

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(責任編輯田艷明)

, professor, E-mail: zhuweiyun@njau.edu.cn

Nutrient Analysis of Chyme in Large Intestine of Duroc×Landrace×Yorkshire Finishing Pigs and Effects of Different Protein Levels oninvitroFermentation Characteristics of Pig Caecal Microbiota

SUN WeiweiGE TingCHENG YanfenZHU Weiyun*

(Laboratory of Gastrointestinal Microbiology， Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Nutrition and Animal Health， College of Animal Science and Technology， Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095， China)

This study was conducted to estimate the effects of different protein levels on caecal microbial fermentation characteristics of Duroc×Landrace×Yorkshire finishing pigsinvitro. We firstly analyzed the mainly nutrient content of chyme collected from different extents of large intestine of 10 pigs in order to confirm the adding ratio of carbohydrate to crude protein used in the followinginvitrofermentation. Theninvitrofermentation experiment was carried out with cecum chyme of 3 pigs as inoculum and casein hydrolysate for fermentation substrates. The protein levels in experimental groups with 4 replicates each were 1.00, 1.75 and 2.50 mg/mL, respectively, for 24 h fermentation at 37 ℃. And gas production, pH and the contents of ammoniacal nitrogen, microbial protein and short-chain fatty acids were determined. The results showed as follows: 1) nutrient contents in cecum chyme of pigs were changed within a certain range, and the ratio of carbohydrate to crude protein content was 1.86 to 3.24 with an average value of 2.66. 2) With protein level increasing, the gas production was significantly increased (P<0.05), and the contents of ammoniacal nitrogen, total short-chain fatty acids, branched-chain fatty acids, acetate, butyrate, valerate, isobutyrate and isovalerate were significantly significantly increased (P<0.05). The results indicate that the ratio of carbohydrate to crude protein content in large intestine chyme of pigs changes within a certain range, and the caecal microbial fermentative capability is promoted with substrate protein level increasing.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2353-2359]

large intestine of pigs; protein level; caecal microbiota; fermentation characteristics

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.005

2016-02-01

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)(2013CB127300)；江蘇省自然科學基金(BK20130058)；教育部博士點基金項目(20130097130005)

孫巍巍(1988—)，男，山東菏澤人，碩士研究生，從事消化道微生物相關(guān)研究。E-mail: fenghua3457@163.com

朱偉云，教授，博士生導師，E-mail: zhuweiyun@njau.edu.cn

S811.6

A

1006-267X(2016)08-2353-07