劉 意，張栩琳，鄭傳進(jìn)，李健樂，豐 偉（. 廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東省中山市 58458；. 廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東省中山市 58458）

綠色環(huán)保型可食用果蔬保鮮劑SA-cys的合成

劉 意1，張栩琳2，鄭傳進(jìn)2，李健樂1，豐 偉1
（1. 廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東省中山市 528458；2. 廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東省中山市 528458）

利用海藻多糖（SA）良好的成膜保水性和L-半胱氨酸（L-cys）良好的抑菌、抗氧化性，通過化學(xué)改性法制備了巰基含量高達(dá)328.27 μmol/g的L-cys改性SA（SA-cys）。采用稀釋平板計數(shù)法的研究表明：在被測試范圍內(nèi)，L-cys對革蘭氏陰性大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌均有很好的抑菌性；SA-cys對革蘭氏陰性大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌均有較好的抑菌效果，最大抑菌率分別為100.00%，77.24%，對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的最大抑菌率只有61.26%；而SA對3種菌株的最大抑菌率均在40.75%以下，抑菌效果最差。因此，SA-cys在很大程度上綜合了L-cys和SA的優(yōu)勢，拓展了SA在果蔬保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

改性海藻多糖 保鮮劑 鮮切水果 抗菌性能

海藻多糖（SA）是一種源自海帶、海藻的天然鏈鎖狀高相對分子質(zhì)量的多糖型聚合物，因具有優(yōu)良的保濕性、成膜性而廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)。將SA作為保鮮劑涂覆在新鮮果蔬表面，可形成對氣體選擇性透過的薄膜，阻止部分氣體的交換，提供一個膜內(nèi)具有較低O2、較高CO2濃度的微氣調(diào)環(huán)境，進(jìn)而降低細(xì)胞呼吸強(qiáng)度和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，達(dá)到保鮮目的［1］；同時，SA還具有無毒無味、可生物降解、生物相容性好等諸多優(yōu)點［2-4］；但純SA型果蔬保鮮劑存在容易霉變，抗菌性能差等不足。因此，在高檔果蔬貯藏、鮮切水果保鮮等領(lǐng)域，開發(fā)綠色環(huán)保型可食用保鮮劑已逐漸成為被廣泛關(guān)注的研究熱點［5-9］。

L-半胱氨酸（L-cys）是一種具有生理功能且在生物體內(nèi)廣泛存在的重要物質(zhì)，在動、植物體內(nèi)能夠起到防御有害物質(zhì)和增加活力的作用。早在20世紀(jì)80年代，世界各國已將其廣泛應(yīng)用于食品、藥物和化妝品中［10］；但由于L-cys為氨基酸類小分子物質(zhì)，其水溶液涂在水果表面不能形成保護(hù)膜，所以雖然有很好的抑菌性能，卻無法直接作保鮮劑使用，只能用作某些保鮮劑的添加劑，若直接添加到SA中，會影響SA膜的綜合性能（如透明性、力學(xué)強(qiáng)度等會明顯降低）。研究發(fā)現(xiàn)：由于L-cys分子中含有還原性的巰基，或由于氧化后可形成二硫鍵等因素，L-cys除了能抑制水果的酶促褐變現(xiàn)象，可用于研究蘋果汁的防褐變［11-14］，還有一定抑菌作用，對革蘭氏陰性大腸桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌均有很強(qiáng)的抑菌作用［15-16］；改性L-cys對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性大腸桿菌均有抑制作用。因此，通過改性，在成膜物質(zhì)中引入巰基，對于鮮切水果的保鮮具有重大意義［17-18］。

本文基于天然SA的巰基化改性，試圖綜合SA 和L-cys的優(yōu)勢，研制綠色環(huán)保型可食用果蔬保鮮劑——L-cys改性SA（SA-cys），并通過抗菌實驗，為其在鮮切水果保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要原料及儀器

L-cys，1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDAC），無水乙醇：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。無水碳酸鈉，NaCl， HCl溶液，氫氧化鈉粒狀固體，碘，碘化鉀，重鉻酸鉀，硫代硫酸鈉：均為分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。SA，可溶性淀粉，胰蛋白胨，瓊脂粉，酵母浸膏：均為食品級，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。MW4000型透析袋，截量4 000 Da，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。革蘭氏陰性大腸桿菌，革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌：均為廣東藥學(xué)院食品學(xué)院微生物實驗室提供。

Perkin-Elmer 240Q型傅里葉變換紅外光譜儀，美國PE公司生產(chǎn)；U-3900型紫外可見光分光光度計，日本日立公司生產(chǎn)；LGT-10C型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司生產(chǎn)；SMART系列生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 SA-cys的合成

配制w（SA）為1.0%的水溶液，按照m（SA）∶m（EDAC）為1.0∶1.2直接加入EDAC粉末，攪拌均勻后，于室溫條件下活化45 min［19］；EDAC經(jīng)室溫活化后，按照m（SA）∶m（L-cys）為2.0∶1.0，將稱量好的L-cys溶解后緩慢加入其中，并充分?jǐn)嚢?；?.2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)，使體系pH值為4，室溫條件下反應(yīng)2 h后，再用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)，使體系pH值為6，繼續(xù)反應(yīng)1 h，得到粗產(chǎn)物，其合成流程見圖1。將所得粗產(chǎn)物倒入大量乙醇中，過濾，所得沉淀裝入已驗漏的透析袋中，依次用1 mmol/L HCl溶液、含w（NaCl）為1.0%的1 mmol/L的HCL溶液、含w（NaCl）為0.5%的1 mmol/L HCl溶液分階段透析，每階段透析24 h；透析后試樣經(jīng)冷凍干燥得新型保鮮劑——SA-cys，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 SA-cys的合成流程示意Fig.1 Synthesis route of SA-cys

1.3 測試與表征

紫外-可見光光譜分析：分別將L-cys，SA，SA-cys溶解于超純水中，控制w（L-cys），w（SA），w（SA-cys）均為0.001%，用超純水為參比液，波長為200～800 nm。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析：分別將L-cys，SA，SA-cys溶解于超純水中，控制w（L-cys），w（SA），w（SA-cys）均為1.000 %，涂覆于干凈的載玻片上，自然晾干后成無色透明膜，以空氣為參比進(jìn)行背景掃描。

巰基含量測定：采用直接碘量法［20］測SA-cys的巰基含量。稱取適量SA-cys，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的水溶液；用1.0 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)，使試樣pH值為2～3后加入2～5滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的淀粉水溶液；再用1 mmol/L碘溶液滴定，至溶液變?yōu)榱了{(lán)色且30 s內(nèi)不褪色。巰基含量按式（1）計算。

式中：n（—SH）為巰基含量，μmol/g；c（I2）為碘溶液的濃度，mol/L；V（I2）為碘溶液的體積，mL；m（SA-cys）為SA-cys的質(zhì)量，g。

SA-cys的抑菌效果：采用稀釋平板計數(shù)法評價SA-cys的抑菌效果。將SA-cys溶于雙蒸水，分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，0.5%，1.0%，1.5%的溶液備用。將革蘭氏陰性大腸桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等菌種劃線接種到平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。分別挑取兩個單菌落放入裝有9 mL雙蒸水的試管中，并按相關(guān)方法稀釋1 000倍，各取1 mL分別與等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，0.5%，1.0%，1.5%的SA-cys溶液混合，搖勻后放置15 min。此時，菌液濃度和SA-cys溶液濃度均減半，吸取0.1 mL不同濃度的混合液涂布到已冷卻凝固好的平板培養(yǎng)基上，每次做3個平行實驗?？瞻捉M實驗的菌液不與SA-cys溶液混合，直接涂布到平板上。最后將涂布好的平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后記錄菌落數(shù)。L-cys及SA試樣采用上述方法同時進(jìn)行實驗。抑菌率按式（2）計算。

圖2 試樣的FTIR和紫外-可見光光譜Fig.2 FTIR and UV spectra of samples

2 結(jié)果與討論

2.1 SA-cys的結(jié)構(gòu)

從圖2可看出：SA與SA-cys的FTIR譜線具有一定的相似度。SA與SA-cys在3 392 cm-1處寬且強(qiáng)的吸收峰是羥基的伸縮振動峰；1 035，2 931 cm-1處的吸收峰，表示兩者分子結(jié)構(gòu)中都含有—CH、CO—C［19］。從圖2還可以看出：SA的羧基二聚體在1 415，1 608 cm-1處形成反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰，而SA-cys在這兩處的吸收峰明顯減弱，且在1 249，1 538 cm-1處（分別對應(yīng)于酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶）出現(xiàn)新的吸收峰，表明SA發(fā)生相應(yīng)的衍生化反應(yīng)，即分子結(jié)構(gòu)中形成了新的酰胺鍵，對應(yīng)的吸收峰位于1 630～1 680 cm-1（酰胺Ⅰ），但由于吸收峰相互重疊覆蓋，因此表現(xiàn)為此處吸收峰變寬；1 721 cm-1處出現(xiàn)肩峰，可能是因為衍生化反應(yīng)中生成一定量的酯鍵和分子結(jié)構(gòu)中有殘基（羧基）；另外，2 538 cm-1處新增了1個弱吸收峰，與原料L-cys中的巰基出峰范圍和強(qiáng)度均吻合。綜上推測，SA分子結(jié)構(gòu)中部分羧基和L-cys上的氨基發(fā)生了酰胺化反應(yīng)，合成了SA-cys。SA-cys在205 nm處的吸收峰對應(yīng)L-cys中的小肩峰（見圖2b），表明實現(xiàn)了L-cys對SA改性的目的，即紫外-可見光光譜與FTIR相互佐證。

2.2 SA-cys的巰基含量

當(dāng)反應(yīng)物、反應(yīng)時間、反應(yīng)條件和后處理方法相同時，取質(zhì)量相近的6組試樣，用經(jīng)標(biāo)定的濃度為0.000 8 mo/L的碘溶液滴定，SA-cys的巰基含量為（295.47±1.85）～（318.46±9.81）μmol/g，與文獻(xiàn)［20］報道的結(jié)果相近，說明SA-cys的合成方法較為穩(wěn)定，其巰基含量達(dá)到預(yù)期水平。

2.3 SA-cys用于鮮切蘋果塊防褐變實驗

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.000%的SA，SA-cys水溶液，以雙蒸水為空白對照，分別處理鮮切蘋果塊（取自采摘1個月內(nèi)的蘋果），定期觀察其對鮮切蘋果塊的防褐變效果。從圖3可以看出：用SA-cys溶液處理的鮮切蘋果塊，4天內(nèi)未見明顯褐變，而用SA溶液或雙蒸水處理的試樣褐變明顯，其中，用SA溶液處理的效果最差。

2.4 SA-cys，L-cys，SA的抑菌實驗

分別以不同濃度的SA-cys，L-cys，SA雙蒸水溶液為研究對象，對比考查其對革蘭氏陰性大腸桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等的抑菌效果［21-22］。

2.4.1 對革蘭氏陰性大腸桿菌的抑菌效果

從圖4可以看出：L-cys和SA-cys的抑菌率都隨濃度增大而上升，最高抑菌率均能達(dá)到100.00%；L-cys對革蘭氏陰性大腸桿菌的抑菌效果最好，w（L-cys）為0.5%即可達(dá)到最佳抑菌效果，而w（SA-cys）為1.0%時達(dá)最佳抑菌效果。SA的最高抑菌率只有34.39%，遠(yuǎn)低于L-cys和SA-cys，且抑菌率隨SA濃度增大反而降低。

圖4 不同w（SA），w（L-cys），w（SA-cys）對革蘭氏陰性大腸桿菌抗菌效果Fig.4 Antibacterial test results of SA，L-cys and SA-cys on Gramnegative Escherichia coli in various concentrations

2.4.2 對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑菌效果

從圖5可以看出：L-cys對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑菌效果很好，在測試濃度范圍內(nèi)均為完全抑菌，w（L-cys）為0.2%即可達(dá)到最佳抑菌效果。SA-cys和SA對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑菌效果相對較差，SA-cys的最高抑菌率僅為61.26%，與L-cys對比，差異很大，其抑菌效率隨濃度減小呈微小下降趨勢。SA的抑菌率變化趨勢與SA-cys相似，但是在較高濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%）時，其抑菌率大幅下降，只有9.58%，幾乎沒有抑菌作用。

圖5 不同w（SA），w（L-cys），w（SA-cys）對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌抗菌實驗效果Fig.5 Antibacterial test results of SA，L-cys and SA-cys on staphylococcus aureus（gram-positive） in various concentrations

2.4.3 對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果

從圖6可以看出：L-cys和SA-cys對蠟樣芽孢桿菌有相似的抑菌效果，且都明顯比SA好。在測試濃度范圍內(nèi)，SA，L-cys，SA-cys均未達(dá)到最佳抑菌效果。相對而言，L-cys的抑菌效果較好，其抑菌率隨濃度增大而升高，最高抑菌率可達(dá)79.63%；SA-cys對蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果與L-cys相似，最高抑菌率可達(dá)77.24%；SA的抑菌效果最差，抑菌率低于40.75%，約為L-cys和SA-cys的一半，且濃度越高，其抑菌率越低。當(dāng)SA-cys或SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.5%時，抑菌率隨濃度增大逐漸升高，表明抑菌效果與其濃度存在一定的相關(guān)性；當(dāng)w（L-cys）≥0.5%時，其抑菌率不隨濃度增大而產(chǎn)生明顯變化。

圖6 不同w（SA），w（L-cys），w（SA-cys）對蠟樣芽孢桿菌抗菌實驗效果Fig.6 Antibacterial test results of SA，L-cys and SA-cys on Bacillus Cereus in various concentrations

3 結(jié)論

a）通過化學(xué)改性法制備了巰基含量高達(dá)328.27 μmol/g的綠色環(huán)保型可食用果蔬保鮮劑SA-cys。

b）FTIR分析表明，SA-cys分子結(jié)構(gòu)中含有SA 和L-cys的特征基團(tuán)。

c）SA-cys具有良好抑菌性，對3種菌株的抑菌效果從大到小為革蘭氏陰性大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌。對革蘭氏陰性大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌的最高抑菌率分別為100.00%和77.24%，與L-cys水平相當(dāng)；對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的作用相對較弱，最高抑菌率只有61.26%。綜合分析各試樣的抑菌效果，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.5%的SA-cys水溶液可作為鮮切蘋果塊保鮮劑。

d）SA-cys綜合了SA的成膜性、可生物降解性和L-cys的良好抑菌性等優(yōu)勢，在鮮切水果保鮮領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

［1］任玉鋒，蘇振峰，馬文平. 3種保鮮劑及其復(fù)合物體外抗靈武長棗采后主要病原菌研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（9）：91-94.

［2］馬成浩. 海藻酸鈉降解防止研究［D］. 無錫：江南大學(xué)，2005.

［3］宗會，胡文玉.海藻酸鈉涂膜對蘋果生理變化的影響［J］. 果樹科學(xué)，1999，16（4）：263-266.

［4］劉嘉俊.海藻酸鈉涂膜對芒果保鮮效果的研究［D］. 廣州：華南理工大學(xué)，2011.

［5］彭勇，李云飛. 殼聚糖和海藻酸鈉涂膜對鮮切荸薺褐變、腐爛和品質(zhì)的影響［J］. 食品工業(yè)科技，2013，34（17）：334-337.

［6］張麗華，張培旗，縱偉，等. 茶多酚/海藻酸鈉膜對鮮切獼猴桃品質(zhì)的影響［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2014，30（12）：182-187.

［7］張林青，王露靜. 海藻酸鈉涂膜對生菜貯藏效果的影響［J］. 北方園藝，2014（8）：122-124.

［8］田密霞，胡文忠，姜愛麗，等. 海藻酸鈉復(fù)合涂膜對鮮切皇冠梨軟化生理的影響［J］. 食品研究與開發(fā)，2009，30（9）：165-168.

［9］鄧靖，譚興和，周曉媛. 丁香油-海藻酸鈉可食性抗菌膜的研制［J］. 食品工業(yè)科技，2009，30（6）：302-305.

［10］陳敏元. L-半胱氨酸及其應(yīng)用的進(jìn)展［J］. 化工進(jìn)展，1992 （2）：26-30.

［11］張福平，林小瓊. 火龍果果皮多酚氧化酶特性的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（7）：57-59.

［12］李粉玲，蔡漢權(quán)，陳艷，等. 火龍果果肉的酶促褐變及其抑制措施［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（6）：999-1002.

［13］Lyidoan N F，Bayindirli A. Effect of L-cysteine kojic acid and 4-hexylresorcinol combination on inhibition of enzymatic browning in Amasya apple juice［J］. Journal of Food Engineering，2004，62（3）：299-304.

［14］孔維寶，陸健，趙海鋒，等. L-半胱氨酸抑制多酚氧化酶的機(jī)制研究［J］. 食品科學(xué)，2007，28（11）：66-70.

［15］陳月開. 半胱氨酸的抑菌作用與類SOD活力［J］. 山西大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，27（1）：65-67.

［16］Parry M F，Neu H C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro［J］. Journal of Clinical Microbiology，1977，5（1）：58-61.

［17］趙愛珍，徐興然，韓文瑜. 二硫鍵對Enterocin A抗李斯特菌LIN3活性的影響［J］. 食品科學(xué)，2011，32（15）：182-185.

［18］Morgavi D P，Boudra H，Jouany J P，et al. Prevention of patulin toxicity on rumen microbial fermentation by SH-containing reducing agents［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（23）：6906-6910.

［19］Jindal A B，Wasnik M N，Nair H A. Synthesis of thiolated alginate and evaluation of mucoadhesiveness，cytotoxicity and release retardant properties［J］. Indian Journal of Pharmaceutical Science，2010，72（6）：766-774.

［20］Bernkop-Schnürch A，Kast C E，Richter M F. Improvement in the mucoadhesive properties of alginate by the covalent attachment of cysteine［J］. Journal of Controlled Release，2001，71（3）：277-285.

［21］Anitha A，Deepa N，Chennazhi K P，et al. Development of mucoadhesive thiolated chitosan nanoparticles for biomedical applications［J］. Carbohydrate Polymers，2011，83（1）：66-73.

［22］Carmen M，Gabriela P A，Larissa G，et al. Synthesis of a thiolβ-cyclodextrin，a potential agent for controlling enzymatic browning in fruits and vegetables［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（47）：11603-11609.

Synthesis of green-edible fresh-keeping agent SA-cys for fruit and vegetable

Liu Yi1， Zhang Xulin2， Zheng Chuanjin2， Li Jianle1， Feng Wei1
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangdong Pharmaceutical University， Zhongshan 528458， China；2. School of Food Science， Guangdong Pharmaceutical University， Zhongshan 528458， China）

L-sodium alginate-cysteine（SA-cys）derivative is synthesized by chemical modification based on the film-forming and water retention of sodium alginate（SA）as well as the antibacterial and antioxidant properties of L-cysteine（L-cys），whose sulfhydryl content can reach 328.27 μmol/g. The results of dilution plate counting method show that：within the testing L-cys performs antibacterial effect on Bacillus Cereus，Escherichia coli（Gram-negative），and Staphylococcus aureus（Gram-positive）；the maximum inhibition rate of SA-cys for Escherichia coli（Gram-negative）and Bacillus Cereus are 100.00% and 77.24% respectively， while that of Gram-positive Staphylococcus aureus is only 61.26%；the maximum inhibition rate of SA on three strains are below 40.75%， indicating worst antibacterial effect. Therefore， SA-sys integrates the superiority of L-cys and SA to expand the application range of SA in fresh keeping for fruits and vegetables.

modified sodium alginate； fresh-keeping agent； fresh-cut fruit； antibacterial property

TQ 322.4

B

1002-1396（2016）04-0015-05

2016-01-30；

2016-04-29。

劉意，男，1973年生，博士，副教授，2015年畢業(yè)于西北工業(yè)大學(xué)材料學(xué)專業(yè)，現(xiàn)主要從事功能高分子合成及其復(fù)合材料的應(yīng)用研究工作。聯(lián)系電話：（0760）88207939；E-mail：Liuyi@gdpu.edu.cn。

廣州市越秀區(qū)科技計劃項目（2014-WS-029）。