基于連作障礙條件下穿山龍?jiān)碥疹惢钚猿煞值暮孔兓?/h1>
2016-08-15 06:25:11尹海波
實(shí)用藥物與臨床 2016年3期
孫 鵬，尹海波，姚 佳
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基于連作障礙條件下穿山龍?jiān)碥疹惢钚猿煞值暮孔兓?/p>
孫鵬1，尹海波2*，姚佳2
1.沈陽市第七人民醫(yī)院，沈陽 110003;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600
[摘要]目的采用高效液相色譜法對不同連作條件下穿山龍中的皂苷類活性成分進(jìn)行含量測定，探討不同連作條件對于穿山龍?jiān)碥疹惢钚猿煞趾康挠绊?。方法采用RP-HPLC，色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(A)-水(B) 為流動相梯度洗脫；流速1.0 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測波長：203 nm，計(jì)算皂苷類成分含量，并采用SPSS等軟件對所得結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果吉林通化種植基地的穿山龍中，除了甲基原薯蕷皂苷為連作一茬3年時含量最高，其他三種皂苷類成分原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷均為正茬4年時最高，而后隨著連作年限的增加，含量逐漸減少，并且原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷含量呈正相關(guān)。結(jié)論穿山龍隨著連作年限的增加，其皂苷類活性成分的含量也隨之下降，說明連作障礙對其皂苷類活性成分的含量積累造成了影響，但正茬4年時其皂苷類成分總含量最高，提示正茬4年為采收最佳時間，這為該藥材的質(zhì)量控制及GAP規(guī)范種植提供了依據(jù)和示范。
[關(guān)鍵詞]穿山龍；高效液相色譜；連作障礙
0 引言
穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的地下干燥根莖[1]，于2015年版《中國藥典》一部中收載[2]，其有效成分為甾體皂苷類。其皂苷和皂苷元有抗腫瘤作用[3-4]，具有很好的藥用價(jià)值，現(xiàn)代已作為甾體激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的重要工業(yè)原料[5]。經(jīng)考察該藥材目前存在野生資源嚴(yán)重匱乏的現(xiàn)狀，巨大的市場需求迫切需要大量種植穿山龍，而種植實(shí)踐中因其連作障礙問題突出，表現(xiàn)為地上葉片生長較弱、植株生長不良、病害嚴(yán)重、不能正常形成具有藥用和商品價(jià)值的根莖，造成產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降。
目前,該藥材多用薯蕷皂苷作為藥材質(zhì)量控制指標(biāo)[6-7]，原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的同時測定也有報(bào)道[8]。本實(shí)驗(yàn)通過對不同連作條件下穿山龍中的皂苷類活性成分進(jìn)行含量測定，探討連作障礙對于穿山龍?jiān)碥疹惢钚猿煞趾康挠绊懀瑸橹笇?dǎo)該藥材GAP規(guī)范種植提供依據(jù)。
1 材料
1.1儀器與試劑Aglient 1100高效液相色譜儀，KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，CP225D電子天平(德國Sartorius公司)，100G藥材粉碎機(jī)(浙江武義屹立工具有限公司)。乙腈為色譜純，乙醇(95%)為分析純，水為重蒸水。薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及纖細(xì)薯蕷皂苷(上海源葉生物工程有限公司，純度≥98%)。
1.2藥材所用穿山龍藥材2013年5月收集于吉林省通化市頭道鎮(zhèn)，具體見表1，經(jīng)本院尹海波教授鑒定為穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino，憑證標(biāo)本保存于本院藥用植物教研室。
表1 藥材采集信息
2 方法與結(jié)果
2.1色譜條件色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；體積流量：1.0 mL/min，流動相：A-乙腈，B-水，梯度洗脫：0～10 min，25%～27%A；10～16 min，27%～35%A；16～20 min，35%～44%A；20～35 min，44%～54%A；35～40 min，54%～56%A；進(jìn)樣量：10 μL。
2.2對照品溶液的制備分別精密稱取原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷對照品2.63、2.02、5.09、2.53 mg，置5 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻備用。
2.3供試品溶液的制備精密稱定穿山龍藥材粉末0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，超聲提取2次，每次加入30倍量75%乙醇15 mL，每次30 min，合并2次濾液，濃縮定容于25 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μL微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。
2.4方法學(xué)考察
2.4.1線性關(guān)系考察精密量取4種對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL注入高效液相色譜儀中，以對照品進(jìn)樣量質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得原薯蕷皂苷回歸方程為Y=93.864 X+9.369 2，r=0.999 6，線性范圍為0.21～1.05 μg；得纖細(xì)薯蕷皂苷回歸方程為Y=91.922 X+31.07，r=0.999 5，線性范圍為0.01～4.04 μg；得甲基原薯蕷皂苷回歸方程為Y=75.376 X+117.35，r=0.999 5，線性范圍為2.036～20.36 μg；得薯蕷皂苷回歸方程為Y=170 X+47.811，r=0.999 6，線性范圍為1.01～10.1 μg。結(jié)果表明線性關(guān)系良好。
2.4.2精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品試液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的峰面積RSD分別為0.7%、0.9%、0.6%和0.8%(n=6)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度符合規(guī)定。
2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取混合均勻的藥材粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積并計(jì)算原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的含量，RSD分別為1.9%、2.3%、1.7%和1.8%(n=6)。結(jié)果表明，待測組分重復(fù)性良好。
2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品試液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10 h測定原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的峰面積，RSD分別為1.6%、1.2%、1.1%和2.0%。結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.5加樣回收率試驗(yàn)取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥材粉末6份，精密稱定，每份0.25 g，每組按低、中、高濃度分別加入相當(dāng)于藥材含量80%、100%、120%的各對照品溶液(n=2)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，計(jì)算得原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的平均回收率分別為99.9%、99.8%、100.1%和98.6%，RSD分別為0.7%、0.8%、1.1%和1.5%，說明該方法準(zhǔn)確率較高。結(jié)果見表2。
2.5樣品測定分別取供試品溶液和對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，以外標(biāo)法計(jì)算各樣品中原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的含量，色譜圖見圖1，結(jié)果見表3。
2.6相關(guān)分析利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對4種皂苷類活性成分進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算得原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的Pearson簡單相關(guān)系數(shù)r=0.973，雙側(cè)檢驗(yàn)P=0.001，在0.01水平上，兩指標(biāo)呈顯著相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表2 加樣回收率試驗(yàn)
圖1 混合對照品HPLC色譜圖(上)及樣品HPLC色譜圖 (下)
生長年限 正茬2年正茬3年正茬4年連作一茬1年連作一茬3年連作二茬4年原薯蕷皂苷04.0024.7532.1541.9091.562纖細(xì)薯蕷皂苷00.0564.631000甲基原薯蕷皂苷8.14344.04993.74738.464116.48630.225薯蕷皂苷4.80924.84433.80921.18516.99113.982皂苷類成分總含量12.95172.951136.93961.802135.38645.77
3 討論
3.1本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定了穿山龍中皂苷類活性成分的含量，其方法簡單、快速、準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可用于該藥材的質(zhì)量控制。
3.2通過對皂苷類成分的相關(guān)性分析可知，吉林通化種植基地的穿山龍藥材中，原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷的含量呈正相關(guān)。
3.3由表3可以看出，吉林通化種植基地的穿山龍中，三種皂苷類成分原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷均為正茬4年時最高，甲基原薯蕷皂苷為連作一茬3年時含量最高，但正茬4年的甲基原薯蕷皂苷含量僅次于連作一茬3年的，且正茬4年的皂苷類成分總含量為最高，提示正茬4年為采收最佳時間，這為穿山龍的合理種植及品質(zhì)評價(jià)提供了參考和依據(jù)。
3.4從表3還可看出，隨著連作年限的增加，穿山龍?jiān)碥疹惓煞挚偤恳搽S之下降，說明連作障礙對其皂苷類活性成分的含量積累造成了影響，從而證明連作不利于穿山龍的種植栽培，這與實(shí)踐種植生產(chǎn)的情況亦相符。由以上分析可知，種植栽培穿山龍忌連作，應(yīng)在正茬4年即對穿山龍進(jìn)行采收以保證其皂苷類含量最高，從而獲得高質(zhì)量的穿山龍藥材，這為探討該藥材連作障礙的機(jī)理，指導(dǎo)該藥材GAP規(guī)范的種植提供了依據(jù)。
參考文獻(xiàn)：
[1]肖培根.新編中藥志.第1卷[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:745.
[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:250.
[3]陳信義,高志捷,王玉芝,等.薯蕷皂苷抗移植性小鼠乳腺癌作用的研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005,12(5)：23.
[4]王麗娟,王巖,陳聲武,等.薯蕷皂苷元體內(nèi)、外的抗腫瘤作用[J].中國中藥雜志,2002,27(10):777.
[5]中國藥材公司.中國中藥資源志要[M].北京:科學(xué)出版社,1994:1414.
[6]李克明，董瑩，張永文，等.RP-HPLC法測定穿山龍中薯蕷皂苷的含量[J].藥物分析雜志，2004，24(6)：640-641.
[7]祁偉，何鍵，及元喬，等.HPLC-ELSD法測定兩種薯蕷屬植物中薯蕷皂苷的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19：84-86.
[8]劉中博，王鐵杰，盧忠強(qiáng)，等.HPLC法同時測定穿龍薯蕷中薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷[J].中草藥，2008，39(5)：774-776.
收稿日期：2015-12-01
*通信作者
DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603021
Change of the content of active ingredient saponins inDioscoreaenipponicaeRhizoma under conditions of continuous cropping obstacle
SUN Peng1，YIN Hai-bo2*，YAO Jia2
(1.Shenyang No.7 People′s Hospital,Shenyang 110003,China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)
【Abstract】ObjectiveHPLC method is used to determine the content of active ingredient saponins in Dioscoreae nipponicae Rhizoma under different conditions of continuous cropping obstacle and to study the effect of continuous cropping obstacle on the content of active ingredient saponins.MethodsSamples were achieved and separated by Agilent TC-C18column( 250 mm×4.6 mm，5 μm)with acetonitrile-water as mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 35 ℃,the UV detector was set at 203 nm,ingredients saponins content was calculated,and SPSS software was used to analyze the results.ResultsIn the Dioscoreae nipponicae Rhizoma,in the plantation base in Tonghua of Jilin province,except Methyl protodioscin which had the highest content at 3 years,the other three saponins,including protodioscin,diosgenin slim and dioscin had the highest content at four years,and then with the increase of years,the content gradually decreased,and the content of protodioscin and diosgenin was positively correlated.ConclusionWith the increase of continuous cropping,the content of active ingredient saponins in Dioscoreae nipponicae Rhizoma decreases,which indicates that continuous cropping obstacle affects the content accumulation of active ingredient saponins.Due to the fact that the content is the highest at four years,4 years is the best time to harvest, which provide the basis and model for the quality control of the medicine and for GAP standerdized planting.
Key words：Dioscoreae nipponicae Rhizoma；HPLC；Continuous cropping obstacle
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1 材料
1.1儀器與試劑Aglient 1100高效液相色譜儀，KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，CP225D電子天平(德國Sartorius公司)，100G藥材粉碎機(jī)(浙江武義屹立工具有限公司)。乙腈為色譜純，乙醇(95%)為分析純，水為重蒸水。薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及纖細(xì)薯蕷皂苷(上海源葉生物工程有限公司，純度≥98%)。
1.2藥材所用穿山龍藥材2013年5月收集于吉林省通化市頭道鎮(zhèn)，具體見表1，經(jīng)本院尹海波教授鑒定為穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino，憑證標(biāo)本保存于本院藥用植物教研室。
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2 方法與結(jié)果
2.1色譜條件色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；體積流量：1.0 mL/min，流動相：A-乙腈，B-水，梯度洗脫：0～10 min，25%～27%A；10～16 min，27%～35%A；16～20 min，35%～44%A；20～35 min，44%～54%A；35～40 min，54%～56%A；進(jìn)樣量：10 μL。
2.2對照品溶液的制備分別精密稱取原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷對照品2.63、2.02、5.09、2.53 mg，置5 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻備用。
2.3供試品溶液的制備精密稱定穿山龍藥材粉末0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，超聲提取2次，每次加入30倍量75%乙醇15 mL，每次30 min，合并2次濾液，濃縮定容于25 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μL微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。
2.4方法學(xué)考察
2.4.1線性關(guān)系考察精密量取4種對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL注入高效液相色譜儀中，以對照品進(jìn)樣量質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得原薯蕷皂苷回歸方程為Y=93.864 X+9.369 2，r=0.999 6，線性范圍為0.21～1.05 μg；得纖細(xì)薯蕷皂苷回歸方程為Y=91.922 X+31.07，r=0.999 5，線性范圍為0.01～4.04 μg；得甲基原薯蕷皂苷回歸方程為Y=75.376 X+117.35，r=0.999 5，線性范圍為2.036～20.36 μg；得薯蕷皂苷回歸方程為Y=170 X+47.811，r=0.999 6，線性范圍為1.01～10.1 μg。結(jié)果表明線性關(guān)系良好。
2.4.2精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品試液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的峰面積RSD分別為0.7%、0.9%、0.6%和0.8%(n=6)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度符合規(guī)定。
2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取混合均勻的藥材粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積并計(jì)算原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的含量，RSD分別為1.9%、2.3%、1.7%和1.8%(n=6)。結(jié)果表明，待測組分重復(fù)性良好。
2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品試液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10 h測定原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的峰面積，RSD分別為1.6%、1.2%、1.1%和2.0%。結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.5加樣回收率試驗(yàn)取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥材粉末6份，精密稱定，每份0.25 g，每組按低、中、高濃度分別加入相當(dāng)于藥材含量80%、100%、120%的各對照品溶液(n=2)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，計(jì)算得原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的平均回收率分別為99.9%、99.8%、100.1%和98.6%，RSD分別為0.7%、0.8%、1.1%和1.5%，說明該方法準(zhǔn)確率較高。結(jié)果見表2。
2.5樣品測定分別取供試品溶液和對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，以外標(biāo)法計(jì)算各樣品中原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷及薯蕷皂苷的含量，色譜圖見圖1，結(jié)果見表3。
2.6相關(guān)分析利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對4種皂苷類活性成分進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算得原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的Pearson簡單相關(guān)系數(shù)r=0.973，雙側(cè)檢驗(yàn)P=0.001，在0.01水平上，兩指標(biāo)呈顯著相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表2 加樣回收率試驗(yàn)
圖1 混合對照品HPLC色譜圖(上)及樣品HPLC色譜圖 (下)
生長年限 正茬2年正茬3年正茬4年連作一茬1年連作一茬3年連作二茬4年原薯蕷皂苷04.0024.7532.1541.9091.562纖細(xì)薯蕷皂苷00.0564.631000甲基原薯蕷皂苷8.14344.04993.74738.464116.48630.225薯蕷皂苷4.80924.84433.80921.18516.99113.982皂苷類成分總含量12.95172.951136.93961.802135.38645.77
3 討論
3.1本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定了穿山龍中皂苷類活性成分的含量，其方法簡單、快速、準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可用于該藥材的質(zhì)量控制。
3.2通過對皂苷類成分的相關(guān)性分析可知，吉林通化種植基地的穿山龍藥材中，原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷的含量呈正相關(guān)。
3.3由表3可以看出，吉林通化種植基地的穿山龍中，三種皂苷類成分原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷均為正茬4年時最高，甲基原薯蕷皂苷為連作一茬3年時含量最高，但正茬4年的甲基原薯蕷皂苷含量僅次于連作一茬3年的，且正茬4年的皂苷類成分總含量為最高，提示正茬4年為采收最佳時間，這為穿山龍的合理種植及品質(zhì)評價(jià)提供了參考和依據(jù)。
3.4從表3還可看出，隨著連作年限的增加，穿山龍?jiān)碥疹惓煞挚偤恳搽S之下降，說明連作障礙對其皂苷類活性成分的含量積累造成了影響，從而證明連作不利于穿山龍的種植栽培，這與實(shí)踐種植生產(chǎn)的情況亦相符。由以上分析可知，種植栽培穿山龍忌連作，應(yīng)在正茬4年即對穿山龍進(jìn)行采收以保證其皂苷類含量最高，從而獲得高質(zhì)量的穿山龍藥材，這為探討該藥材連作障礙的機(jī)理，指導(dǎo)該藥材GAP規(guī)范的種植提供了依據(jù)。
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收稿日期：2015-12-01
*通信作者
DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603021
Change of the content of active ingredient saponins inDioscoreaenipponicaeRhizoma under conditions of continuous cropping obstacle
SUN Peng1，YIN Hai-bo2*，YAO Jia2
(1.Shenyang No.7 People′s Hospital,Shenyang 110003,China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)
【Abstract】ObjectiveHPLC method is used to determine the content of active ingredient saponins in Dioscoreae nipponicae Rhizoma under different conditions of continuous cropping obstacle and to study the effect of continuous cropping obstacle on the content of active ingredient saponins.MethodsSamples were achieved and separated by Agilent TC-C18column( 250 mm×4.6 mm，5 μm)with acetonitrile-water as mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 35 ℃,the UV detector was set at 203 nm,ingredients saponins content was calculated,and SPSS software was used to analyze the results.ResultsIn the Dioscoreae nipponicae Rhizoma,in the plantation base in Tonghua of Jilin province,except Methyl protodioscin which had the highest content at 3 years,the other three saponins,including protodioscin,diosgenin slim and dioscin had the highest content at four years,and then with the increase of years,the content gradually decreased,and the content of protodioscin and diosgenin was positively correlated.ConclusionWith the increase of continuous cropping,the content of active ingredient saponins in Dioscoreae nipponicae Rhizoma decreases,which indicates that continuous cropping obstacle affects the content accumulation of active ingredient saponins.Due to the fact that the content is the highest at four years,4 years is the best time to harvest, which provide the basis and model for the quality control of the medicine and for GAP standerdized planting.
Key words：Dioscoreae nipponicae Rhizoma；HPLC；Continuous cropping obstacle
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