齊淑貞王少明張瑞麗周斌兵尤志學(xué)蘇曉紅王千秋

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·論著·

HPV感染宮頸組織中14-3-3σ表達及啟動子甲基化水平檢測

齊淑貞1王少明2張瑞麗3周斌兵4尤志學(xué)4蘇曉紅1王千秋1

目的： 檢測HPV感染宮頸組織中14-3-3σ啟動子甲基化與14-3-3σ mRNA的表達。方法： 采用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測26例宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌，39例宮頸尖銳濕疣及35例對照標本中14-3-3σ基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，Q-PCR法檢測14-3-3σ mRNA表達，Western Blot檢測14-3-3σ蛋白的表達。結(jié)果： 宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組中14-3-3σ基因啟動子區(qū)CpG島甲基化率為73.08%，明顯高于對照組的22.86%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；尖銳濕疣組為17.94%與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組的14-3-3σ mRNA及蛋白表達較對照組減少，宮頸尖銳濕疣組14-3-3σ mRNA及蛋白表達較對照組增加。結(jié)論： HPV感染宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組織中14-3-3σ表達減少可能與14-3-3σ啟動子高甲基化相關(guān)。

尖銳濕疣； 人乳頭瘤病毒； 宮頸上皮內(nèi)瘤變； 宮頸原位鱗癌； 甲基化； 14-3-3σ

大量的流行病學(xué)、臨床及動物實驗研究表明宮頸癌是high risk-HPV（HR-HPV）感染引起，宮頸癌和宮頸CIN極少由低危HPV感染引起，CIN是宮頸癌的癌前病變，宮頸CIN的分級與宮頸癌關(guān)系密切，CIN3極易轉(zhuǎn)化為宮頸癌；宮頸尖銳濕疣多見于lowrisk-HPV（LR-HPV）感染。引起LR-HPV和HRHPV感染致癌潛能不同，關(guān)鍵在于E6、E7兩個主要病毒致癌蛋白對腫瘤抑制蛋白p53和pRb的調(diào)節(jié)作用。HR-HPV感染宿主上皮細胞后，E6癌蛋白大量表達，這時E6通過E6-AP（泛素化）與p53結(jié)合，引起p53的快速降解，損傷的DNA得不到修復(fù)。14-3-3σ（stratifin，SFN）是一種重要的細胞周期負調(diào)節(jié)蛋白，參與細胞增殖周期G2-M檢查點的控制，受p53直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是p53的下游基因，而且能正反饋增強p53的活性，從而發(fā)揮抑制E6癌基因的功能［1-3］。

14-3-3σ表達缺失高頻率的存在于多種上皮細胞類腫瘤中，如乳腺癌、胃癌等，其機制系14-3-3σ啟動子甲基化［4，5］。我們的前期HPV感染宮頸組織的蛋白組學(xué)研究顯示，14-3-3σ在HR-HPV感染的宮頸SCC［6］中低表達，國外 Sano等［7］研究結(jié)果是HR-HPV感染宮頸CIN和CC組織中14-3-3σ高表達。針對14-3-3σ在不同研究中的表達差異，本研究利用基因芯片技術(shù)對宮頸CA、宮頸CIN3+SCC組織中HPV進行基因分型檢測，Q-PCR和western檢測14-3-3σ的表達，并進行14-3-3σ啟動子甲基化的檢測，探討14-3-3σ在LR-HPV和HR-HPV感染組織標本中的表達及其分子作用機制。

1　材料和方法

1.1材料來源 39例尖銳濕疣組織標本取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病科患者；26例宮頸CIN和宮頸原位鱗癌組織標本取自于江蘇省人民醫(yī)院宮頸病中心及婦科，為病理確診后的手術(shù)標本；35例對照取自于江蘇省人民醫(yī)院宮頸病中心錐切HPV陰性且病理排除CIN的標本；所有標本為2005-2007年博士生課題期間所取，標本獲取后均立刻置液氮罐后轉(zhuǎn)移到-70℃保存。

1.2主要試劑 兔抗人14-3-3σ蛋白多克隆抗體（美國 abcam公司），HPV-DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），HPV核酸擴增分型檢測試劑盒（香港凱普公司），蛋白抽提試劑盒、Western Blotting檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒均購自南京凱基生物公司；TRIzol（美國Thermo Fisher）、cDNA第一鏈合成試劑盒（美國 Thermo Fisher）、Real time PCR Master Mix （SYBR Green日本TOYOBO）；基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司DP304），甲基化處理試劑盒（美國ZYMO公司D5006），DNA純化回收試劑盒（天根生化科技有限公司DP209-03），Taq酶、PCR相關(guān)試劑（日本Takara公司R007a）。

1.3HPV分型檢測 冷凍組織標本收集于1.5 mL微量離心管中，用DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA，Eppendoff蛋白核酸自動分析儀檢測濃度。然后嚴格按照HPV核酸擴增分型檢測試劑盒（香港凱普公司）說明書進行操作，該試劑盒可以檢測21種HPV亞型，包括高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，低危型HPV6、11、42、43、44、CPB304。

1.4組織中14-3-3σQ PCR檢測 總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成，組織標本總RNA提取，按照試劑盒操作說明進行。14-3-3σ引物：正義鏈：5-TGATCCCCAATGCTTCACAAG-3；反義鏈，5-GCCAAGTAACGGTAGTAATCTCC-3；產(chǎn)物大小為76 bp。內(nèi)參照GAPDH：正義鏈，5-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3；反義鏈，5-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3；產(chǎn)物大小為115 bp。引物合成是由南京金斯瑞科技有限公司完成。反應(yīng)體系：2x Realltime PCR Master Mix（SYBR Green）10μL，引物 MIX（F/R各為 10 μM），2 μL，模板（cDNA稀釋 10倍）1 μL，0.1% DEPC水7 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃延伸40 s。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.5組織中14-3-3σ的Western印跡分析 稱取冰凍組織100 mg，加入1 mL冷Lysis Buffer，（10 μL磷酸酶抑制劑，1 μL蛋白酶抑制劑和 5 μL 100mM PMSF，混勻），冰上勻漿，將勻漿液4℃10 000 r/min離心5 min，留取上清，用Bradford法測蛋白質(zhì)濃度，凍存?zhèn)溆?。取適量蛋白質(zhì)提取液加入等量的2x上樣緩沖液，煮沸5 min后上樣，每孔控制總蛋白上樣量30 μg，分離膠90 V，濃縮膠60 V，200 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，一抗1∶500稀釋，二抗1∶5000稀釋，使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL），凝膠成像分析系統(tǒng)成像，最后使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進行灰度分析。所有操作根據(jù)Western印跡分析試劑盒說明進行。

1.6MSP檢測組織中14-3-3σ啟動子甲基化 取組織標本約10 mg，參照基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司DP304）說明提取基因組DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組 DNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩⒄占谆幚碓噭┖校绹鳽YMO公司D5006）說明書進行重亞硫酸鹽處理基因組DNA，然后參照DNA純化回收試劑盒（天根生化科技有限公司DP209-03）說明書進行DNA的純化回收。純化后的DNA-80℃保存?zhèn)溆谩?4-3-3σ甲基化引物序列：正義鏈，5-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC-3；反義鏈，5-CCTCTAACCGCCCACCACGG-3；擴增產(chǎn)物大小為105 bp；14-3-3σ非甲基化引物序列：正義鏈，5-ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT-3；反義鏈，5 -CCCTCTAACCACCCACCACA-3，擴增產(chǎn)物大小為106 bp。PCR擴增：25 μL的PCR反應(yīng)體系中依次加入ddH2O 15.5 μL，10x buffer 2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，甲基化或非甲基化上下游引物各0.75 μL，DNA模板1.5 μL，MgCL2（20 μM）1.5 μL PCR反應(yīng)條件：95℃總變性5 min，接著加入Taq酶1.5 U，然后95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min取5 μL PCR產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳。紫外凝膠成像系統(tǒng)進行掃描采集圖像。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇卡方檢驗和t檢驗，所有數(shù)據(jù)均在SPSS 17.0軟件包中進行分析。

2　結(jié)果

2.1HPV分型結(jié)果 尖銳濕疣組：低危型感染31例（79.49%），其中HPV6陽性19例，HPV11陽性9例，HPV42陽性2例、HPV44陽性1例；高危感染3例（7.69%），均為HPV33；混合感染5例（12.82%），為HPV6合并HPV33陽性3例。HPV11混合HPV31陽性1例，HPV11混合 HPV33/35陽性1例。宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組，全為高危單一感染15例（57.69%）、高?；蛐突旌细腥?例（30.77%）或高?；蛐突旌系臀Ｐ透腥?例（11.54%）：HPV16陽性8，HPV18陽性7例，HPV16混合HPV18陽性4例，HPV16混合HPV35陽性1例，HPV16混合33、35陽性1例，HPV18混合HPV33、HPV18混合HPV35陽性各1例，HPV6混合18、33陽性2例，HPV11混合HPV18、33陽性1例。

2.214-3-3σ mRNA表達 39例尖銳濕疣標本，14 -3-3σ mRNA表達0.735±0.096，與對照組比較0.734 ±0.037，t=0.039，P＞0.05，宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組中14-3-3σ mRNA表達為0.288±0.014，明顯低于對照組0.734±0.037，t=-43.307，P＜0.05。尖銳濕疣組與宮頸癌組比較，t=17.936，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3Western blot檢測14-3-3σ蛋白表達 26例CIN3+宮頸原位鱗癌組，26例中有21（80.80%）例14 -3-3σ蛋白表達基本缺失，4例低表達，2例高表達。而在對照組和宮頸尖銳濕疣組織標本中，Westernblot證明這些標本中14-3-3σ均有較高的表達。

2.414-3-3σ基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況 宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組中14-3-3σ基因啟動子區(qū)CpG島甲基化率為73.08%（19/26），明顯高于對照組22.86%（8/35），χ2=15.25，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；尖銳濕疣組為17.94%（7/39），和對照組22.86% （8/35）相比，χ2=0.769，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1　14-3-3σ基因啟動子區(qū)甲基化修飾后PCR擴增凝膠電泳圖

3　討論

不同基因型HPV在生殖器部位感染引起不同臨床表現(xiàn)及病理表現(xiàn)一直是值得研究的問題，LR-HPV感染與尖銳濕疣相關(guān)，HR-HPV感染可以導(dǎo)致宮頸CIN或?qū)m頸癌等。本研究通過基因芯片法檢測，結(jié)果顯示，CA中低?；蛐蛦我桓腥菊?9.49%，高?；蛐透腥?.69%，混合型感染12.82%。宮頸CIN3+宮頸SCC組，全部為高?；蛐蛦我桓腥?15例（57.69%）、高?；蛐突旌细腥?例（30.77%）或高?；蛐突旌系臀Ｐ透腥?例（11.54%）。這個結(jié)果與齊淑貞等［8］曾用luminex法檢測宮頸標本中HPV分型基本一致。

14-3-3σ被認為是表皮細胞特異性標志物（human mammary epithelial 1，HME1）［9，10］，對皮膚而言14-3-3σ蛋白表達水平增加引起角化細胞從上皮細胞干細胞池中釋放，同時，分化的真皮層角化細胞在層化過程中移向外層皮膚層，另外，它在分化的鱗狀上皮細胞中含量也比較豐富，所以在本研究表現(xiàn)為表皮過度角化的宮頸CA標本中，14-3-3σ表達是增加的，但它與對照組相比（Q-PCR），t=0.039，P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異，因為CA僅是表皮細胞的增生活躍，或細胞成熟延遲使表皮細胞不能及時成熟角化脫離，并未引起質(zhì)變。

14-3-3σ是抑癌基因，位于p53的下游，其負反饋調(diào)節(jié)機制有（1）細胞增殖周期 G2-M檢查點（checkpoint）的控制：14-3-3σ含有細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）結(jié)合基序，當細胞DNA受到損傷時，抑瘤蛋白p53誘導(dǎo)14-3-3σ表達，上調(diào)的14-3-3σ蛋白通過與CDK1、CDK2、CDK4等有絲分裂激酶結(jié)合而阻止它們進入細胞核，將細胞周期阻滯于G2/M期，以維持基因組的穩(wěn)定性。同時14-3-3σ通過拮抗E6-AP對p53泛素化降解和p53核外排，以及增加p53寡聚化而增強p53的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性［11］；（2）有絲分裂過程中蛋白質(zhì)翻譯的分子開關(guān)作用：14-3-3σ表達缺失在引起有絲分裂災(zāi)難的同時將導(dǎo)致非二倍體細胞和雙核細胞的產(chǎn)生，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險［12，13］；（3）細胞凋亡信號調(diào)節(jié)作用：14-3-3σ可能競爭性抑制bad對Akt的作用，來參與對細胞凋亡的信號調(diào)控［14］。本研究的宮頸CIN3+SCC標本中，HR-HPV感染達到100%，14-3-3σ表達下調(diào)。這個結(jié)果與Holm R等用免疫組化方法研究14-3-3σ在宮頸癌低表達或缺失見于腫瘤早期階段，與宮頸癌分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)的結(jié)果基本一致，但Holm未探討與HPV感染的相關(guān)性［15］。Sano等［7］研究的結(jié)果是HR-HPV感染宮頸CIN和CC組織中14-3-3σ高表達，Syrj?nen等［16］研究47.6%～72.2%HR-HPV感染宮頸CIN2-CIN3組織中14-3-3σ高表達，22.5%HR-HPV感染的宮頸CIN2-CIN3組織中14-3-3σ低表達。

CpG島甲基化所致的14-3-3σ低表達或基因沉默被認為是腫瘤發(fā)病的重要因素之一，Liu等發(fā)現(xiàn)14 -3-3σ在人類黑素細胞和絕大多數(shù)黑色素瘤細胞系中處于超甲基化狀態(tài)，該基因的表達沉默在人類黑色素瘤的發(fā)病中起重要作用［17］。Yi［18］發(fā)現(xiàn)14-3-3σ啟動子甲基化存在于 4種鼻咽癌細胞系（CNE1，CNE2，5-8F，6-10B）中，而不存在于正常鼻咽部上皮細胞系 NP69中，相比于鼻咽部癌旁上皮組織的28%，14-3-3σ啟動子甲基化在鼻咽癌組織中發(fā)生率更高（84%）。本研究在宮頸CIN3+宮頸原位鱗癌組中14-3-3σ基因啟動子區(qū) CpG島甲基化率為73.08%（19/26），明顯高于對照組22.86%（8/35），χ2=15.25，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；這個和Yi在鼻咽癌組織與癌旁組織中的檢測相似。Syrj?nen等［16］的研究發(fā)現(xiàn)大部分HR-HPV+標本14-3-3σ是高表達的，其原因系因HR-HPV感染使得14-3-3σ繞過了對G1/S和G2/M節(jié)點的控制，僅有22.5%HRHPV+標本14-3-3σ低表達系因啟動子甲基化引起，這個在這項研究中占比很小的部分與我們的研究結(jié)果一致。齊淑貞等［6］前期在HPV高低?；蛐透腥緦m頸組織的蛋白組學(xué)差異，即發(fā)現(xiàn)14-3-3σ在HPV高?；蛐透腥镜膶m頸CIN中表達明顯減少，本研究發(fā)現(xiàn)這個減少系因14-3-3σ基因啟動子區(qū)CpG島甲基化所致，與多種上皮類腫瘤中14-3-3σ減少的機制相同，推測HR-HPV感染宿主上皮細胞后，E6癌蛋白大量表達，這時E6通過E6-AP（泛素化）與p53結(jié)合，引起p53的快速降解。而14-3-3σ受p53直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它與p53結(jié)合后可以不被MDM2介導(dǎo)的泛素化降解，14-3-3σ基因啟動子甲基化致其低表達，不能穩(wěn)定p53，降解加快，抑癌功能降低，受損細胞的DNA不能正常通過G2/M檢查點進行有絲分裂，有的細胞畸變成癌前細胞或癌細胞［19］。

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（收稿：2016-03-24 修回：2016-05-17）

Expression of 14-3-3σ and the detection of methylation of 14-3-3σ gene promoter in the cervix with HPV infection

QI Shuzhen1，WANG Shaoming2，ZHANG Ruili3，ZHOU Binbing4，YOU Zhixue4，SU Xiaohong1，WANG Qianqiu1.
1.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing 210042，China；2.Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China；3.Department of Dermatology，Wuxi Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Wuxi NO.2 People's Hospital，Wuxi 214002，China；4.Department of Gynecology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China
Corresponding authors：WANG Qianqiu，E-mail：wangqq@ncstdlc.org SU Xiaohong，E-mail：suxh@ncstdlc.org

Objective：To detect the level of methylation of 14-3-3σ gene promoter region，and the expression of 14-3-3σ mRNA and protein in cervix with HPV infection.Methods：The levels of methylation of 14-3-3σ gene promoter CPG island，and the expression of 14-3-3σ mRNA and protein were detected by methylation-specific PCR，Q-PCR and western-blot respectively in 39 cases with cervical condyloma accuminatum（CA），35 controls and 26 cases with cervical intraepithelial neoplasia（CIN3）complicated with cervical squamous cell carcinoma（SCC）.Results：The rate of the methylation of 14-3-3σ gene promoter CPG island in the samples of SCC was 73.08%，which was higher than that in control group（22.86%），with a significant difference（P＜0.05）.There was no significant difference in the rate between the samples of CA （17.94%）and of controls（P＞0.05）.The expression of 14-3-3σ mRNA and protein in the patients with CIN3 complicated with SCC was lower than that in controls（P＜0.05）.The expression of 14-3-3σ mRNA and protein in the patients with CA was higher than those in controls（P＜0.05）.Conclusion：The reduced expression of 14-3-3σ in the patients with CIN3 complicated with SCC may be associated with the hypermethylation of 14-3-3σ gene promoter region.

condyloma accuminatum；HPV；CIN；squamous cell carcinoma；methylation；14-3-3σ

蘇曉紅，E-mail：suxh@ncstdlc.org

若干皮膚病性病省內(nèi)診療體系建設(shè)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究（編號：BL2012007）

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院，南京，210042

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，北京，100021

3南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院皮膚科，江蘇無錫，214002

4南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南京，210029

王千秋，E-mail：wangqq@ncstdlc.org