邵 寧, 程代薇, 曾 琪, 鄭慶桂, 錢(qián) 寧, 吳曙光

作者單位：563003 貴州 遵義，遵義醫(yī)學(xué)院(邵 寧,曾 琪)；貴州省人民醫(yī)院 燒傷整形科(程代薇,鄭慶桂);貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(錢(qián) 寧,吳曙光)

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GPER介導(dǎo)雌激素對(duì)兔耳增生性瘢痕的影響

邵 寧, 程代薇, 曾 琪, 鄭慶桂, 錢(qián) 寧, 吳曙光

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體； 增生性瘢痕； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

皮膚及其附件是雌激素(E2)的重要靶器官之一，所以,E2對(duì)于瘢痕的形成具有影響作用[1]。有研究表明，通過(guò)阻斷E2來(lái)治療瘢痕增生是有效的[2]。但是，如果單純?yōu)榱俗钄囫：凵L(zhǎng)而直接抑制E2會(huì)帶來(lái)各種嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、心血管疾病、更年期綜合征等[3],而這些不良反多以E2核受體為主導(dǎo)，G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein coupled estrogen receptorgper, GPER)對(duì)其影響相對(duì)較小。研究還發(fā)現(xiàn)，GPER與多種腫瘤細(xì)胞的增殖存在密切關(guān)系，而增生性瘢痕與腫瘤也有相似的細(xì)胞學(xué)特性。自2015年3～9月，我們通過(guò)建立兔耳增生性瘢痕模型，局部應(yīng)用17-β-雌二醇(E2)、GPER特異性激動(dòng)劑(G1)和拮抗劑(G15)來(lái)觀察瘢痕的增生情況，并檢測(cè)瘢痕增生的相關(guān)因子和GPER的mRNA表達(dá)量，以探討GPER在對(duì)增生性瘢痕的影響，為臨床治療增生性瘢痕提供新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇3～6個(gè)月齡健康的新西蘭大耳兔36只(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，均為雌性；體質(zhì)量2.5～3.0 kg。將36只兔造模后隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、DMSO組、E2組、G1組、 E2+G15組、G1+G15組；每組6只。

1.2 主要材料與儀器

17-β-雌二醇(E2)和二甲基亞砜(DMSO；美國(guó)SIGMA公司)；GPER特異性激動(dòng)劑(G1)及其特異性拮抗劑(G15；美國(guó)CAYMAN公司)；鹽酸氯胺酮(英國(guó)TOCRIS公司)；鹽酸塞拉嗪(英國(guó)LGC公司)；戊巴比妥鈉(德國(guó)MERCK公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔耳瘢痕模型制備 參照文獻(xiàn)[4]方法：每只兔給予肌注氯胺酮(40 mg/kg)和鹽酸塞拉嗪(4 mg/kg)麻醉后，用無(wú)菌手術(shù)刀在兔的單側(cè)耳腹面共做6個(gè)直徑為10 mm的圓形創(chuàng)面，間距大于15 mm,深達(dá)軟骨層并刮除軟骨膜，創(chuàng)面暴露，自然愈合。每日觀察創(chuàng)面情況，確保創(chuàng)面干燥無(wú)感染。

1.3.2 分組給藥及組織處理 參照小鼠的皮下給藥劑量[5]，根據(jù)體表面積直接換算法[6]，設(shè)計(jì)出給藥方案。E2組、G1組、 E2+G15組、G1+G15組4個(gè)給藥組分別用微量注射器在兔耳根部皮下注射。注射劑量：E2(0.025 mg/kg·d),G1(0.06 mg/kg·d),G15(0.06 mg/kg·d)。DMSO組注射經(jīng)PBS稀釋為10%DMSO溶液；對(duì)照組不予任何處理。從第15天開(kāi)始給藥[7]，連續(xù)給藥15 d后取標(biāo)本。采用戊巴比妥鈉90 mg/kg于兔心內(nèi)注射，將其處死；距瘢痕邊緣0.5 mm切取標(biāo)本,并經(jīng)瘢痕最高點(diǎn)將其一分為二，分別放入10%甲醛及RNAiso Plus液中固定，保存于-80℃冰箱中。

1.3.3 組織學(xué)檢測(cè) 將切取標(biāo)本在10%甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，并切成5 μm厚，分別進(jìn)行HE染色和MASSON 染色，用于光鏡下組織學(xué)觀察及瘢痕增生指數(shù)測(cè)量(圖1)[8]。

圖1 瘢痕增生指數(shù)

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)增生性瘢痕組織中TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達(dá) 將兔耳瘢痕組織標(biāo)本浸于TRIZOL試劑并提取總RNA后，利用PrimeScript?RT Master Mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)其在目的基因ncbi庫(kù)中的對(duì)應(yīng)序列，利用PRIMER 5軟件分別設(shè)計(jì)特異引物(表1)。最后選擇GAPDH 為內(nèi)參，通過(guò)SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。記錄各樣本Ct值作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，利用 2-ΔΔCt公式計(jì)算各個(gè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

表1 各基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 瘢痕形態(tài)學(xué)觀察

E2和G1組較對(duì)照組瘢痕明顯凸出皮表，顏色較深，多呈暗紅色，中央部最為厚實(shí)，質(zhì)地較硬；經(jīng)G15處理后，瘢痕中央厚度明顯降低，顏色較淺呈粉紅色，部分與正常皮膚接近，質(zhì)地明顯變軟；而DMSO組與對(duì)照組差別較小(圖2)。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 HE 染色 經(jīng)HE染色后鏡檢，E2組和G1組存在大量的成纖維細(xì)胞，血管生長(zhǎng)豐富，細(xì)胞外基質(zhì)有大量沉積，膠原纖維多且粗大；經(jīng)G15處理后，成纖維細(xì)胞明顯減少，血管分布較少，細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少，膠原纖維也相對(duì)減少；DMSO組相對(duì)于空白對(duì)照組的變化不明顯。見(jiàn)圖3。

2.2.2 Masson 染色 經(jīng)Masson染色后鏡檢，E2組和G1組的膠原纖維致密粗大，排列紊亂；經(jīng)G15處理后，膠原纖維稀疏，排列較整齊；DMSO組相對(duì)于空白對(duì)照組的膠原纖維差別較小(圖4)。

2.3 瘢痕增生指數(shù)

E2和G1明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，E2+G15組和G1+G15組分別低于E2和G1組(P<0.05)，而空白對(duì)照組和DMSO組比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

2.4 兔耳瘢痕組織中TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示：E2和G1組的表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；而E2和G1組經(jīng)G15處理后的表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)；DMSO組與空白對(duì)照組比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖6)。

3 討論

圖2 各組兔耳瘢痕形態(tài)對(duì)比 a.對(duì)照組 b.DMSO組 c.E2組 d.G1組 e.E2+G15組 f.G1+G15組 圖3 兔耳瘢痕組織HE染色(×200) a.對(duì)照組 b.DMSO組 c.E2組 d.G1組 e.E2+G15組 f.G1+G15組

Fig 2 Comparison of the morphology of rabbit scar in each group. a.control group. b.DMSO group. c.E2 group. d.G1 group. e.E2+G15 group. f.G1+G15 group. Fig 3 HE staining of rabbit scar tissue (×200). a.control group. b.DMSO group. c.E2 group.d.G1 group. e.E2+G15 group. f.G1+G15 group.

圖4 兔耳瘢痕組織Masson染色(×200) a.對(duì)照組 b.DMSO組 c.E2組 d.G1組 e.E2+G15組 f.G1+G15組 圖5 E2、G1和G15組對(duì)于瘢痕指數(shù)的影響[ns:無(wú)顯著差異,*：P<0.05 (n=18)] 圖6 Real-time PCR檢測(cè)瘢痕組織中TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達(dá)[ns:無(wú)顯著差異,*：P<0.05 (n=6)] a.TGF-β1的mRNA的表達(dá) b.膠原Ⅰ的mRNA的表達(dá) c.膠原Ⅲ的mRNA的表達(dá) d.GPER的mRNA的表達(dá)

Fig 4 Masson staining of rabbit scar tissue (×200). a.control group. b.DMSO group. c.E2 group. d.G1 group. e.E2+G15 group. f.G1+G15 group. Fig 5 The effect of E2、G1 and G15 on SEI [ns: not significant,*:P<0.05 (n=18)]. Fig 6 Expression of TGF-β1, collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and GPER determined by real-time PCR analysis [ns: not significant,*:P<0.05 (n=6)].a. expression of TGF-β1 mRNA. b. expression of collagen Ⅰ. c. expression of collagen Ⅲ. d. expression of GPER.

雌激素通過(guò)與雌激素受體特異性結(jié)合，形成E2-受體復(fù)合物才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，包括E2核受體Erα和Erβ 2個(gè)亞型。隨后研究發(fā)現(xiàn)，E2還存在1個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體。2009年，國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)正式將其命名為GPER。E2通過(guò)GPER快速激活細(xì)胞的第二信使系統(tǒng)，間接調(diào)節(jié)第一系列基因轉(zhuǎn)錄，從而在各種細(xì)胞類(lèi)型中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，GPER在多種癌細(xì)胞中均有表達(dá)并促進(jìn)其增殖和存活[10]。如惡性乳腺癌[11]、套細(xì)胞淋巴瘤[12]、肺癌[13]、平滑肌瘤[14]等。而增生性瘢痕的細(xì)胞病理學(xué)特性與腫瘤極為相似，因此，本實(shí)驗(yàn)探究GPER對(duì)于增生性瘢痕是否有影響。在觀察中發(fā)現(xiàn)，使用E2相比對(duì)照組的兔耳瘢痕增生明顯，并且檢測(cè)瘢痕組織中TGF-β1 、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ[15]和GPER的mRNA表達(dá)量也同比增高。這與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。E2能夠促進(jìn)瘢痕增生，但GPER是否在其中產(chǎn)生影響，尚未確定。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥GPER特異性激動(dòng)劑(G1)和拮抗劑(G15)，并觀察瘢痕增生的情況。我們發(fā)現(xiàn)，使用G1與使用E2的兔耳瘢痕增生情況十分相似，經(jīng)G15處理后的兔耳瘢痕比G1和E2組明顯扁平、變軟，顏色接近周?chē)Ｆつw，而且成纖維細(xì)胞及膠原纖維減少，且排列整齊；觀察檢測(cè)瘢痕組織中，TGF-β1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達(dá)量也明顯下降。這表明：⑴GPER對(duì)于瘢痕有明顯的影響作用，而激活GPER可促進(jìn)瘢痕形成，反之則抑制。⑵GPER拮抗劑(G15)同樣能抑制E2對(duì)瘢痕的促進(jìn)作用，進(jìn)一步說(shuō)明GPER在E2促進(jìn)瘢痕增生中發(fā)揮著重要作用。但是，E2核受體對(duì)瘢痕有無(wú)影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，E2在增生性瘢痕的作用中GPER發(fā)揮著十分重要的作用。GPER不僅是腫瘤治療的新型靶點(diǎn)，而且也是治療增生性瘢痕的潛在靶點(diǎn)。但是，由于GPER是新興的研究熱點(diǎn)，其介導(dǎo)的信號(hào)通路紛繁復(fù)雜，究竟是哪條信號(hào)通路起作用，還有待進(jìn)一步研究。

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Influences of estrogen mediated by GPER on hypertrophic scar in rabbit ears

SHAONing,CHENGDai-wei,ZENGQi,ZHENGQing-gui,QIANNing,WUShu-guang.

(ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

ChengDai-wei,Email:dwcheng0851@163.com

Objective To observe the influences of G protein-coupled estrogen receptor (GPER) on hypertrophic scar of rabbit ears. Methods Thirty-six New Zealand white rabbits were chosen to establish the models of hyperplastic scar in rabbit ears. Rabbit models were randomly assigned to 6 groups, in which E2, G1, E2+G15, G1+G15, DMSO and blank control groups; Specimens were taken at 15 days after receiving subcutaneous injection at the ear roots of the rabbits and observations were made in each group. The scar elevation index (SEI), fibroblasts quantity, orientation of collagen fiber and real-time quantitative PCR detected the expressions of TGF-β1, collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and GPER mRNA. Results Compared with the blank control group, the scar hyperplasia in the E2 and G1 groups was obvious with more fibroblasts and higher collagen density with irregularly arrangement; that in the E2 and G1 groups significantly reduced after G15 treatment by gross observation and microscopic examination. The SEI and the expression of TGF-β1, collagenⅠ, collagen Ⅲ, and GPER mRNA were significantly higher in those in the E2 and G1 groups compared with the blank control group (P<0.05), which were lower in the E2 and G1 groups treated with G15 treatment (P<0.05); the DMSO group. The blank control group had few obvious differences (P>0.05). Conclusion Estrogen mediated by GPER has a promoting effect on hypertrophic scar in rabbit ears.

GPER; Hypertrophic scar; TGF-β1

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2012]2237號(hào))

作者單位：563003 貴州 遵義，遵義醫(yī)學(xué)院(邵 寧,曾 琪)；貴州省人民醫(yī)院 燒傷整形科(程代薇,鄭慶桂);貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(錢(qián) 寧,吳曙光)

邵 寧(1985-)，男，河南人，碩士研究生.

程代薇，550002，貴州省人民醫(yī)院 燒傷整形科，電子信箱：dwcheng0851@163.com【摘要】 目的 觀察G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)對(duì)于兔耳增生性瘢痕的影響。方法 選取36只新西蘭大耳兔建立模型,隨機(jī)分為6個(gè)組，分別為E2組(17-β-雌二醇)、G1組(雌激素受體激動(dòng)劑)、E2+G15組(17-β-雌二醇+雌激素受體拮抗劑)、G1+G15組、DMSO組(溶劑)和空白對(duì)照組。于兔耳根部皮下持續(xù)注射給藥15 d后切取標(biāo)本，觀察各組瘢痕增生情況。瘢痕增生指數(shù)(SEI)、成纖維細(xì)胞數(shù)量、膠原纖維排列以及通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TGF-β1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果 通過(guò)大體觀察及顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)，E2和G1組相比空白對(duì)照組的瘢痕增生明顯，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，膠原排列紊亂；E2和G1組經(jīng)G15處理后，瘢痕明顯縮??；檢測(cè)并分析數(shù)據(jù)SEI以及TGF-β1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達(dá)量，E2和G1組相對(duì)于空白對(duì)照組均明顯升高(P<0.05)，而E2和G1組經(jīng)G15處理后則顯著降低(P<0.05)；DMSO組相對(duì)于空白對(duì)照組，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 GPER介導(dǎo)雌激素對(duì)于兔耳增生性瘢痕具有促進(jìn)作用。

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.09.019

R619.6

A

1673-7040(2016)09-0572-05

2016-06-10)