胡則勒吳定芬

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缺氧誘導(dǎo)因子-1α和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1表達(dá)對鼻咽癌患者預(yù)后的影響

胡則勒1吳定芬1

目的 探討鼻咽癌組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLUT-1）表達(dá)活性與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法 選取寧波市鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院耳鼻喉科收治的鼻咽癌患者63例（鼻咽癌組）和慢性鼻咽炎患者20例（對照組），分別取鼻咽病灶組織，免疫組織化學(xué)法檢測HIF-1ɑ和GLUT-1表達(dá)活性，分析其表達(dá)水平與患者臨床病理特征及生存期的關(guān)系。結(jié)果 鼻咽癌組HIF-1α和GLUT-1陽性表達(dá)率分別為55.56%（35/63）、58.73%（37/63），顯著高于對照組的10.00%（2/ 20）、15.00%（3/20），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HIF-1α、GLUT-1陽性表達(dá)率與鼻咽癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；HIF-1α陽性者3年生存率75.76%，顯著低于陰性患者的85.19%（P＜0.05）；GLUT-1陽性者3年生存率75.00%，顯著低于陰性患者的88.89%（P＜0.05）。結(jié)論 HIF-1α和GLUT-1在鼻咽癌組織中高表達(dá)，且與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。

鼻咽癌；缺氧誘導(dǎo)因子-1ɑ；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1；臨床病理特征；預(yù)后

鼻咽癌是我國南部及香港地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病原因與EB病毒及環(huán)境因素有關(guān)［1］。由于鼻咽癌的位置較深，與顱底緊密相連，且鼻咽癌自身具有較強(qiáng)的侵襲性，極易侵犯顱底、咽旁系及頸動脈鞘等周圍組織結(jié)構(gòu)［2］。早期鼻咽癌的治療效果較為顯著，5年生存率可達(dá)85%以上，然而早期鼻咽癌的臨床癥狀多不典型且較為隱匿，患者就診時往往已經(jīng)達(dá)到中晚期，因此鼻咽癌的早期診斷和治療對改善患者預(yù)后至關(guān)重要［3］。為此，本研究針對鼻咽癌患者癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLUT-1）的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行探討。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)報(bào)道如下：

資料與方法

1一般資料

1浙江省寧波市鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院耳鼻咽喉科（315300）

選取筆者醫(yī)院耳鼻喉科收集的經(jīng)病理檢查確診為鼻咽鱗狀細(xì)胞癌的患者63例（鼻咽癌組）、同期內(nèi)鏡檢查取鼻咽粘膜組織經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為慢性鼻咽炎患者20例（對照組）。所有納入對象均經(jīng)過臨床病理檢查確診。CT檢查判定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。鼻咽癌組63例患者，年齡26～72歲，平均年齡（48.7± 13.4）歲，其中男41例、女22例，臨床分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期25例、Ⅲ期22例、Ⅳ期13例，出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。對照組20例患者，年齡22～66歲，平均年齡（46.1±10.7）歲，其中男14例、女6例。兩組患者的年齡、性別構(gòu)成差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2試劑與儀器

本研究應(yīng)用到的主要儀器：旋轉(zhuǎn)切片機(jī)為德國MICROM公司生產(chǎn)的MICROM；冰箱為長沙伊萊克斯電器有限公司生產(chǎn)的Elextrolux；光學(xué)顯微鏡為日本的Olympus CX21。

本研究所用到的主要試劑：伊紅染液為臺灣BASO貝索企業(yè)生產(chǎn)；HIF-1α（BA0912）購自武漢博士德生物工程公司；GLUT-1（sc7903）購自美國SantaCruz公司；S-P試劑盒購自北京中杉金橋生物工程公司。

3免疫組織化學(xué)法

免疫組化法測定腫瘤組織HIF-1α、GLUT-1：對患者的腫瘤組織進(jìn)行HE染色后免疫組化，組織臘塊以4μm的厚度進(jìn)行連續(xù)切片后，置于60℃的烤箱進(jìn)行干燥40分鐘；常規(guī)脫蠟至水；在3%的過氧化氫溶液室中孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫的活性，滴加一抗，并在4℃的抗?jié)窈杏诒渲羞^夜；滴加聚合物增強(qiáng)劑，并在室溫下孵育20分鐘；滴加酶標(biāo)抗鼠聚合物，室溫下孵育30分鐘；PBS （PH7.4）沖洗3分鐘，沖洗3次；將PBS去除，滴加剛配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。

4免疫組化法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

GLUT-1及HIF-1α免疫組化陽性表達(dá)均為胞漿或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒，HIF-1α以胞核及胞核部分胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色顆粒為陽性，GLUT-1以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。參照陳宇翰等［1］的方法，免疫組織化學(xué)法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，按照著色強(qiáng)度進(jìn)行分級，0分：無色；淡黃色：1分；棕黃色：2分，褐色：3分；顯微鏡下染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：＜10%：0分；10%～25%：1分；26%～50%：2分；＞50%：3分；兩個得分項(xiàng)目相加為最終評分，＞2分為陽性表達(dá)，≤2分為陰性表達(dá)。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)在專業(yè)軟件SAS9.0軟件包中處理，計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，兩組組間HIF-1α及GLUT-1表達(dá)陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank法。P值＜0.05表示兩組指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1兩組患者的HIF-1α、GLUT-1的表達(dá)情況差異

鼻咽癌組的HIF-1ɑ陽性表達(dá)率55.56%（35/ 63）、GLUT-1陽性表達(dá)率58.73%（37/63）均顯著的高于對照組的的10.00%（2/20）、15.00%（3/20）且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1、2，圖1、2。

表1　兩組患者的HIF-1α的表達(dá)情況［n（%）］

表2　兩組患者的GLUT-1的表達(dá)情況［n（%）］

圖1　HIF-1ɑ陽性表達(dá)（SP×400）

圖2　GLUT-1陽性表達(dá)（SP×400）

2鼻咽癌患者的HIF-1α、GLUT-1的表達(dá)與患者的臨床病理特征關(guān)系

鼻咽癌組患者的HIF-1α、GLUT-1陽性表達(dá)率與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），與患者的性別和年齡無顯著的相關(guān)性（P＞0.05），見表3、4。

表3　鼻咽癌患者的HIF-1α的表達(dá)與患者的臨床病理特征的關(guān)系

表3　鼻咽癌患者的GLUT-1的表達(dá)與患者的臨床病理特征的關(guān)系

3鼻咽癌患者的HIF-1α、GLUT-1的表達(dá)陽性與陰性患者的3年隨訪結(jié)局情況

圖3　HIF-1ɑ陽性與陰性患者的生存函數(shù)圖

患者隨訪3年后，使用Kaplan-Meier法分析生存率，從圖3可見HIF-1α陽性患者3年生存率為75.76%顯著低于陰性患者的85.19%（χ2=2.141，P= 0.042＜0.05），從圖4可見GLUT-1陽性患者3年生存率為75.00%顯著低于陰性患者的88.89%（χ2= 2.472，P=0.035＜0.05）。

圖4　GLUT-1陽性與陰性患者的生存函數(shù)圖

討論

鼻咽癌是指鼻咽黏膜被覆上皮發(fā)生的深度惡化的惡性上皮細(xì)胞癌，易發(fā)生于鼻咽頂后壁及咽隱窩等處，少數(shù)發(fā)生于咽鼓管咽口及后鼻孔［4］。由于鼻咽癌自身具有較強(qiáng)的侵襲性，常向口咽、鼻腔、眼眶甚至顱底及顱內(nèi)發(fā)展，并出現(xiàn)相應(yīng)臨床表現(xiàn)，往往在疾病早期就出現(xiàn)頸深上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并逐漸累及頸深下淋巴結(jié)甚至逆行至頜下、頦下淋巴結(jié)［5］。由于鼻咽癌的發(fā)生部位較為隱秘，且早期癥狀輕微難以發(fā)現(xiàn)，因此成為我國最常見的頭頸部惡性腫瘤之一。鼻咽癌的主要治療手段為放射治療，且對以鉑類為基礎(chǔ)的化療較為敏感，但其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)是導(dǎo)致治療失敗的重要因素［6］。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的過度增殖密切相關(guān)，由于細(xì)胞增殖需要消耗大量的氧氣，因此缺氧是實(shí)體腫瘤發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象，也是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的特征之一［7］。由于腫瘤細(xì)胞缺氧導(dǎo)致的一系列生物學(xué)行為改變可以使細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境，進(jìn)而使腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力增加［8］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是缺氧環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性變化調(diào)節(jié)的核心，可作用于腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)，可以調(diào)控細(xì)胞的氧平衡以及缺氧狀態(tài)下的能量代謝。Ren等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α還可是血管內(nèi)皮素生長因子，碳酸酐酶-9及促紅細(xì)胞升成都等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。癌組織內(nèi)目前已發(fā)現(xiàn)的葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有9種，而GLUT1作為介導(dǎo)葡萄糖穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要載體，是調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因子［10］。Yang等［11］研究顯示，正常組織以及良性組織中并不能檢測到GLUT1的表達(dá)的，而在惡性腫瘤組織中則普遍呈高表達(dá)狀態(tài)，其機(jī)制在于GLUT1增加了葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，因此認(rèn)為GLUT1是細(xì)胞惡變的早期標(biāo)志之一。現(xiàn)有的研究證實(shí)，GLUT1在宮頸癌及結(jié)直腸癌中均有過度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組的HIF-1α陽性表達(dá)率、GLUT-1陽性表達(dá)率均顯著的高于對照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示，HIF-1α、GLUT-1在鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用，且本研究還發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組患者的HIF-1α、GLUT-1陽性表達(dá)率與患者的臨床分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性，該結(jié)果提示二者在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，可作為鼻咽癌預(yù)后評價的分子標(biāo)志物之一，并且可能作為鼻咽癌的潛在治療靶點(diǎn)之一。HIF-1α和GLUT-1陽性患者3年生存率低于陰性患者提示，HIF-1α及GLUT-1與鼻咽癌的遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，HIF-1α、GLUT-1在鼻咽癌患者組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，同時與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，可作為鼻咽癌預(yù)后評價的分子標(biāo)志物之一，并且可能作為鼻咽癌的潛在治療靶點(diǎn)之一。HIF-1α、GLUT-1與鼻咽癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)，有可能成為預(yù)后的評估分子。

1陳宇翰，李先明，吳事海，等.HIF-1α和碳酸酐酶Ⅸ在鼻咽癌中表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系［J］.中華放射腫瘤學(xué)雜志，2015，24（01）：46-47.

2景紹武，趙志軍，景尚華，等.低氧誘導(dǎo)因子-1α與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性Meta分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2015，22（07）：548-554

3王秀文，易基群，潘兆軍，等.三氧治療聯(lián)合調(diào)強(qiáng)適形放療治療鼻咽癌及對患者血清乏氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮生長因子的影響［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，（08）：36-38.

4莊建發(fā)，管凱，魏天安，等.64兩種子野分割算法制定鼻咽癌調(diào)強(qiáng)計(jì)劃比較［J］.現(xiàn)代儀器與醫(yī)療，2015，（02）：23-25.

5李彩虹，李濤，張群洲，等.鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞分化過程中促血管生成相關(guān)因子的表達(dá)及其對血管生成細(xì)胞的影響［J］.腫瘤防治研究，2013，40（07）：629-634.

6藍(lán)玉宏，邵汛帆，白力，等.乏氧誘導(dǎo)因子-1α在鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，（04）：501-504.

7楊楚，陳素芝，黃玉淑.HPA、CK2β與HIF-1α在鼻咽癌組織中協(xié)同作用的研究［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，（19）：27-29.

8陳榮梅.鼻咽癌組織中HIF-1α、GLUT-1的表達(dá)與放療敏感性關(guān)系的研究進(jìn)展 ［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2013，27 （05）：452-456.

9Ren Gang，Xu Shou-Ping，Du Lei，et al.Actual Anatomical and Dosimetric Changes of Parotid Glands in Nasopharyngeal Carcinoma Patients during Intensity Modulated Radiation Therapy.［J］.BioMed research international，2015，2015：670327.

10袁太澤，錢朝南，徐理華，等.小分子HIF-1α干擾RNA逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞耐藥的實(shí)驗(yàn) ［J］.腫瘤防治研究，2012，39（08）：927-930.

11Yang Shiping，Lin Shaomin，F(xiàn)u Qiang，et al.The effect of adjuvantchemotherapyonsurvivalinpatientswith residualnasopharyngealcarcinomaafterundergoing concurrent chemoradiotherapy.［J］.PloS one，2015，10（3）：e0120019.

12程惠華，傅志超，王長楠.HIF-1α反義寡核苷酸對鼻咽癌細(xì)胞乏氧條件下放射敏感性的影響 ［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2012，19（05）：547-549.

（收稿:2015-07-26修回：2015-09-07）

Impacts of HIF-1α and GLUT-1 expressive activities in the prognosis of patients with nasopharyngeal carcinoma

HU Zelei，WU Dingfen
Department of Otolaryngology，Zhenghai Longsai Hospital of Ningbo City；Zhejiang，315300，China

Objective To investigate the association of hypoxia inducible factor-1（HIF-1α）and glucose transporter-1（GLUT-1）expressive activities with the features of clinical pathology among the patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）and their impacts in the prognosis of this lesion based on a clinical trial.Methods Included in this study were 63 cases with NPC as observing group（OG）and 20 persons with chronic nasopharyngitis as control group（CG）.Tissue samples were taken from their nasopharyngeal focuses at first，and then，expressive levels of HIF-1α and GLUT-1 were detected by immunohistochemical methods for exploring the association of HIF-1α and GLUT-1 expressive levels with the features of clinical pathology and survival duration of these cases. Results The positive expression rate of HIF-1α was 55.56%（35/63）in OG，significantly higher than that of 10.00%（2/20）in CG（P＜0.01），and this rate of GLUT-1 was 58.73%（37/63）in OG，also obviously higher than that of 15.00%（3/20）in CG（P＜0.01）.The positive expression rates of HIF-1α and GLUT-1 showed significant correlation with clinical staging and lymph node metastasis of NPC patients（P＜0.05）.The 3-year survival rate was 75.76%among these cases with HIF-1α positive expression，significantly lower than that of 85.19%among such cases with negatively expressed HIF-1α（P＜0.05），while it was 75.00%among these cases with a positive GLUT-1 expression，also obviously lower than that of 88.89%among such cases with negatively expressed GLUT-1（P＜0.05）. Conclusion HIF-1α and GLUT-1 are highly expressed in NPC tissues，with a close relationship to clinical staging，lymph node metastasis and prognosis of NPC patients.

Nasopharyngeal carcinoma；Hypoxia inducible factor-1α；Glucose transporter-1；Clinical pathological features；Prognosis

胡則勒，主治醫(yī)師.Email:yangxiaodong1978@163.com

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.01.003