甘霖　滕崢　王嘉瑜　張勇　許文波　鐘照華　張曦　嚴(yán)冬梅

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·論著·

2014年上海市手足口病的病原譜及EV-A71和CV-A16分子流行病學(xué)特征分析

甘霖滕崢王嘉瑜張勇許文波鐘照華張曦嚴(yán)冬梅

150081 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物教研室(甘霖、鐘照華)； 200336 上海市疾病預(yù)防控制中心(滕崢、王嘉瑜、張曦); 102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)病毒與病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，世界衛(wèi)生組織西太平洋區(qū)脊髓灰質(zhì)炎參比實(shí)驗(yàn)室(張勇、許文波、嚴(yán)冬梅)

甘霖、滕崢對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，并列第一作者

【摘要】目的研究2014年上海市手足口病的病原譜，及腸道病毒A組7l型(EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(CV-A16)變異變遷規(guī)律。方法采集上海市2014年手足口病患者的咽拭子標(biāo)本，進(jìn)行核酸檢測(cè)，對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果為EV-A71、CV-A16以及其他EV陽性的臨床標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。對(duì)病毒分離結(jié)果陽性株進(jìn)行全長VP1編碼區(qū)基因的擴(kuò)增以及核苷酸序列的測(cè)定和分析，然后與EV-A71、CV-A16各基因型和基因亞型的代表株構(gòu)建親緣性進(jìn)化樹。結(jié)果2014年上海市轄區(qū)共對(duì)2017例HFMD臨床標(biāo)本進(jìn)行了核酸檢測(cè)，共有1 644例檢測(cè)結(jié)果為陽性。從中隨機(jī)地選擇出75份臨床標(biāo)本接種RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞，共有60份出現(xiàn)EV特征性CPE，病毒分離的陽性率為82.67%,其中23株被鑒定為EV-A71、32株被鑒定為CV-A16、5株被鑒定為其他EV。23株EV-A71全部屬于C4a進(jìn)化分支；32株CV-A16中，有8株屬于B1a進(jìn)化分支，有24株屬于B1b進(jìn)化分支。 結(jié)論2014年上海市轄區(qū)手足口病呈現(xiàn)EV-A71與CV-A16共同流行的模式。C4a進(jìn)化分支的EV-A71在上海市持續(xù)傳播，而B1b進(jìn)化分支成為上海市CV-A16的流行優(yōu)勢(shì)株。研究和掌握EV-A71和CV-A16等腸道病毒流行株的基因特征，發(fā)現(xiàn)其變異位點(diǎn)和變異趨勢(shì)，對(duì)HFMD預(yù)防控制策略措施的制定將有重要的參考意義。

【主題詞】手足口??；分子流行病學(xué)；腸道病毒屬；柯薩奇病毒感染

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81373049)

手足口病(hand, foot, and mouth disease，HFMD)是腸道病毒(Enterovirus，EV)引起的，兒童易感的急性腸道傳染病。HFMD所引起的感染大多數(shù)為良性過程，在多數(shù)情況下是可以自愈的。少數(shù)的重癥病例可發(fā)生腦膜腦炎、肺水腫、心肌炎、無菌性腦膜炎等，甚至引發(fā)重癥腦干腦炎以及神經(jīng)源性肺水腫，導(dǎo)致死亡[1]。該種疾病可由多個(gè)血清型的EV所引起，但主要病原體為柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CV-A16)和腸道病毒A組71型(Enterovirus A71，EV-A71)，其中由EV-A71引起的患兒多數(shù)伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至發(fā)生死亡[2]。在1998年我國臺(tái)灣地區(qū)和2008年安徽省阜陽市的HFMD暴發(fā)中，經(jīng)證實(shí)，EV-A71是導(dǎo)致多名患兒死亡的病原體[3-5]。

HFMD是世界范圍廣泛流行的兒童常見的傳染病，在多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生過暴發(fā)和流行，然而近年來以C4a基因亞型EV-A71在人群中的循環(huán)，在東南亞地區(qū)引起了大規(guī)模的暴發(fā)和流行，并引起了一定數(shù)量的重癥病例和聚集性死亡病例。上海市是我國HFMD病的高發(fā)地區(qū)之一，在1981年上海市報(bào)道了26例臨床診斷為HFMD的病例，在2002年也有HFMD暴發(fā)的報(bào)道[6]。本研究對(duì)2014年上海市HFMD的病原譜進(jìn)行了研究，并對(duì)其中兩種主要病原體(EV-A71和CV-A16)的基因特征及其流行和傳播規(guī)律進(jìn)行了分析，為有效地防治HFMD提供了一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集與對(duì)象標(biāo)本的采集對(duì)象為2014年上海市轄區(qū)內(nèi)被臨床診斷為HFMD的患兒。使用專用的采樣棉簽，采集患者自發(fā)病起3 d之內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，放入裝有3～5 ml標(biāo)本保存液的無菌采樣管中，并且于4 ℃暫時(shí)存放，在12 h之內(nèi)被送達(dá)實(shí)驗(yàn)室等待檢測(cè)。

1.2病毒RNA的提取和血清型別鑒定將咽拭子標(biāo)本在標(biāo)本保存液中充分地?cái)噭?dòng)，在4 ℃條件下，進(jìn)行10000 rpm的離心20 min，吸取上清液。根據(jù)《手足口病防控指南(2012)》的要求，進(jìn)行EV-A71、CV-A16和其他EV的核酸檢測(cè)。用BioFlux Simple P Total RNA Extraction Kit進(jìn)行總RNA提取，具體的操作步驟詳見試劑盒的說明書。然后用實(shí)時(shí)熒光-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, rRT-PCR)的方法對(duì)病毒的核酸進(jìn)行EV-A71、CV-Al6和其他EV的鑒定[7]。

1.3病毒分離將核酸檢測(cè)結(jié)果為EV-A71、CV-A16和其它EV陽性的咽拭子標(biāo)本，接種于人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞和非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞，接種量為200 μl。接種后于溫度為36 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱當(dāng)中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)2代之后，無EV特異的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，判為陰性；如果有CPE，終止培養(yǎng)，于-20 ℃冰箱凍存。

1.4EV-A71和CV-A16全長VP1區(qū)擴(kuò)增應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)對(duì)EV-A71和CV-A16的全長VP1編碼區(qū)的891個(gè)堿基對(duì)(base pair, bp)的片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的引物分別為EV71-VP1-S與EV71-VP1-A[8]、CVA16-VP1-S與CVA16-VP1-A[9]，由國家脊灰實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，使用濃度100 μg/ml。

采用日本TaKaRa One Step RT-PCR Kit Ver2(Cat#RR057A)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)的條件為：50 ℃ 30 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，94 ℃ 2 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；擴(kuò)增的反應(yīng)條件是94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，32個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行72 ℃10 min的延伸后結(jié)束反應(yīng)。用1.7%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5核苷酸序列測(cè)定RT-PCR擴(kuò)增后的陽性產(chǎn)物用QIAquick PCR purification kit(Qiagen，Valencia，美國)進(jìn)行純化。然后分別地使用其RT-PCR的上下游引物和BigDyeTMTerminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction Kit(Applied Biosystems，美國)試劑進(jìn)行雙向標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記的反應(yīng)條件遵照該試劑盒的使用說明書。標(biāo)記后的產(chǎn)物在經(jīng)過葡聚糖凝膠G-50(Pharmacia，瑞典)的純化后，于ABI 3730XL型序列測(cè)定分析儀上(Applied Biosystems，日本)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序和分析。

1.6生物信息學(xué)分析采用軟件Sequencher 5.0(GeneCode, Michigan, USA)進(jìn)行序列的拼接與比對(duì)，拼接后的序列通過與基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)中已發(fā)表的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)確定其血清型[10]。使用軟件MEGA 5.1，并采用鄰接法(neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)生樹的構(gòu)建，采用Kimura 2-parameter model的模型，建樹的可靠性通過1000 bootstrap來進(jìn)行評(píng)估[11]。

2結(jié)果

2.12014年上海市轄區(qū)手足口病病原譜2014年上海市轄區(qū)共報(bào)告64 690例HFMD，其中輕癥為64 486例，重癥為201例，死亡3例。使用rRT-PCR的方法對(duì)全部重癥和死亡病例和部分輕癥病例共3 006例進(jìn)行了核苷酸檢測(cè)，共有2 187例的檢測(cè)結(jié)果為陽性，陽性率為72.8%。對(duì)其中1 746例進(jìn)行EV-A71、CV-A16的雙通道rRT-PCR檢測(cè)，檢出EV-A71陽性病例556例(32.4%)，CV-A16陽性病例737例(42.2%)，其他EV陽性病例443例(25.4%)。在檢測(cè)的1 554例輕癥HFMD病例中，病原譜構(gòu)成為：EV-A71陽性384例(24.7%)，CV-A16陽性732例(47.1%)，其他EV陽性438例(28.2%)；在檢測(cè)的201例重癥HFMD病例中，檢測(cè)陽性的有190例，病原譜構(gòu)成為：EV-A71陽性180例(94.7%)，CV-A16陽性5例(2.6%)，其他EV陽性5例(2.6%)；在檢測(cè)的3例死亡HFMD病例中，有2例檢測(cè)結(jié)果陽性，鑒定為EV-A71。

隨機(jī)選擇EV-A71、CV-A16和其他EV核酸檢測(cè)陽性的HFMD標(biāo)本75份(包括HFMD輕癥病例標(biāo)本65份，HFMD重癥病例標(biāo)本10例)，接種RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞，有60份(全部都是輕型病例標(biāo)本)在兩種細(xì)胞上出現(xiàn)EV特征性CPE，病毒分離陽性率為82.67%。其中23株鑒定為EV-A71，32株鑒定為CV-A16，5株鑒定為其他EV。核酸檢測(cè)和病毒分離的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果都表明，2014年上海地區(qū)HFMD的病原譜呈現(xiàn)EV-A71與CV-A16共同流行的模式。

2.2C4a進(jìn)化分支的EV-A71在上海市持續(xù)傳播對(duì)23株EV-A71進(jìn)行全長VP1區(qū)擴(kuò)增，并進(jìn)行了核苷酸序列分析，結(jié)果顯示23株EV-A71的VP1區(qū)核苷酸序列的長度為891個(gè)核苷酸，編碼297個(gè)氨基酸。采用MEGA5.1軟件的Neighbor-Joining法，構(gòu)建23株上海市EV-A71分離株與全球EV-A71各基因型和基因亞型代表株的親緣關(guān)系樹，以CV-A16原型株(G-10株)作組外對(duì)照株(圖1)。

“●”表示2014年上海市EV-A71株圖1　基于各個(gè)基因型EV-A71的全長VP1區(qū)的進(jìn)化樹“●”indicates the EV-A71 strains in Shanghai, 2014Fig.1　Phylogenetic tree based on the entire VP1 coding region of each genotype of EV-A71

“●”表示2014年上海市EV-A71株;“▲”表示2008年上海市EV-A71株;“△”表示2009年上海市EV-A71株;表示2010年上海市EV-A71株;表示2011年上海市EV-A71株;“◆”表示2012年上海市EV-A71株圖2　上海市2008-2014年EV-A71分離株與我國其他省份的EV-A71代表株的VP1區(qū)核苷酸序列的進(jìn)化樹 “●”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2014; “▲”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2008;“△”indicates the EV-A71 strains in Shanghai in 2009; “■”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2010; “□”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2011; “◆”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2012Fig.2　Phylogenetic tree based on the entire VP1 coding region of EV-A71 from Shanghai Municipal in 2008-2014 and other provinces in China

從進(jìn)化樹圖中可以看出，根據(jù)EV-A71的VP1區(qū)的核苷酸序列差異，EV-A71被劃分為七個(gè)基因型，即A、B、C、D、E、F和G基因型，各型間差異在16.5%～19.7%之間，各個(gè)基因型內(nèi)部之間的核苷酸序列差異小于12%。根據(jù)親緣關(guān)系，將各基因型進(jìn)一步劃分為不同亞型，其中A基因型中只有EV-A71的原型株——BrCr株，其B基因型又進(jìn)一步地被分為從B0-B7的7個(gè)基因亞型，其C基因型又進(jìn)一步地被分為從C1-C6的6個(gè)亞型。從圖1可見，23株EV-A71與C4a基因亞型代表株在同一分支內(nèi)，bootstrap值高達(dá)100，說明上海流行的EV-A71屬C4a基因亞型。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，C4a進(jìn)化分支中，23株EV-A71處于不同簇，揭示上海市EV-A71流行有多個(gè)傳播鏈。

對(duì)2008～2014年從上海市分離到的EV-A71的VP1編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，不同年份間的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為95.9%～97.5%、99.34%～99.41%。進(jìn)化樹的分析結(jié)果表明：上海市2008～2014年的EV-A71分離株在進(jìn)化上均屬于C4a進(jìn)化分支，EV-A71-C4a在上海市持續(xù)傳播(圖2)。EV-A71在傳播過程中不斷進(jìn)化，各年代毒株間遺傳距離逐漸增大。

2.3B1b進(jìn)化分支成為上海市CV-A16流行優(yōu)勢(shì)株對(duì)32株CV-A16進(jìn)行全長VP1區(qū)擴(kuò)增，并進(jìn)行核苷酸序列分析，結(jié)果顯示32株CV-A16的VP1區(qū)核苷酸序列的長度為891個(gè)核苷酸，編碼297個(gè)氨基酸。采用MEGA5.1軟件的Neighbor-Joining法，將32株上海CV-A16分離株與世界CV-A16各基因型和基因亞型代表株構(gòu)建親緣關(guān)系樹，以EV-A71的原型株(BrCr株)作為組外對(duì)照(圖3)。

從進(jìn)化樹圖中可以看出，根據(jù)CV-A16的VP1區(qū)的核苷酸序列差異，CV-A16劃分為兩個(gè)基因型，即A和B基因型，兩型間差異在16.5%～19.7%之間，各個(gè)基因型內(nèi)部之間的核苷酸序列差異小于12%。根據(jù)親緣關(guān)系，將各基因型進(jìn)一步劃分為不同亞型，其中A基因型只有CV-A16的原型株——G-10株，B基因型又進(jìn)一步分為B1-B2基因亞型。8株CV-A16與B1a進(jìn)化分支的代表株處于同一分支，且bootstrap值為100，并處在不同簇(Lineage 1和Lineage 2)中，說明上海市B1a進(jìn)化分支CV-A16至少存在兩個(gè)傳播鏈，Lineage 1和Lineage 2之間的核苷酸序列平均同源性為92.4%。24株CV-A16與B1b進(jìn)化分支的代表株處于同一分支，且bootstrap值均>85，并且也可以進(jìn)一步地分為兩個(gè)不同的小簇(Lineage 3和Lineage 4)，Lineage 3為上海市2014年CV-A16流行的優(yōu)勢(shì)分支，共計(jì)28株，核苷酸的同源性、氨基酸的同源性分別為93.83%～100%和98.64%～100%；Lineage 4，共3株，核苷酸的同源性、氨基酸的同源性分別為98.32%～98.88%和100%。Lineage 3和Lineage 4之間的核苷酸序列平均同源性為92.2%。以上結(jié)果說明上海CV-A16的流行存在多個(gè)傳播鏈。

3討論

HFMD是由多種EV引起的常見兒童傳染病，并且是主要以EV-A71和CV-A16做為該病的病原體。人們最早發(fā)現(xiàn)手足口病的病原體是CV-A16，后來被發(fā)現(xiàn)的柯薩奇病毒A組的4型、6型、10型以及B組的4型和5型等EV也可引起HFMD[12,13]。自從EV-A71于1969年首次被分離到以來，人們逐漸地認(rèn)識(shí)到EV-A71也可以成為HFMD的主要病原體。因此，在目前缺乏廣泛有效的疫苗和特異性的治療藥物的情況下，對(duì)導(dǎo)致手足口病的兩種主要病原體CV-A16和EV-A71進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及病原學(xué)監(jiān)測(cè)具有重大意義[14]。

分子流行病學(xué)的研究結(jié)果已經(jīng)對(duì)我國流行的EV-A71的基因特點(diǎn)、流行和傳播規(guī)律進(jìn)行了初步的闡明，中國大陸的EV71的分子流行病學(xué)，實(shí)際上就是一部C4基因亞型EV-A71的進(jìn)化史。自1998年以來，中國大陸流行的EV-A71全部屬于C4基因亞型，并且出現(xiàn)了不同的進(jìn)化分支更替，由很少引起HFMD重癥和死亡病例的C4b進(jìn)化分支(流行于1998-2004年間，目前在我國已經(jīng)消失)，演變?yōu)橐疠^多重癥和死亡病例的C4a進(jìn)化分支(自2004年出現(xiàn)流行至今，推測(cè)其神經(jīng)毒力由于持續(xù)進(jìn)化而升高)[8,15]。

自1998年以來，C4亞型為上海市的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)型別；隨著EV-A71在我國的持續(xù)流行和傳播，C4亞型已進(jìn)化為C4a和C4b，上海2000年首次檢出C4b進(jìn)化分支EV-A71，自2004年C4a進(jìn)化分支EV-A71取代C4b進(jìn)化分支，成為上海市流行的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)基因亞型?；趯?duì)上海市EV-A71 VP1編碼區(qū)分子流行病學(xué)的分析，得出上海市2014年流行的EV-A71與我國其他地區(qū)EV-A71同屬于大陸2004年以來流行的優(yōu)勢(shì)基因亞型C4a。2008年以來HFMD突發(fā)大流行并非因新病毒或新亞型病毒輸入造成，推測(cè)C4亞型病毒的進(jìn)化為可能原因之一，但是仍需進(jìn)一步的證實(shí)。EV-A71在傳播過程中不斷進(jìn)化，各年代毒株間遺傳距離逐漸增大。而EV-A71流行株基因特征、核苷酸變異、氨基酸變異及趨勢(shì)，對(duì)EV-A71疫苗免疫效果后期評(píng)價(jià)有重要參考意義。

“●”表示2014年上海市CV-A16株圖3　基于各個(gè)基因型CV-A16的全長VP1區(qū)的進(jìn)化樹“●”indicating the CV-A16 strains in Shanghai, 2014 Fig.3　Phylogenetic tree based on the entire VP1 coding region of each genotype of CV-A16

Perera等根據(jù)CV-A16的VP1編碼區(qū)815nt核苷酸序列資料，將CV-A16劃分為A、B兩個(gè)基因型，其中B基因型又可以被劃分為B1、B2兩個(gè)基因亞型[16]。在之后張勇等人的研究中，將CV-A16的B1基因亞型進(jìn)一步地劃分為B1a、B1b、B1c三個(gè)進(jìn)化分支[9]。本研究中，2014年在上海市分離到的32株CV-A16毒株全部屬于B1基因亞型中的B1a和B1b進(jìn)化分支，其中B1b進(jìn)化分支為優(yōu)勢(shì)流行基因亞型。

近年來，由多個(gè)血清型EV導(dǎo)致的手足口病在我國兒童中廣泛傳播并有較大的暴發(fā)流行，本研究對(duì)上海市2014年HFMD的流行病學(xué)與病原學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)EV-A71的C4a亞型和CV-A16的B1b亞型的流行對(duì)2014年上海市HFMD的疫情影響較大，但是EV-A71是導(dǎo)致手足口病重癥和死亡的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)病原。因此我國強(qiáng)化手足口病的監(jiān)測(cè)，對(duì)EV-A71疫苗上市后的使用具有很重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。研究和掌握EV-A71和CV-A16等腸道病毒流行株的基因特征，發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)和變異趨勢(shì)，對(duì)HFMD預(yù)防控制策略措施制定將有重要的參考意義。

4參考文獻(xiàn)

[1]Huang CC, Liu CC, Chang YC, et al. Neurologic complications in children with enterovirus 71 infection [J]. N Engl J Med, 1999, 341(13): 936-942. doi: 10.1056/NEJM199909233411302.

[2]Wong KT, Lum LC, Lam SK. Enterovirus 71 infection and neurologic complications [J]. N Engl J Med, 2000, 342(5): 356-358. doi: 10.1056/NEJM200002033420514.

[3]Ho M, Chen ER, Hsu KH, et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan [J]. Taiwan Enterovirus Epidemic Working Group. N Engl J Med,1999, 341(13): 929-935. doi: 10.1056/NEJM199909233411301.

[4]Zhang Y, Zhu Z, Yang W, et al. An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of hand foot and mouth disease in Fuyang city of China [J]. Virol J, 2010, 7: 94. doi: 10.1186/1743-422X-7-94.

[5]朱理業(yè), 丁振濤, 萬俊峰, 等.阜陽市手足口病(EV71感染)重癥病例流行病學(xué)調(diào)查分析 [J]. 安徽醫(yī)學(xué),2008,29(5): 594-596. doi: 10.3969/j.issn.1000-0399.2008.05.048.

[6]楊智宏, 朱啟镕, 李秀珠, 等.2002年上海兒童手足口病病例中腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型的調(diào)查 [J].中華兒科雜志,2005,43(9): 648-652. doi: 10.3760/j.issn:0578-1310.2005.09.003.

[7]Cui A, Xu C, Tan X, et al. The development and application of the two real-time RT-PCR assays to detect the pathogen of HFMD [J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61451. doi: 10.1371/journal.pone.0061451.

[8]Zhang Y, Tan XJ, Wang HY, et al. An outbreak of hand, foot, and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China [J]. J Clin Virol, 2009, 44(4): 262-267. doi: 10.1016/j.jcv.2009.02.002.

[9]Zhang Y, Wang D, Yan D, et al. Molecular evidence of persistent epidemic and evolution of subgenotype B1 coxsackievirus A16-associated hand, foot, and mouth disease in China [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(2): 619-622. doi: 10.1128/JCM.02338-09.

[10]Kroneman A, Vennema H, Deforche K, et al. An automated genotyping tool for enteroviruses and noroviruses [J]. J Clin Virol, 2011, 51(2): 121-125. doi: 10.1016/j.jcv.2011.03.006.

[11]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J]. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739. doi: 10.1093/molbev/msr121.

[12]Tian H, Zhang Y, Sun Q, et al. Prevalence of multiple enteroviruses associated with hand, foot, and mouth disease in shijiazhuang city, Hebei province, China: outbreaks of coxsackieviruses A10 and B3 [J]. PLoS One, 2014, 9(1): e84233. doi: 10.1371/journal.pone.0084233.

[13]Feder HM Jr, Bennett N, Modlin JF. Atypical hand, foot, and mouth disease: a vesiculobullous eruption caused by Coxsackie virus A6 [J]. Lancet Infect Dis, 2014, 14(1): 83-86. doi: 10.1016/S1473-3099(13)70264-0..

[14]周劍惠, 王爽, 魏雷雷, 等.吉林省2009-2010年引起手足口病流行的腸道病毒71型基因特性的研究 [J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2012,26(4): 273-275. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2012.04.010.

[15]Zhang Y, Wang J, Guo W, et al. Emergence and transmission pathways of rapidly evolving evolutionary branch C4a strains of human enterovirus 71 in the central plain of China [J]. PLoS One, 2011, 6(11): e27895. doi: 10.1371/journal.pone.0027895.

[16]Perera D, Yusof MA, Podin Y, et al. Molecular phylogeny of modern coxsackievirus A16 [J]. Arch Virol, 2007, 152(6): 1201-1208. doi: 10.1007/s00705-006-0934-5.

通信作者：鐘照華，Email:zhonghmu@gmail.com；張曦， Email:.zhangxi@scdc.sh.cn；嚴(yán)冬梅，Email:dongmeiyan1976@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.008

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81373049)

(收稿日期：2016-01-23)

Pathogen spectrum of HFMD and molecular epidemiology of EV-A71 and CV-A16 in Shanghai, 2014

GanLin,TengZheng,WangJiayu,ZhangYong,XuWenbo,ZhongZhaohua,ZhangXi，YanDongmei

DepartmentofMicrobiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China(GanL,ZhongZH);ShanghaiCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai200336,China(TengZ，WangJY，ZhangX);WorldHealthOrganizationRegionalOfficefortheWesternPacificRegionalReferencePolioLaboratoryandKeyLaboratoryofMedicalVirology，NationalHealthandFamilyPlanningCommissionofthePeople’sRepublicofChina,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(ZhangY,XuWB,YanDM)GanLinandTengZhengarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticleCorrespondingauthors：ZhongZhaohua，Email:zhonghmu@h126.com；ZhangXi，Email:zhangxi@scdc.sh.cn；YanDongmei，Email:dongmeiyan1976@163.com

【Abstract】ObjectiveTo study the pathogen spectrum of HFMD and the rules of variable of EV-A71 and CV-A16 in Shanghai Municipality in 2014. MethodsNasopharyngeal swabs were collected from HFMD patients in Shanghai Municipality in 2014, and viral RNA detection was performed. Viral isolation was performed on the specimens with the positive RNA detection for EV-A71, CV-A16 and other EVs. Entire VP1 coding region amplification was performed and sequencing analysis was determined. Phylogenetic trees were constructed based on the entire VP1 sequences of all known genotypes and sub-genotypes of EV-A71 and CV-A16. ResultsIn 2014 in Shanghai Municipality, a total of 2017 clinical specimens collected from HFMD patients were tested, and 1644 were positive for EV-A71, CV-A16 and other EVs. 75 specimens were randomly selected to inoculate onto RD cell and Vero cell, and there were 60 specimens appeared special EV CPE with the positive rate of 82.67%. Among them, 23 strains were identified as EV-A71, 32 strains were identified as CV-A16, and 5 strains were identified as other EVs. 23 EV-A71 strains all belonged to C4a sub-genotype; and among 32 CV-A16 strains, 8 strains belonged to B1a sub-genotype, and other 24 strains belonged to B1b sub-genotype. ConclusionsEV-A71 and CV-A16 co-circulated in Shanghai Municipality in 2014. C4a sub-genotype of EV-A71 continued to spread in Shanghai, and B1b sub-genotype of CV -A16 became predominant CV-A16 strains in Shanghai. For the HFMD prevention and control strategy, it is important to investigate the genetic characteristics of the epidemic, such as EV-A71, CV-A16 and other EVs.

【Key words】Hand, foot and mouth disease; Molecular epidemiology; Enterovirus; Coxsackie virus infections