金聰　涂婷　牟丹蕾　李群輝　李濤　吳昊　陳華標(biāo)

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·論著·

不同抗原肽刺激方式對(duì)HIV特異性CD8 T細(xì)胞體外增殖的影響

金聰涂婷牟丹蕾李群輝李濤吳昊陳華標(biāo)

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心(金聰)；212013 鎮(zhèn)江，江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院(涂婷、李濤、陳華標(biāo))；100069 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染中心(牟丹蕾、李群輝、吳昊)；美國(guó)麻省總醫(yī)院(陳華標(biāo))

金聰和涂婷為共同第一作者

【摘要】目的研究人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)特異性CD8T細(xì)胞在體外增殖反應(yīng)的影響因素。方法應(yīng)用3種不同的抗原刺激方式在體外刺激HIV感染者病毒特異性CD8 T細(xì)胞增殖，并比較在培養(yǎng)體系中添加外源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-2對(duì)HIV特異性CD8 T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果與將MHC I匹配HIV抗原肽直接加入外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)持續(xù)刺激CD8 T 細(xì)胞和僅刺激CD8 T 細(xì)胞2 h這兩種方法相比，從PBMCs中去除CD8 T細(xì)胞獲得混合抗原遞呈細(xì)胞APCs，并用混合APCs結(jié)合承載抗原肽呈遞給CD8 T細(xì)胞可以更有效地刺激HIV特異性CD8 T細(xì)胞的增殖。培養(yǎng)體系中添加細(xì)胞因子IL-2與不添加IL-2相比雖然明顯提高CD8T細(xì)胞增殖數(shù)目，但引起非特異性增殖。結(jié)論在不添加外源性IL-2培養(yǎng)條件下應(yīng)用混合APCs呈遞抗原肽的刺激方法可通過(guò)同時(shí)遞呈抗原信號(hào)和細(xì)胞共刺激信號(hào)更特異地刺激了HIV特異性CD8 T細(xì)胞的有效增殖。

【主題詞】獲得性免疫缺陷綜合征； T細(xì)胞，CD8；增殖，體外

人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)特異性CD8 T細(xì)胞是HIV感染中重要的一群自身保護(hù)性免疫細(xì)胞,可有效產(chǎn)生殺傷HIV感染細(xì)胞的保護(hù)性宿主免疫應(yīng)答[1]。研究顯示缺乏CD8 T細(xì)胞免疫應(yīng)答與外周血中增加的HIV病毒載量相關(guān)并加速進(jìn)展為艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)[2]。在HIV急性感染靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中去除CD8 T細(xì)胞導(dǎo)致持續(xù)高水平病毒血癥，重新輸入CD8 T細(xì)胞可有效降低病毒血癥[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)超急性期HIV感染者體內(nèi)，HIV特異性CD8 T細(xì)胞的活化程度可影響病毒調(diào)定點(diǎn)水平[4]。

通過(guò)體外培養(yǎng)增殖HIV感染者的病毒特異性CD8 T細(xì)胞，能夠?qū)@一群細(xì)胞的增殖能力以及影響抗原活化增殖反應(yīng)的影響因素進(jìn)行更加細(xì)致深入的研究[5,6]。對(duì)HIV感染者的病毒特異性CD8 T細(xì)胞進(jìn)行體外增殖主要通過(guò)應(yīng)用MHC-I分子限制的HIV特異性抗原肽刺激外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocytes， PBMCs)，并應(yīng)用CFSE熒光染料在子代細(xì)胞中熒光減半的特性對(duì)體外增殖的CD8 T細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[7]。目前的研究使用多種不同的CD8 T細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)，但至今沒(méi)有研究比較不同體外增殖模型對(duì)CD8 T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。本研究比較了不同抗原肽刺激方式以及是否添加外源性細(xì)胞因子IL-2對(duì)病毒特異性CD8 T細(xì)胞體外增殖特性的影響。

1材料與方法

1.1HIV感染者PBMCs的處理HIV感染病例標(biāo)本來(lái)自美國(guó)麻省總醫(yī)院的凍存PBMCs。感染病例檢測(cè)病毒載量HIV RNA低于50拷貝/ml，未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。凍存PBMCs在實(shí)驗(yàn)前置于56 ℃水浴快速融化，以RPMI1640培養(yǎng)基洗3遍之后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液待用。細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10%熱滅活人血清(Human serum，Sigma公司)的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加有50 U/ml青霉素/鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 mmol/L HEPES。標(biāo)本使用經(jīng)患者知情同意，并通過(guò)麻省總醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審查。

1.2HIV特異性抗原肽刺激CD8T細(xì)胞體外增殖采用3種不同的抗原肽刺激方式誘導(dǎo)CD8 T細(xì)胞增殖，所用抗原肽均為HLA匹配的HIV特異性?xún)?yōu)勢(shì)短肽段(HLA-matched optimal HIV peptides)。①抗原肽直接刺激PBMCs組：將抗原肽直接加入5×106已經(jīng)用0.25 μmol/LCFSE熒光標(biāo)記的PBMCs中共培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)濃度為2×106細(xì)胞/ml，抗原肽終濃度為2 μg/ml。②抗原肽刺激PBMCs 2 h組：終濃度為2 μg/ml的抗原肽加入5×106已經(jīng)用0.25 μmol/L CFSE熒光標(biāo)記的PBMCs中，在37 ℃培養(yǎng)2 h后，以不含抗原肽的培養(yǎng)基洗2遍，之后將抗原肽刺激過(guò)的細(xì)胞重懸在新鮮培養(yǎng)基中以2×106細(xì)胞/ml濃度培養(yǎng)。③抗原肽通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells,APCs)呈遞組：應(yīng)用CD8 T細(xì)胞陰性磁珠分離試劑盒(Life tech公司)從5×106PBMCs中純化獲得CD8 T細(xì)胞并用0.25 μmol/L CFSE熒光標(biāo)記，然后再取5×106PBMCs使用去除CD8 T細(xì)胞的磁珠試劑盒(Life tech公司)特異性去除CD8 T細(xì)胞后留下含有多種APCs的非CD8 T細(xì)胞。所有非CD8 T細(xì)胞與抗原肽在37 ℃培養(yǎng)2 h后洗脫未結(jié)合的抗原肽，加載有抗原肽的混合APCs與CFSE熒光標(biāo)記的CD8 T細(xì)胞以5×106起始細(xì)胞數(shù)在2×106細(xì)胞/ml濃度共培養(yǎng)。④無(wú)抗原肽刺激對(duì)照組：5×106用0.25 μmol/L CFSE熒光標(biāo)記的PBMCs不加抗原肽以2×106細(xì)胞/ml培養(yǎng)濃度與其他各培養(yǎng)組平行培養(yǎng)。在添加有外源細(xì)胞因子IL-2的培養(yǎng)組中，IL-2濃度為50 U/ml。每3 d吸去一半細(xì)胞培養(yǎng)液再加入同等體積新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)體系中的細(xì)胞數(shù)目和活細(xì)胞比例用Nuclear Counter(Chemometec)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定。

1.3流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞。應(yīng)用熒光抗體抗CD8 Alexa Fluor 700A和抗CD3 Qdot655(Life tech公司)標(biāo)記CD 8 T細(xì)胞亞群。減弱的CFSE熒光所標(biāo)記的CT8T細(xì)胞指示增殖的CD8T細(xì)胞。死細(xì)胞通過(guò)Live/Dead Blue (Life tech公司)染色進(jìn)行排除。熒光抗體染色后的細(xì)胞即刻在 LSRII流式細(xì)胞儀 (BD Biosciences公司)上獲取數(shù)據(jù)。用FlowJo 軟件(Tree star)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用GraphPad Prism 5.0軟件(GraphPadSoftware,Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖和分析。

2結(jié)果

圖1　無(wú)IL-2培養(yǎng)體系中的總細(xì)胞數(shù)目和活細(xì)胞比例Fig.1　Total cell numbers and live cell percentages in absence of IL-2

圖2　無(wú)IL-2添加時(shí)增殖CD8 T細(xì)胞和未增殖CD8 T細(xì)胞的數(shù)目Fig.2　Dynamic analysis on proliferating and non-proliferating CD8 T cells in absence ofIL-2

2.1不同抗原肽刺激方式在無(wú)IL-2培養(yǎng)條件下對(duì)CD8T細(xì)胞體外增殖的影響在未加入外源性細(xì)胞因子IL-2培養(yǎng)條件下應(yīng)用3種不同的抗原肽刺激方式對(duì)5×106PBMCs進(jìn)行刺激，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組培養(yǎng)體系中的總細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖1A)。第1天到第7天，各組細(xì)胞數(shù)目維持在平臺(tái)期，抗原肽直接加入PBMCs組和抗原肽與PBMCs作用2 h組的細(xì)胞數(shù)目與未加入抗原肽培養(yǎng)組相近，APCs呈遞抗原組的細(xì)胞數(shù)目顯著高于其他組。第7天后，各組細(xì)胞數(shù)目均開(kāi)始下降。在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組培養(yǎng)體系中活細(xì)胞比例進(jìn)行測(cè)定(圖1B)，活細(xì)胞比例在第1天到第7天均維持在85%以上，在第12天到第16天活細(xì)胞比例略降低但仍在80%以上，在第21天各組仍然保持較高活細(xì)胞比例在75%以上。各組活細(xì)胞比例之間無(wú)顯著差異。

圖3　IL-2添加時(shí)CD8 T細(xì)胞增殖第7天細(xì)胞數(shù)目Fig.3　Cell number on day 7 of proliferation in absence ofIL-2

進(jìn)一步通過(guò)減弱的CFSE熒光對(duì)增殖CD8 T細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)增殖進(jìn)行定量分析(圖2)，顯示在培養(yǎng)第4天，APCs呈遞抗原肽組就開(kāi)始出現(xiàn)增殖，而其他各組此時(shí)還未出現(xiàn)明顯增殖。在培養(yǎng)后第7天，3個(gè)抗原肽刺激組均出現(xiàn)增殖峰值，APCs呈遞抗原肽組刺激增殖的CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目最高達(dá)到1.5～2×106細(xì)胞，抗原肽直接刺激PBMCs組和抗原肽刺激PBMCs 2 h組的增殖CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目均約為2.5×105細(xì)胞。APCs呈遞抗原肽組刺激增殖的CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目顯著高于其他抗原刺激組(P<0.05，圖3)。無(wú)抗原肽刺激組未出現(xiàn)顯著增殖的CD8 T細(xì)胞。各抗原肽刺激組中CFSE強(qiáng)熒光標(biāo)記的未增殖CD8 T細(xì)胞從第4天開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降。因此，在未添加IL-2共培養(yǎng)條件下，與其他抗原肽刺激組相比，APCs呈遞抗原肽組刺激增殖CD8 T細(xì)胞較早出現(xiàn)并具有較高增殖峰值數(shù)目。

圖4　無(wú)IL-2添加培養(yǎng)體系中的總細(xì)胞數(shù)目和活細(xì)胞比例Fig.4　Total cell numbers and live cell percentages in presence of IL-2

圖5　IL-2添加培養(yǎng)時(shí)增殖CD8 T細(xì)胞和未增殖CD8 T細(xì)胞的數(shù)目Fig.5　Dynamic analysis on proliferating and non-proliferating CD8 T cells in presence ofIL-2

2.2不同抗原肽刺激方式在IL-2培養(yǎng)條件下對(duì)CD8 T細(xì)胞體外增殖的影響在共培養(yǎng)體系中加入外源性細(xì)胞因子IL-2的條件下，以3種不同的抗原肽刺激方式對(duì)5×106PBMCs進(jìn)行刺激。對(duì)培養(yǎng)體系中的總細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖4A)，從第7天起，各組細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)明顯增殖，抗原肽直接加入PBMCs組和抗原肽與PBMCs作用2 h組的細(xì)胞數(shù)目與未加入抗原肽培養(yǎng)組相近，APCs呈遞抗原組的細(xì)胞數(shù)目顯著高于其他組?？乖闹苯蛹尤隤BMCs組和抗原肽與PBMCs作用2 h組的細(xì)胞數(shù)目在第16天達(dá)到峰值，在第21天出現(xiàn)下降。APCs呈遞抗原組的細(xì)胞數(shù)目在第16天達(dá)到峰值，在第21天仍保持較高數(shù)目。對(duì)各組培養(yǎng)體系中活細(xì)胞比例進(jìn)行測(cè)定(圖4B)，活細(xì)胞比例在第1天到第21天均維持在85%以上，各組活細(xì)胞比例之間無(wú)顯著差異。

在共培養(yǎng)體系中添加外源性細(xì)胞因子IL-2的條件下，通過(guò)減弱的CFSE熒光對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的增殖CD8 T細(xì)胞進(jìn)行定量分析(圖5)，顯示在培養(yǎng)第4天，APCs呈遞抗原肽組就開(kāi)始出現(xiàn)增殖，而其他各組此時(shí)還未出現(xiàn)明顯增殖。在培養(yǎng)后第7天，3個(gè)抗原肽刺激組均出現(xiàn)增殖，但無(wú)抗原肽刺激組也出現(xiàn)明顯的非特異性增殖。在第16天，各培養(yǎng)組中增殖的CD8 T細(xì)胞達(dá)到峰值，APCs呈遞抗原肽組刺激增殖的CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目最高達(dá)到約4.5×107細(xì)胞，抗原肽直接刺激PBMCs組和抗原肽刺激PBMCs 2 h組的增殖CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目均約為2.5×107細(xì)胞，無(wú)抗原肽刺激組的增殖CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目約在2.5×106細(xì)胞，APCs呈遞抗原肽組刺激增殖的CD8 T細(xì)胞峰值數(shù)目顯著高于其他抗原刺激組(P<0.05)，圖6。與未添加IL-2培養(yǎng)條件相似，各抗原肽刺激組中CFSE強(qiáng)熒光標(biāo)記的未增殖CD8 T細(xì)胞也從第4天開(kāi)始出現(xiàn)明顯細(xì)胞數(shù)目下降，無(wú)抗原肽刺激組中未增殖CD8 T細(xì)胞從第12天開(kāi)始出現(xiàn)明顯細(xì)胞數(shù)目下降。因此，在添加IL-2共培養(yǎng)條件下，與其他抗原肽刺激組相比，APCs呈遞抗原肽組刺激增殖的CD8 T細(xì)胞出現(xiàn)較快速并達(dá)到較高增殖峰值數(shù)目。但在共培養(yǎng)體系中添加IL-2條件下，存在有非特異性的CD8 T細(xì)胞增殖。

圖6　IL-2添加培養(yǎng)時(shí)CD8 T細(xì)胞增殖第16天細(xì)胞數(shù)目Fig.6　Cell number on day 16 of proliferation in presence of IL-2

3討論

HIV感染者的病毒特異性CD8 T細(xì)胞能夠產(chǎn)生有效增殖反應(yīng)對(duì)控制病毒感染非常重要[8]。體外增殖模型為研究HIV特異性CD8 T細(xì)胞增殖反應(yīng)的特性和調(diào)控因素，以及增殖子代細(xì)胞的表型和功能提供了重要的研究手段[7]。目前的研究應(yīng)用多種體外CD8 T細(xì)胞增殖模型，所用模型之間的區(qū)別在于不同的培養(yǎng)條件、抗原刺激方式、培養(yǎng)體系中的細(xì)胞組分、培養(yǎng)體系中添加的外源性細(xì)胞因子、以及對(duì)增殖細(xì)胞的分析方法。本研究比較分析了不同的抗原刺激方式對(duì)HIV特異性CD8 T細(xì)胞體外增殖的影響，發(fā)現(xiàn)與大部分研究直接將MHC I匹配的HIV抗原肽加入PBMCs刺激CD8 T細(xì)胞增殖的方法相比，在PBMCs中去除CD8 T細(xì)胞獲得包括CD4 T輔助細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞在內(nèi)的混合APCs，并用混合APCs結(jié)合承載抗原肽呈遞給CD8 T細(xì)胞可以更加有效地刺激CD8 T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。這種通過(guò)混合APCs呈遞抗原肽的刺激方法通過(guò)同時(shí)遞呈抗原信號(hào)和細(xì)胞共刺激信號(hào)更好地刺激了HIV抗原特異性CD8 T細(xì)胞的有效增殖。另外，與用單一抗原呈遞細(xì)胞承載抗原肽刺激CD8 T細(xì)胞相比，多種混合APCs之間的相互作用也可有效地刺激CD8 T細(xì)胞的增殖，例如CD4 T細(xì)胞可通過(guò)CD40L-CD40相互作用活化樹(shù)突狀細(xì)胞從而使CD8 T細(xì)胞獲得自分泌IL-2的能力而促進(jìn)CD8 T細(xì)胞的增殖[9]。盡管已知APCs通過(guò)細(xì)胞表面的MHC I和抗原表位復(fù)合物被T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)識(shí)別并通過(guò)表面的共刺激分子有效刺激曾經(jīng)被抗原活化過(guò)的記憶性T細(xì)胞擴(kuò)增，本研究第一次通過(guò)對(duì)不同體外增殖方法進(jìn)行比較，證明了自體混合APCs呈遞抗原肽刺激HIV特異性CD 8 T細(xì)胞增殖與常用的將抗原肽直接加入PBMCs刺激增殖的方法相比更加有效。

研究還發(fā)現(xiàn)，HIV抗原肽直接加入PBMCs并持續(xù)存在培養(yǎng)體系中的刺激方法和HIV抗原肽與PBMCs僅作用2 h之后不存在于培養(yǎng)體系中的刺激方法產(chǎn)生同樣的增殖反應(yīng)。說(shuō)明抗原肽最初的刺激方式?jīng)Q定了抗原刺激HIV特異性CD8 T細(xì)胞增殖的時(shí)相和強(qiáng)度。這個(gè)結(jié)果一致于近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)最初TCR的活化決定了CD8 T 細(xì)胞的擴(kuò)增和擴(kuò)增后數(shù)目回縮，之后可不依賴(lài)于抗原的存在[10，11]。有研究證明，抗原與CD8 T細(xì)胞短暫的接觸就足以刺激CD8 T細(xì)胞的增殖和分化為效應(yīng)與記憶細(xì)胞，并且不需要進(jìn)一步的抗原刺激[12，13]。

IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通常用于CD8 T細(xì)胞在體外增殖實(shí)驗(yàn)中的外源性支持因子[14]。本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體系中用IL-2細(xì)胞因子作為外源支持成分與不添加IL-2相比雖然明顯提高增殖的CD8T細(xì)胞數(shù)目，但也引起非特異性增殖。沒(méi)有添加IL-2的培養(yǎng)組, 活細(xì)胞比例在培養(yǎng)后16 d仍可維持在80%以上，這是由于CD8T細(xì)胞在活化后具有自分泌IL-2的功能[9]，并且共培養(yǎng)體系中的CD4 T細(xì)胞等也分泌IL-2和其他細(xì)胞因子比如IL7和IL15支持抗原肽活化CD8T細(xì)胞的增殖[15]。此外，在不添加IL-2的條件下，CD8T細(xì)胞增殖7 d后細(xì)胞數(shù)大量減少，一致于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗原活化CD8 T細(xì)胞在擴(kuò)增一周后由于大量細(xì)胞活化后凋亡導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)回落的增殖規(guī)律[16]。

本研究通過(guò)使用不同抗原刺激方式，以及評(píng)價(jià)在培養(yǎng)體系中添加外源性IL-2的效果，對(duì)目前常用的體外擴(kuò)增HIV特異性CD8 T細(xì)胞的培養(yǎng)模型進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)在不添加外源性IL-2培養(yǎng)條件下應(yīng)用混合APCs呈遞抗原肽的刺激方法可通過(guò)同時(shí)遞呈抗原信號(hào)和細(xì)胞共刺激信號(hào)更好地模擬體內(nèi)抗原遞呈從而特異地刺激了HIV特異性CD8 T細(xì)胞的有效增殖。本研究?jī)H從增殖細(xì)胞數(shù)目對(duì)不同抗原刺激方式進(jìn)行了評(píng)價(jià)，還需進(jìn)一步研究分析不同抗原刺激方式增殖CD8T細(xì)胞的功能和靶細(xì)胞殺傷活性以及抗原特異性T細(xì)胞所占比例。研究結(jié)果將有助于根據(jù)不同研究目的選取適合的體外模型分析HIV特異性CD8 T細(xì)胞的增殖反應(yīng)以及調(diào)控機(jī)制。

4參考文獻(xiàn)

[1]McMichael AJ, Rowland-Jones SL. Cellular immune responses to HIV [J]. Nature, 2001, 410(6831):980-987.doi: 10.1038/3507365835073658 [pii]

[2]Goulder PJ, Phillips RE, Colbert RA, et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS [J]. Nat Med, 1997, 3(2):212-217.PMID:9018241

[3]Schmitz JE, Kuroda MJ, Santra S, et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes [J]. Science, 1999, 283(3403):857-860.PMID:9933172

[4]Ndhlovu ZM, Kamya P, Mewalal N, et al. Magnitude and Kinetics of CD8+ T Cell Activation during Hyperacute HIV Infection Impact Viral Set Point [J]. Immunity, 2015, 43(3):591-604.doi: 10.1016/j.immuni.2015.08.012 [pii]

[5]Ndhlovu ZM, Proudfoot J, Cesa K, et al. Elite controllers with low to absent effector CD8+ T cell responses maintain highly functional, broadly directed central memory responses [J]. J Virol, 2012, 86(12):6959-6969.doi: JVI.00531-12 [pii]10.1128/JVI.00531-12

[6]Ndhlovu ZM, Stampouloglou E, Cesa K, et al. The Breadth of Expandable Memory CD8+ T Cells Inversely Correlates with Residual Viral Loads in HIV Elite Controllers [J]. J Virol, 2015, 89(21):10735-10747.doi:JVI.01527-15 [pii]10.1128/JVI.01527-15

[7]Quah BJ, Warren HS, Parish CR. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester [J]. Nat Protoc, 2007, 2(9):2049-2056.doi: nprot.2007.296 [pii]10.1038/nprot.2007.296

[8]Lichterfeld M, Kaufmann DE, Yu XG, et al. Loss of HIV-1-specific CD8+ T cell proliferation after acute HIV-1 infection and restoration by vaccine-induced HIV-1-specific CD4+ T cells [J]. J Exp Med, 2004, 200(6):701-712.doi: 10.1084/jem.20041270jem.20041270 [pii]

[9]Feau S, Arens R, Togher S, et al. Autocrine IL-2 is required for secondary population expansion of CD8(+) memory T cells [J]. Nat Immunol, 2011, 12(9):908-913.doi: ni.2079 [pii]10.1038/ni.2079

[10]Kaech SM, Ahmed R. Memory CD8+ T cell differentiation: initial antigen encounter triggers a developmental program in naive cells [J]. Nat Immunol, 2001, 2(5):415-422.doi: 10.1038/8772087720 [pii]

[11]Badovinac VP, Porter BB, Harty JT. Programmed contraction of CD8(+) T cells after infection [J]. Nat Immunol, 2002, 3(7):619-626.doi: 10.1038/ni804ni804 [pii]

[12]van Stipdonk MJ, Lemmens EE, Schoenberger SP. Naive CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation [J]. Nat Immunol, 2001, 2(5):423-429.doi:10.1038/8773087730 [pii]

[13]Wong P, Pamer EG. Cutting edge: antigen-independent CD8 T cell proliferation [J]. J Immunol, 2001, 166(10):5864-5868. PMID:11342598

[14]Waldmann TA. The IL-2/IL-15 receptor systems: targets for immunotherapy [J]. J Clin Immunol, 2002, 22(2):51-56.PMID:11998892

[15]Kittipatarin C, Khaled AR. Ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7 [J]. J Immunol Methods, 2009, 344(1):45-57.doi:S0022-1759(09)00073-8 [pii]10.1016/j.jim.2009.03.001

[16]Murali-Krishna K, Altman JD, Suresh M, et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection [J]. Immunity, 1998, 8(2):177-187.doi: S1074-7613(00)80470-7 [pii]

通信作者：陳華標(biāo)，Email: chenhuabiao@hotmail.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.001

(收稿日期：2016-04-04)

Effects of different antigen stimulation methods on the proliferation of HIV specific CD8 T cells

JinCong,TuTing,MouDanlei,LiQunhui，LiTao,WuHao,ChenHuabiao

NationalCenterforAIDS/STDControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(JinC)；JiangsuKeyLaboratoryofClinicalLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China(TuT,LiT,ChenHB);BeijingYou′anHospitalAffilitedCapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China(MouDL,LiQH,WuH);MassachusettsGeneralHospital,USA(ChenHB)JinCongandTuTingarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticleCorrespondingauthor:ChenHuabiao,Email:chenhuabiao@hotmail.com

【Abstract】ObjectiveTo study the factors that influence the ex vivo proliferation of human immunodeficiency virus (HIV) specific CD8 T cells. MethodsThree methods to use HIV-specific antigen peptides stimulating the proliferation of virus specific CD8 T cells from HIV patients were compared, and the effect of adding exogenous IL-2 into co-culture on proliferation was evaluated. ResultsIn comparison to directly adding MHC I matched HIV peptides into peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by presence during co-culture or incubating for 2 hours, the more efficient proliferation of HIV-specific CD8 T cells was stimulated by loading HIV peptides on the mixed antigen presenting cells (APCs) that harvested by removing CD8 T cells from PBMCs. Adding IL-2 into co-culture could largely enhance the number of proliferated HIV-specific CD8 T cells but also induced non-specific proliferation of CD8 T cells. ConclusionsStimulation of HIV-specific CD8 T cells by loading HIV-specific antigen peptides on mixed APCs and in absence of IL-2 can specifically induce the efficient proliferation of HIV-specific CD8 T cells by providing both antigen and co-stimulation signals.

【Key words】Acquired immunode?ciency syndrome； CD8 T cells； Ex vivo proliferation