萬佳　張碩　李阿茜　曲靖　李川　李德新　梁米芳

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·論著·

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白IFITM1/2/3對SFTS病毒感染的影響

萬佳張碩李阿茜曲靖李川李德新梁米芳

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

【摘要】目的在細胞水平初步探索IFITM1/2/3對SFTS病毒感染的影響。方法分別構(gòu)建IFITM1/2/3真核表達載體并驗證其在細胞內(nèi)的表達。在過表達IFITM l/2/3的Vero和THP-1細胞中，利用實時熒光定量PCR檢測不同時間點SFTS病毒的復(fù)制情況。結(jié)果間接免疫熒光及Western Blot檢測顯示重組IFITM l/2/3表達質(zhì)粒在Vero細胞及THP-1細胞內(nèi)可表達。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，IFITM1/2/3對SFTS病毒在細胞內(nèi)的感染均具有顯著的抑制作用，尤其是在細胞感染早期，過表達的IFITM1/2/3對低劑量SFTS病毒感染的抑制作用更為明顯。結(jié)論IFITM l/2/3可在細胞水平抑制病毒復(fù)制。

【主題詞】IFITM1/2/3；SFTS病毒；抗病毒作用

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane proteins, IFITMs) 是一組由干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes, ISGs)編碼表達的抗病毒蛋白[1]。在干擾素(Interferon, IFN)刺激下, IFITMs的表達水平顯著提高。作為細胞內(nèi)參與天然免疫的限制因子，IFITM家族中序列高度同源的IFITM l、IFITM2和IFITM3表現(xiàn)出廣譜的抗病毒活性[2-5]，對立夫特谷熱病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)、拉克羅斯病毒(La Crosse virus, LCV)及漢灘病毒(Hantaan virus)等布尼亞病毒均有明顯的抑制作用[6，7]。

SFTS病毒(Sever fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV) 主要經(jīng)蜱傳播，可引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征，病死率較高，無特異性治療手段及有效的疫苗[8]。IFN誘導(dǎo)的抗病毒蛋白IFITM l、IFITM2和IFITM3主要通過影響病毒入侵過程發(fā)揮作用[2-7,9]。研究這些IFITMs蛋白對SFTS病毒感染與復(fù)制的影響，或可加強對SFTS病毒侵入與感染細胞的機制的了解。目前國內(nèi)外尚未有IFITM l、IFITM2和IFITM3對SFTS病毒相關(guān)作用的研究報道。

1材料與方法

1.1材料HEK293T細胞、THP-1細胞、VERO細胞均購自ATCC；SFTS病毒HB29毒株及pCAGEN載體由本室保存；DH5α感受態(tài)菌株購自全式金公司。胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、DMEM及1640培養(yǎng)基、青鏈霉素(Penicillin Streptomycin, PS)、Ampicillin購自德國Gibco公司；IFN-α、PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)、HRP標記羊抗兔IgG抗體、HRP標記羊抗鼠IgG抗體、FITC標記羊抗兔IgG抗體、鼠源β-Actin抗體購自Sigma公司；兔源IFITM1/2/3多克隆抗體購自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光溶液購自PerkinElmer公司；RNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Roche公司；內(nèi)切酶XhoI、NotI購自美國NEB公司。T4 DNA連接酶、PCR擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑盒購自Ambion公司；熒光定量PCR相關(guān)引物和探針交(上海)生工公司定制。

1.2IFITM1/2/3表達載體的構(gòu)建用含有10%FBS、1%PS的DMEM培養(yǎng)基將IFN-α稀釋至mg/ml，在5%CO2、37 ℃條件下刺激293T細胞24 h后收集并提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR分別擴增IFITM1/2/3相應(yīng)基因，所用引物如下：

IFITM1-F: ccgCTCGAGATGCACAAGGAGGAACATGAGG

IFITM1-R: tgtgGCGGCCGCCTAGTAACCCCGTTTTTCCTG

IFITM2-F: ccgCTCGAGATGAACCACATTGTGCAAACC

IFITM2-R: tgtgGCGGCCGCCTATCGCTGGGCCTGGACGACC

IFITM3-F: ccgCTCGAGATGAATCACACTGTCCAAACC

IFITM3-R: tgtgGCGGCCGCCTATCCATAGGCCTGGAAGATC

1.3重組載體轉(zhuǎn)染細胞將重組質(zhì)粒pCAGEN-IFITM1、pCAGEN-IFITM2、pCAGEN-IFITM3分別轉(zhuǎn)染至Vero細胞和THP-1細胞(操作步驟參考 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent說明書)。其中THP-1細胞在轉(zhuǎn)染前，用含有2%FBS、1%PS的1640培養(yǎng)基將PMA稀釋至mg/ml，在5%CO2、37 ℃條件下誘導(dǎo)分化48 h[10]。同時設(shè)空載體pCAGEN及空細胞對照。

1.4間接免疫熒光(Immunofluorescence, IFA)檢測IFITM1/2/3的表達利用過表達IFITM l/2/3的Vero細胞及THP-1細胞制作抗原片，同時設(shè)空載體pCAGEN對照。加兔源IFITM1/2/3多克隆抗體(一抗，PBS 1∶100稀釋)37 ℃孵育30 min。蒸餾水輕柔吹洗，加FITC標記羊抗兔IgG抗體(二抗，伊文斯藍1∶200稀釋)37 ℃孵育30 min。蒸餾水輕柔吹洗，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測IFITM1/2/3的表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h后，將細胞蛋白變性，上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉2 h，加兔源IFITM1/2/3多克隆抗體(一抗，5%脫脂奶1∶1000稀釋)4 ℃過夜孵育。置于搖床用PBST洗30 min，加HRP標記羊抗兔IgG抗體(二抗，5%脫脂奶1∶5000稀釋)孵育1 h。置于搖床用PBST洗30 min，化學(xué)發(fā)光ECL法顯跡檢測IFITM1/2/3表達。同時設(shè)空載體pCAGEN及空細胞對照，以β-Actin作為內(nèi)參照。

1.6IFITM1/2/3對SFTS病毒感染的影響IFITM1/2/3表達載體分別轉(zhuǎn)染Vero細胞及THP-1細胞48 h后，將SFTS病毒HB29毒株按0.1 MOI和1.0 MOI分別感染上述細胞。同時設(shè)置陰性對照(pCAGEN)及空白細胞對照。分別在感染病毒后12 h、24 h、48 h、72 h收集細胞并提取細胞總RNA(操作步驟參考 RNeasy Mini Kit說明書)，利用real-time RT-PCR方法測定不同細胞、不同染毒量在不同時間點的病毒載量。以Human GAPDH作為內(nèi)參照。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法通過Dunnett-t檢驗比較實驗組與對照組之間的差別，通過SNK-q檢驗比較各實驗組之間的差別。當(dāng)P<0.05時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上統(tǒng)計分析利用IBM SPSS statistics 20.0軟件完成。

2結(jié)果

圖1　間接免疫熒光檢測IFITM1/2/3在細胞內(nèi)的表達Fig.1　IFA test for intracellular expression of IFITM1/2/3

圖2　Western Blot檢測IFITM1/2/3在細胞內(nèi)的表達Fig.2　Western blot detection for intracellular expression of IFITM1/2/3

2.1IFITM1/2/3的表達與鑒定IFN-α刺激293T細胞24 h后收集并提取細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳可見三段400 bp左右的條帶，大小與預(yù)期相符；重組載體經(jīng)雙酶切鑒定顯示片段已成功構(gòu)建入表達載體pCAGEN；測序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件與GenBank中IFITM1/2/3基因序列比對，無突變。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞和THP-1細胞48 h后，分別對兩種細胞進行IFA及Western Bolt檢測。

IFA結(jié)果顯示Vero和THP-1細胞均可見特異性綠色熒光(圖1)。說明IFITM1/2/3在Vero和THP-1細胞中能夠有效表達，且廣泛分布在胞膜和胞漿內(nèi)。據(jù)此結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻資料[2-7，9]，可推斷IFITM1/2/3不僅在細胞膜上發(fā)揮各種功能，還可能參與細胞內(nèi)的各種活動。

Western Bolt檢測結(jié)果可見三條16kDa左右的條帶(圖2)，大小與預(yù)期相符，說明IFITM1/2/3在Vero和THP-1細胞中能夠有效表達，且具有良好的抗體結(jié)合活性；空載體pCAGEN及空細胞對照未見目的條帶表達。

2.2IFITM1/2/3抑制SFTS病毒的感染利用real-time RT-PCR測定不同細胞、不同染毒量在不同時間點的Ct值，并轉(zhuǎn)換為TCID50值，分析IFITM1/2/3對SFTS病毒感染的抑制作用(圖3)。Vero細胞各孔內(nèi)參Human-GAPDHCt值的均值為19.72±0.35，變異系數(shù)CV=1.77%；THP-1細胞各孔內(nèi)參Human-GAPDHCt值的均值為17.64±0.41，變異系數(shù)CV=2.32%；未見過大或過小的離群值，說明PCR數(shù)據(jù)未受到各孔內(nèi)核酸濃度的影響，實驗結(jié)果真實可信。Vero和THP-1細胞中過表達IFITM1、IFITM2和IFITM3的實驗組TCID50值低于對照組(Dunnett-t檢驗，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)，實驗組各組之間TCID50值沒有明顯差異(SNK-q檢驗，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義)，即IFITM1、IFITM2和IFITM3對SFTS病毒在細胞內(nèi)的感染及復(fù)制均有抑制作用，且作用大小沒有顯著區(qū)別。同時，分析數(shù)據(jù)可知：SFTSV感染細胞12 h～24 h時，0.1 MOI染毒劑量組內(nèi)實驗組與對照組的差異顯著高于1.0 MOI染毒劑量組內(nèi)的差異，但這種差異隨感染時間的延長而減小。這說明在細胞感染早期，過表達的IFITM1/2/3對低劑量SFTS病毒感染有更為明顯的抑制作用。

注：1、2、3分別表示轉(zhuǎn)染IFITM1/2/3并染毒的細胞；4表示轉(zhuǎn)染pCAGEN載體并染毒的細胞；5表示只染毒的細胞圖3　IFITM1/2/3抑制SFTS病毒感染Note：1、2 and 3 represent cells transfected with IFITM1/2/3 and infected by SFTS virus; 4 represents cells transfected with pCAGEN vector and infected by SFTS virus; 5 represents cells infected by SFTS virusFig.3　IFITM1/2/3 inhibit SFTS virus infection

3討論

作為人體天然免疫機制的重要組成部分，IFN對入侵人體的病毒并不直接發(fā)揮其抗病毒作用，而是通過誘導(dǎo)宿主細胞表達多種抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP)間接達到抗病毒效果。編碼這些抗病毒蛋白的基因稱干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISG)，而IFITM蛋白家族就是ISG的一組表達產(chǎn)物[13]。人體內(nèi)的IFITM蛋白家族成員有IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5。其中IFITM1、IFITM2和IFITM3與人體免疫相關(guān)，具有廣譜的抗病毒活性，在體內(nèi)多種組織和細胞中均有表達。

IFITM1/2/3的抗病毒活性具有一定選擇性，且它們對同一種病毒的抑制作用亦有差別。對于形態(tài)相似，且包膜上均有相似糖蛋白的布尼亞病毒，IFITM1/2/3的抑制作用亦是如此：沒有IFITMs能夠抑制克里米亞一剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)，僅IFITM 2和IFITM3能夠分別抑制RVFV[8]。作為我國新發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒，SFTS病毒是否受到IFITMs的抑制作用尚未明晰。鑒于此，本實驗通過克隆并表達IFITM1/2/3，在細胞水平初步探索其對SFTS病毒感染的抑制作用。結(jié)果顯示，IFITM1、IFITM2和IFITM3對SFTS病毒在細胞內(nèi)的感染均有明顯抑制作用，且作用大小沒有顯著區(qū)別。實驗數(shù)據(jù)同時提示，在細胞感染早期，過表達的IFITM1/2/3對低劑量SFTS病毒感染有更為明顯的抑制作用。這可能與IFITM1/2/3主要在細胞感染的早期階段阻礙SFTS病毒與細胞受體結(jié)合或抑制SFTS病毒早期膜融合有關(guān)，具體機制還需進一步探索。

總之，本研究驗證了IFITM1/2/3在細胞水平對SFTS病毒感染的抑制作用，為進一步探尋IFITM蛋白家族抑制病毒的機理、SFTS病毒感染細胞的機制及后續(xù)抗病毒藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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通信作者：梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.006

(收稿日期：2016-03-18)

Impact of interferon induced transmembrane proteins IFITM1/2/3 on SFTS virus infection

WanJia,ZhangShuo,LiAqian,QuJing,LiChuan,LiDexin，LiangMifang

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China.Correspondingauthor:LiangMifang,Email:mifangl@vip.sina.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of IFITM1/2/3 on SFTS virus infection. Methods IFITM1/2/3 expression vectors were constructed by inserting corresponding genes into pCAGEN vector respectively and the expression of IFITM1/2/3 were detected by immunofluorescence assay (IFA) and Western Blot analysis. SFTS virus load at different time post infection on Vero and THP-1 cells that overexpressing IFITM1/2/3 were determined by quantitative real-time RT- PCR. ResultsHigh intracellular antibody binding activities of IFITM l/2/3 were observed by IFA and Western Blot assay. The results of real-time RT-PCR indicated that IFITM1/2/3 could significantly inhibit the infection of SFTS virus on the above two cell lines. Furthermore, at early stage of virus infection, the inhibition effects were more obvious for low dose infection. ConclusionsIFITM1/2/3 could effectively inhibit intracellular SFTS virus infection.

【Key words】IFITM1/2/3; SFTS virus; antiviral effect