郭菁華　王衍海

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·論著·

共感染白紋伊蚊濃核病毒-3對登革2型病毒在蚊細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響研究

郭菁華王衍海

273165 曲阜，山東省曲阜師范大學(xué)醫(yī)院防疫科(郭菁華)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(王衍海)

【摘要】目的研究病毒共感染白紋伊蚊C6/36 細(xì)胞后，白紋伊蚊濃核病毒-3(AalDV-3)對登革2型病毒(DENV-2)在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的影響。 方法C6/36 細(xì)胞感染AalDV-3后5 d，共感染DENV-2，設(shè)立單獨感染AalDV-3與DENV-2為對照組。共感染后不同時間點，qPCR法檢測病毒的拷貝數(shù)；共聚焦顯微鏡檢測DENV-2感染率；共感染后37 ℃孵育24 h后，于1～2 d以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果共感染后不同時間點，共感染組相對于DENV-2單獨感染組，DENV-2基因拷貝數(shù)均明顯下降(P<0.05)，其中第8 d病毒滴度降低率達(dá)到最高的67%。共感染組DENV-2細(xì)胞陽性率均低于40%，明顯低于DENV-2單獨感染(>70%， P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，共感染組1～2 d細(xì)胞凋亡率分別為23.43±1.02%和52.83±1.18%，明顯低于DENV-2單獨感染組凋亡率59.43±1.23%和96.21±1.87%(P<0.05)。結(jié)論病毒共感染白紋伊蚊C6/36 細(xì)胞后， AalDV-3可降低對DENV-2拷貝數(shù)，降低DENV-2細(xì)胞感染率，減少DENV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，AalDV-3具有防制蚊媒傳染病的潛在價值。

【主題詞】登革熱病毒；伊蚊屬；濃核病毒，蚊

蚊濃核病毒(Mosquito densoviruses，MDV)是一類蚊類特異性的細(xì)小病毒科(Parvoviridae)，對蚊蟲的病原作用較弱，屬蚊蟲共生微生物(Symbiotic microorganism)，其廣泛存在于自然界的蚊類種群中[1]。本研究以白紋伊蚊濃核病毒-3(Aedes albopictus densovirus-3，AalDV-3)與登革2型病毒(Dengue virus type 2，DENV-2)共感染我國登革熱主要媒介白紋伊蚊(Aedesalbopictus)C6/36細(xì)胞系，探討共感染AalDV-3對DENV-2在蚊細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的抑制作用與DENV-2對蚊細(xì)胞的感染率的影響，探尋登革防治的新策略。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與病毒株白紋伊蚊C6/36 細(xì)胞系為本室保種；質(zhì)粒pUCP與DENV-2病毒新幾內(nèi)亞株(New guinea-C, NGC)由南方醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系顧金保教授惠贈。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與病毒的獲得C6/36細(xì)胞使用10%胎牛血清的RPMI-1640(美國Life Tech公司)培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)。 pUCP為包含AalDV-3全長基因組的感染性克隆，C6/36細(xì)胞融合度至70%以上時轉(zhuǎn)染pUCP，轉(zhuǎn)染后3 d反復(fù)凍融3次，1 200 r/min離心15 min，上清液經(jīng)2 μm濾膜過濾即為AalDV-3原液-C6/36細(xì)胞傳代后2 d接種DENV-2病毒，25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶入300 μl(TCID50=10-7/0.1 ml)病毒懸液，染后5 d，反復(fù)凍融后5 000 r/min離心30 min，上清為DENV-2懸液。

1.3病毒的定量AalDV-3：利用Omega Biotek(美國Omega 公司)提取病毒基因組為模板，使用Real Master Mix qPCR試劑盒(北京Tiangen公司)，以引物DV-3F：5′-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3′、DV-3R：5′-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3′，線性化pUCP為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對定量分析。反應(yīng)條件： 95 ℃ 5 min；之后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)。DENV-2：使用TRIzol? Reagent(美國Life Tech公司)提取總RNA，TIANscript RT Kit(北京 Tiangen公司)進(jìn)行cDNA第一鏈合成。DENV-2的 NS5 片段克隆入載體pLB線性化后作為標(biāo)準(zhǔn)品，以引物 DENV-2F: 5′-TCCCTTACAAATCGCAGCAAC-3′、DENV-2R: 5′-TGGTCTTTCCCAGCGTCAAT-3′進(jìn)行絕對定量檢測，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；之后95 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，共30個循環(huán)。

1.4病毒的共感染以濃度1×108拷貝/ml AalDV-3 100 μl于6孔板感染C6/36細(xì)胞，感染后5 d加入3×106拷貝/ml DENV-2 100 μl共感染，每兩天對樣品AalDV-3與DENV-2的基因拷貝與C6/36細(xì)胞感染率進(jìn)行檢測，共進(jìn)行10 d。設(shè)立DENV-2與AalDV-3單獨感染為對照。

1.5共聚焦顯微鏡檢測C6/36細(xì)胞DENV-2感染率PBS漂洗細(xì)胞后4%多聚甲醛固定30 min， PBS再漂洗3次后加 0.5% TritonX-100室溫孵育15 min。PBS漂洗后5%胎牛血清室溫封閉30 min，加FITC標(biāo)記抗DEV-2 E蛋白多克隆抗體(英國Biorbyt公司)(1∶200稀釋)，避光4 ℃ 孵育2 h。同時使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色(瑞士Roche公司)，熒光封片劑封片后激光共聚焦顯微鏡(德國 Zeiss 公司)拍照,每孔隨機(jī)觀察3個視野， 每視野觀察100個細(xì)胞，計數(shù)綠色熒光的細(xì)胞百分率。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測C6/36細(xì)胞凋亡率共感染方法同上，共感染溫度設(shè)為37 ℃ 24 h，以單獨感染DENV-2與AalDV-3為對照，感染后置回27 ℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后1～2 d以預(yù)冷PBS洗滌后，加入300 μl的 1×binding buffer重懸細(xì)胞; 細(xì)胞懸液移至測量管，加入5 μl Annexin V-FITC(自美國 BioVision公司)，室溫避光放置 15 min，再加入5 μl PI行流式細(xì)胞儀檢測。

2結(jié)果

2.1共感染后AalDV-3對DENV-2的增殖影響為檢測共感染后AalDV-3對DENV-2的增殖影響，于共感染后0、2、4、6、8、10 d對兩種病毒的基因拷貝數(shù)進(jìn)行了絕對定量分析。結(jié)果顯示，共感染組在共感染后不同時間點AalDV-3的基因拷貝數(shù)逐漸增高，至感染后第6天達(dá)到頂峰，基因拷貝數(shù)增加了5倍左右，與單獨感染AalDV-3組相比病毒基因拷貝數(shù)在各個時間點無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖1A)。感染組DENV-2基因拷貝數(shù)于共感染后緩慢增長，至第10 d增長約4倍左右，而單獨感染DENV-2組病毒基因拷貝數(shù)隨濃度迅速增高，在感染后第8d達(dá)到頂峰，基因拷貝數(shù)增長了10倍(圖1B)，共感染組與單獨感染組相比較，DENV-2病毒基因拷貝數(shù)顯著降低，證明共感染AalDV-3抑制了DENV-2在蚊C6/36細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

共感染組與單獨感染組感染后不同時間點病毒基因拷貝數(shù)A：AalDV-3；B：DENV-2 圖1　共感染AalDV-3對DENV-2在蚊C6/36細(xì)胞內(nèi)增殖的影響Gene copy numbers of AalDV-3(A)and DENV-2(B)in single infection and coinfection group at different time points post infectionFig.1　Influence of growth of DENV-2 in mosquito C6/36 cells post-coinfected with AalDV-3

A　單感染組與共感染組共感染后不同時間點的C6/36細(xì)胞DENV-2陽性率；B　共感染4 d后免疫共聚焦顯微鏡顯示綠色熒光的DENV-2抗原陽性C6/36細(xì)胞，藍(lán)色顯示DAPI染色細(xì)胞核圖2　共感染AalDV-3后對C6/36細(xì)胞DENV-2感染率的影響A:Percentage of DENV-2 positive C6/36 cells in single infection and coinfection group at different time points post infection; B: Merged image of Confocal microscope photomicrographs of immunouorescence with DAPI stained nuclei from C6/36 cell of single infection and coinfection group at 4 d post coinfectionFig.2　Influence of percentage of DENV-2 positive C6/36 cells post-coinfected with AalDV-3

2.2共感染AalDV-3后降低細(xì)胞DENV-2感染率為了檢測共感染后DENV-2對C6/36細(xì)胞的感染率的變化，我們于共感染后不同時間使用共聚焦顯微鏡，對C6/36細(xì)胞的DENV-2感染率進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，單獨感染DENV-2組在不同時間點C6/36細(xì)胞的DENV-2感染率均達(dá)到70%以上；而共感染組，不同時間點C6/36細(xì)胞的DENV-2感染相對于對照組顯著下降，最高不超過40%。圖2B可見，在共感染后4 d，使用FITC標(biāo)記的抗DENV-2 E蛋白抗體檢測到的綠色熒光的DENV-2陽性細(xì)胞數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單獨感染DENV-2對照組。

2.3共感染AalDV-3后降低C6/36細(xì)胞凋亡率通過三次重復(fù)實驗，流式細(xì)胞術(shù)檢測共感染后1 d與2 d各組C6/36細(xì)胞凋亡率分別為：共感染組(23.43±1.02%、52.83±1.18%)，AalDV-3感染組(1.23±0.26、1.78±0.33%)和DENV-2感染組(59.43±1.23%、96.21±1.87%)，空白對照組(1.10±0.32%、1.44±0.29%)。共感染組與單獨感染DENV-2組比較，細(xì)胞凋亡率均明顯降低，尤其在感染后2 d細(xì)胞凋亡率降低接近50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。證明共感染后AalDV-3有效地抑制了登革病毒誘導(dǎo)C6/36細(xì)胞凋亡的作用。而單獨感染AalDV-3，細(xì)胞凋亡率與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，證實AalDV-3本身并不會對宿主細(xì)胞C6/36細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。

A DENV-2感染組； B 共感染組； C AalDV-3感染組； D 空白對照組圖3　單感染與共感染組于共感染后2 d C6/36細(xì)胞形態(tài)A DENV-2 infected group; B co-infection group;C AalDV-3 infected group; D bank controlFig.3　Image of C6/36 cells of single infection and co-infection group at 2 d post co-infection

3討論

蚊類體內(nèi)有多種細(xì)菌、病毒和真菌等共生體，隨著對這些共生體研究的深入，它們顯示出蚊媒控制的潛在價值，例如沃爾巴克氏體(Wolbachia)具有影響蚊蟲壽命、繁殖能力、性別分化等效應(yīng)，已經(jīng)初步應(yīng)用于蚊蟲的控制，并在我國廣東地區(qū)進(jìn)行了大規(guī)模的現(xiàn)場實驗[2]。此外，蚊蟲共生體可通過多種復(fù)雜的機(jī)制在蚊蟲體內(nèi)抑制某些病原體的感染、繁殖從而抑制某些蚊媒傳染，比如沃爾巴克氏體可有效抑制登革病毒、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)、西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)等[3]的繁殖從而降低媒介能量，防制媒介傳染病。MDV屬于蚊蟲特異的病毒共生體，生物安全性高，蚊種群中廣泛分布，可水平傳播、垂直傳播在種群內(nèi)擴(kuò)散[4]。我們的研究結(jié)果證實，AalDV-3在蚊細(xì)胞內(nèi)可以抑制DENV-2對蚊細(xì)胞的感染率，同時降低DENV-2拷貝數(shù)，這種多重感染后病毒的相互影響也見于恩湖米里姆病毒(Nhumirim virus，NHUV)對西尼羅病毒的抑制[5]，辛德畢斯病毒(Sindbis virus，SINV)對DENV-4的抑制[6]。其主要機(jī)制可能是：首先建立感染的病毒利用了細(xì)胞內(nèi)用于病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的資源，造成之后入侵的病毒缺少這些必要胞內(nèi)的資源；其次這些病毒可能具有競爭細(xì)胞膜受體的情況，導(dǎo)致一種病毒拮抗另一種病毒入胞；此外首先入侵的病毒可能觸發(fā)細(xì)胞的諸如RNA干擾(RNA interference，RNAi)等免疫進(jìn)程，從而抑制其它病毒的再次定殖[7,8]。蚊作為媒介可以傳播多種病毒性傳染病，而蚊體內(nèi)多種病毒之間的拮抗作用有可能成為一種我們控制病毒的策略[9]。我們的研究顯示，AalDV-3具有在媒介細(xì)胞內(nèi)拮抗登革病毒的能力，有助于我們發(fā)展其為抗登革病毒在媒介體內(nèi)傳播的生物防制工具?？赏ㄟ^在野外蚊蟲孳生地播撒病毒，感染蚊蟲種群，使其再感染登革病毒的幾率降低或降低媒介能量。此外，由于病毒基因組已經(jīng)克隆入質(zhì)粒載體構(gòu)建成傳染性克隆[10]，利于通過基因工程方法對其進(jìn)行改造，使其表達(dá)針對登革病毒的抗原分子或小分子RNA，最終達(dá)到登革防制的目的。

4參考文獻(xiàn)

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通信作者：郭菁華，Email：gonghui6785@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.004

(收稿日期：2016-04-06)

Co-infection of a mosquito- specific aedes albopictus densovirus-3 to influence dengue 2 virus replication in mosquito cell

GuoJinghua，WangYanhai

DepartmentofPreventionandHealthCare，HospitalofQufuNormalUniversity，Qufu273165，China(GuoJH)；NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(WangYH)Correspondingauthor:GuoJinghua，Email：gonghui6785@163.com

【Abstract】ObjectiveTo study co-infection of a mosquito-specific Aedes albopictus densovirus-3 (AalDV-3) to interfere dengue virus type 2 (DENV-2) replication in mosquito cell. MethodsCo-infected Ae.albopictus C6/36 cell with DENV-2 at 5 days post AalDV-3 infection, and DENV-2 and AalDV-3 single infected cell were used as control groups, respectively. The genome copy number of virus were quantified using real-time quantitative PCR (qPCR), percentage of DENV-2 positive C6/36 cells were determined by confocal microscope, apoptosis ratio of infected C6/36 cell were detected using flow cytometry at different time points post infection. ResultsThe genome copy number of DENV-2 in co-infection group was significantly lower than that of single DENV-2 infection group at different time points post infection, and reached highest inhibitory ratio (67%) at 8 days post co-infection. DENV-2 antigen positive C6/36 cells of co-infection displayed significant lower percentage (>40%) than that of single infection group (>70%, P<0.05) at different time points post infection. The apoptosis ratio of C6/36 cell in co-infection group were 23.43±1.02% and 52.83±1.18% at 1 and 2 day post infection, that were lower than that of single infection group (59.43±1.23% and 96.21±1.87%, P<0.05). ConclusionsCo-infected Aedes albopictus C6/36 cell with AalDV-3 can down regulate the gene copy number of DENV-2 in cell, infected cell ratio and apoptosis ratio, and AalDV-3 has the potential as a tool for dengue control.

【Key words】Dengue virus；Aedes； Densovirus， Mosquito