盧學(xué)新　伊瑤　蘇秋東　畢勝利

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1例HDV抗體 IgM陽性HBV S抗原陰性的肝炎患者分子診斷分析

盧學(xué)新伊瑤蘇秋東畢勝利

102206 北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

【摘要】目的為了進(jìn)一步對臨床中可能出現(xiàn)HDV抗體IgM陽性，常規(guī)HBV 五項檢測陰性的特殊患者進(jìn)行診斷，從而對HDV的感染進(jìn)行準(zhǔn)確的判定。方法設(shè)計HBV和HDV的特異引物，通過提取血清中病毒的核酸，擴(kuò)增出病毒的基因組序列，使用BLAST在Genebank中進(jìn)行比對。結(jié)果本實驗在這例血清中擴(kuò)增到了HDV和HBV的基因序列，通過BLAST后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增序列與HBV和HDV基因序列存在較高的一致性。結(jié)論在臨床診斷中，HDV感染者會出現(xiàn)血清中HDV抗體IgM陽性HBV S抗原陰性的特殊情況，應(yīng)當(dāng)引起臨床的重視。

【主題詞】HDV；共感染；丁肝抗體；分子診斷

丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷性病毒，必須在乙肝病毒存在的條件下才能進(jìn)行傳播[1]。據(jù)估算，丁肝病毒感染者的數(shù)量約占乙型肝炎患者的5%，全球約有1700萬人發(fā)病[2]，在我國的流行病學(xué)調(diào)查中，丁肝患者在乙肝陽性的人群中的流行率約為2%～5%[3]。丁型病毒性肝炎通常與更嚴(yán)重的肝損傷和重度慢性肝炎相關(guān)，如果出現(xiàn)誤診會對患者的生命帶來嚴(yán)重的影響[4]?，F(xiàn)在臨床上一般采用血清學(xué)方法對患者進(jìn)行檢測，當(dāng)血清中出現(xiàn)丁肝病毒特異性的抗體時，判定感染了丁肝病毒[5-9]。但其中少數(shù)患者乙肝常規(guī)五項檢測結(jié)果為陰性，這與丁肝病毒的生物學(xué)特性相悖，給臨床上對丁肝的診斷和治療帶來了困難。

本實驗收集了1例來自浙江某醫(yī)院的丁肝IgM陽性但乙肝S抗原陰性的血清標(biāo)本，采用核酸檢測的方法，對標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步檢測。提取血清總核酸后，通過對丁肝RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，設(shè)計巣式PCR引物，擴(kuò)增出丁肝基因組核酸的序列。同時對乙肝病毒進(jìn)行Nest-PCR，擴(kuò)增乙肝病毒的保守區(qū)。實驗證明臨床中存在丁肝病毒抗體IgM陽性但乙肝五項檢測均為陰性的特殊患者。

1材料與方法

1.1材料來自浙江省某醫(yī)院的血清一份，對血清進(jìn)行了丁肝病毒IgG抗體，丁肝病毒 IgM 抗體，常規(guī)乙肝五項(HbsAg，抗-HBs，HbeAg，抗-HBe抗-HBc-IgG)檢測復(fù)核，結(jié)果分別為HDV IgM 陽性,HDV IgG陰性，常規(guī)乙肝五項檢查均為陰性。丁肝IgG和IgM檢測試劑盒購買自北京貝爾生物工程有限公司，乙肝五項檢測試劑盒購買自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，實驗中血清RNA/DNA提取試劑盒購買自德國Qiagen公司，膠回收試劑盒購買自六合通公司，引物合成和測序均由六合華大基因公司完成。

1.2血清中病毒核酸的提取血清中病毒DNA和RNA通過QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑盒提取，使用的血清為0.2 ml，最終使用20 μl的DEPC處理的高純水洗脫。所有操作按照說明書，通過德國Qiagen公司的自動核酸提取儀進(jìn)行。提取的病毒RNA/DNA儲存于-80℃。

1.3丁肝病毒核酸的逆轉(zhuǎn)錄和Nest-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用的是Thermo fisher公司的Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，丁肝病毒的RT-PCR反應(yīng)體系1為10 μl，體系1的組成為1 μl的6 bp的random primer，1 μl的dNTP, 8 μl的血清核酸提取產(chǎn)物。體系2 的組成為1 μl的逆轉(zhuǎn)錄酶，4 μl 5X的buffer，0.5 μl的Ranse inhibitor 加水至10 μl。反應(yīng)過程為體系1 先65℃水浴5 min后，立即冰浴3 min，然后加10 μl的體系2，整個RT-PCR的反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件為30℃10 min，42℃ 1 h，70℃15 min，4℃，30 min。 反應(yīng)后液體儲存于-20℃。

隨后進(jìn)行丁肝的Nest-PCR，外側(cè)引物為上游引物wf-DM：5′-TTTCAAAGTGACCGAGGGGGGTGAC-3′; 下游引物wr-DM：5′-GGGGGTGTGAACCCCCTCGAAGGTG-3′.內(nèi)測引物為: 上游nf—Dm: 5′- GCGTTCCATCCTTTCTTACCTGATG-3′；下游nr-Dm：5′- GACGAGAGAAGGGAAAGAAGAATAG-3′. 反應(yīng)體系為50 μl，PCR的反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，72℃ 10 min，4℃ 30 min。 30個循環(huán)后取1 μl作為模板進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)條件和第一輪相同。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。隨后切取目標(biāo)條帶。16℃反應(yīng)連接至pUC18-T載體。轉(zhuǎn)化至DH5а菌株，挑取單克隆送往公司測序。

1.4乙肝病毒的Nest-PCR乙肝病毒的反應(yīng)體系為50 μl，反應(yīng)體系為2 μl的模板，上下引物各1 μl，25 μl的PCR mix，加去離子水補齊至50 μl。第一輪外側(cè)PCR的上游引物為:5′-AGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCG-3′，下游引物為：5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTC-3′。反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，4℃ 30 min，反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)。第二輪內(nèi)測PCR的上游引物是：5′-CCCGCAAATATACATCGTTTCCATG-3′，下游引物是：5′-ACAGTCTTTGAAGTATGCCTCAAGG-3′，PCR 反應(yīng)條件同上。35個循環(huán)后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。切取目標(biāo)條帶連接至TaKaRa公司的pMD18-T載體。轉(zhuǎn)化E.coliDH5а菌株，挑取單克隆送往公司測序。

1.5序列比對分析將測序結(jié)果使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的在線Standard Nucleotide BLAST工具進(jìn)行比對，比對時的參數(shù)選擇默認(rèn)選項，得到結(jié)果進(jìn)行評價。

2結(jié)果

2.1丁肝病毒和乙肝病毒的PCR 結(jié)果通過對丁肝病毒特異性的巣式PCR后，丁肝病毒保守區(qū)擴(kuò)增片段長度為381 bp，乙肝病毒的特異性序列的擴(kuò)增是長度為320 bp，與預(yù)期大小相符。如圖1所示。

2.2測序后進(jìn)行BLAST比對測序片段經(jīng)過膠回收純化后，連接在pUCMD-18T載體上，進(jìn)行測序。測序后的結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對。

2.3丁肝病毒克隆序列BLAST比對結(jié)果對測序得到的381 bp的序列進(jìn)行BLAST序列進(jìn)行比對，比對的為Program BLASTN 2.3.1+，全部的381 bp均在數(shù)據(jù)庫中有匹配，與數(shù)據(jù)庫中有多條一致性達(dá)到99%的序列，在圖2中，顯示一致性較高的6條序列。這六條序列全部來自于HDV已有的測序結(jié)果，屬于HDV基因型Ⅰ型。因此可以推斷，從實驗樣本中PCR獲取到的序列是來自于丁肝病毒特異性擴(kuò)增的序列，也證明了患者體內(nèi)是存在丁型肝炎病毒。

表1　HDV克隆測序的blast比對結(jié)果

2.4乙肝病毒克隆序列Blast比對結(jié)果采用和HDV同樣的對比條件，經(jīng)過序列比對后，目的序列與Genebank中存在一致性高達(dá)98%的序列，所有一致性較高的序列來自于HBV的分離株，分離株屬于基因型B型。由此證明，患者血清中分離到了HBV病毒，患者體內(nèi)存在乙型肝炎病毒。

表2　HBV克隆測序的blast比對結(jié)果

通過Blast比對，擴(kuò)增的丁肝病毒序列和乙肝病毒序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中的序列一致性在99%和98%以上，結(jié)果表明此例患者同時感染了乙肝病毒和丁肝病毒。在非肝移植的患者中，HDV的感染和HBV的感染時同時存在的，這是符合HDV生物學(xué)特性的，但血清學(xué)中會出現(xiàn)HDV IgM陽性而常規(guī)HBV 五項檢測陰性的結(jié)果，在臨床診療中也是實際存在的，應(yīng)引起關(guān)注。

3討論

丁型肝炎病毒的病毒顆粒外層是乙肝病毒的表面抗原構(gòu)成的雙層膜結(jié)構(gòu)，在臨床采用的血清學(xué)檢測方法中，由于抗體不能識別被膜包裹的HDV抗原，所以臨床中多采用檢測血清中針對丁肝病毒抗原的抗體存在與否進(jìn)行判斷是否被丁肝病毒感染[10]?，F(xiàn)在已經(jīng)有了依賴丁型肝炎病毒核酸的檢測試劑盒，但由于丁肝病毒是RNA病毒，對血清的處理會導(dǎo)致臨床應(yīng)用中不確定的因素增加，干擾對結(jié)果的判定?，F(xiàn)在臨床多數(shù)還是采用血清學(xué)方法對丁肝感染進(jìn)行判定。血清學(xué)檢測中很多特殊的結(jié)果會影響對疾病的診斷，進(jìn)而影響患者的治療，本實驗解釋了一種特殊型結(jié)果存在的可能。當(dāng)前臨床診斷中采用的ElISA方法只能檢測到ng級別的抗體水平，這可能帶來假陰性的結(jié)果。不同廠家的試劑存在敏感性和特異性的差異，造成檢測結(jié)果的不同，也會影響檢測的可靠性。

丁型肝炎病毒可以通過共感染或是超感染兩種方式感染患者[11]，在超感染者中，患者已經(jīng)是乙肝病毒的攜帶者或是處于乙肝病毒的復(fù)制期。此時丁肝病毒的復(fù)制會導(dǎo)致患者嚴(yán)重的肝損傷，加重病情的發(fā)展。由于患者體內(nèi)預(yù)先存在針對乙肝患者的免疫反應(yīng)，血清中的乙肝表面抗體檢測呈陽性反應(yīng)。但在共感染的群體中，乙肝病毒和丁肝病毒同時感染機(jī)體，丁肝病毒在復(fù)制的過程中，會抑制乙肝病毒的復(fù)制。共感染的患者約90%～95%會恢復(fù)，并不能發(fā)展為慢性丁型病毒性肝炎，與超感染中僅僅5%～10%的恢復(fù)患者形成顯著性的對比[12]。這是丁肝病毒本身的生物學(xué)特征決定的。丁肝病毒抑制了乙肝病毒的復(fù)制，少量的乙肝病毒并沒有激發(fā)機(jī)體針對表面抗原特異的抗體出現(xiàn)，乙肝病毒的復(fù)制受到抑制，血清中的S抗原并沒有達(dá)到ELISA方法檢測的限度，這是本實驗中血清檢測結(jié)果出現(xiàn)的可能原因。應(yīng)該進(jìn)行更多的檢測，通過對大量臨床樣本的進(jìn)一步檢測，對得到的病毒核酸序列進(jìn)一步分析，對該病人進(jìn)一步觀察，對實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證。有文獻(xiàn)報道可以在這類病人的血清中檢測到乙肝核心抗體的IgM為陽性，這可以說明HDV的感染時通過和HBV的共感染產(chǎn)生的。本例患者也應(yīng)進(jìn)行核心抗體IgM的檢測，可以對患者的感染情況進(jìn)行更準(zhǔn)確的判斷。

根據(jù)當(dāng)前對HDV生命周期的研究，一旦機(jī)體被HDV感染，雖然沒有HDV病毒產(chǎn)物的出現(xiàn)，但是HDV可以在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制及產(chǎn)生抗原，這種不成熟的病毒缺少HBV的表面抗原不能排出細(xì)胞外。當(dāng)機(jī)體再次被HBV感染時，表面抗原可以幫助HDV形成完整的顆粒，就會引起丁型病毒性肝炎，并且引起的肝損傷會較普通的病毒性肝炎更加嚴(yán)重?，F(xiàn)在已有土撥鼠模型證明了這種現(xiàn)象的存在，土撥鼠可表達(dá)丁肝抗原，當(dāng)注射高滴度的WHBV血清時，血中出現(xiàn)了HDV的感染性的完整病毒顆粒。在臨床檢查中，如果出現(xiàn)HDV IgM陽性而HBV為陰性的患者，必須要對患者給予適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)，避免因為再次接觸HBV而引起更嚴(yán)重的肝臟疾病。

4參考文獻(xiàn)

[1]Negro F, Baldi M, Bonino F, et al. Chronic HDV (hepatitis delta virus) hepatitis. Intrahepatic expression of delta antigen, histologic activity and outcome of liver disease. J Hepatol, 1988，6(1): 8-14. doi：10.1016/S0168-8278(88)80457-4.

[2]Manesis EK, Vourli G, Dalekos G, et al.Prevalence and clinical course of hepatitis delta infection in Greece: a 13-year prospective study. J Hepatol, 2013，59(5): 949-56.doi：10.1016/j.jhep.2013.07.005.

[3]Semenov AV. Prevalence of seronegative hepatitis D among patients with chronic viral hepatitis B. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2012，6(1): 106-109. doi:PMID: 23297644.

[4]Gunsar F.Treatment of delta hepatitis. Expert Rev Anti Infect Ther, 2013,11: 489-98.doi：10.1586/eri.13.35.

[5]Rizzetto M, Hepatitis D Virus: Introduction and Epidemiology. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015，5(7): a021576. doi:10.1101/cshperspect.a021576.

[6]Wranke A, Heidrich B, Ernst S, et al. Anti-HDV IgM as a marker of disease activity in hepatitis delta. PLoS One, 2014,9(7): e101002. doi：10.1371/journal.pone.0101002.

[7]Olivero A, Smedile A. Hepatitis delta virus diagnosis. Semin Liver Dis, 2012，32(3): 220-227. doi：10.1055/s-0032-1323627.

[8]Olal SO, Akere A, Otegbayo JA, et al.Are patients with primary hepatocellular carcinoma infectious of hepatitis B, C and D viruses? Afr J Med Med Sci, 2012, 41 Suppl: 187-191. doi：PMID: 23678655.

[9]Mederacke I, Yurdaydin C, Dalekos GN, et al. Anti-HDV immunoglobulin M testing in hepatitis delta revisited: correlations with disease activity and response to pegylated interferon-alpha2a treatment. Antivir Ther, 2012，17(2): 305-312. doi：10.3851/IMP1926.

[10]Alfaiate D, Deny P, Durantel D. Hepatitis delta virus: From biological and medical aspects to current and investigational therapeutic options. Antiviral Res, 2015，122: 112-29. doi：10.1016/j.antiviral.2015.08.009.

[11]Mansour W,Lemoine M, Neripinto F, et al. Markers of hepatitis delta virus infection can be detected in follicular fluid and semen. J Clin Virol, 2014，61(2): 279-281. doi： 10.1016/j.jcv.2014.06.029.

[12]Yurdaydin C. Idilman R, Therapy of Delta Hepatitis. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015，5(10).doi：10.1101/cshperspect.a021543.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.012

(收稿日期：2016-03-12)

Molecular diagnostic analysis of hepatitis patients with HDV IgM antibody positive and the HBV surface Antigen-negative

LuXuexin，YiYao,SuQiudong,BiShengli

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,ChangbaiRoad155,Beijing102206,China

【Abstract】ObjectiveIn order to further accurate diagnosis of the special serum with HDV IgM antibody positive but conventional HBV five detection negative. Methods designing the specific primers，by extracting the nucleic acid of the virus in the serum , amplifying the virus genome conservative region, and then blast the sequences in Genebak. ResultsIn this study, the HDV and HBV conserved regions were amplified in the serum, after blast, the amplified sequences were found to be consistent with the conserved regions of HBV and HDV. ConclusionIn clinical, HDV infection will appears in the serum of HDV antibody IgM positive but HBV S antigen negative, it should cause more attention in clinic for HDV infected.

【Key words】HDV；co-infection；antibody for HDV；Nucleic Diagnostics

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