肖成建，陳　楠，江　慰，羅　瑋，王　強(qiáng)，李漢廣，余曉斌*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

ARTP誘變及高效篩選高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株

肖成建1，陳楠1，江慰2，羅瑋1，王強(qiáng)1，李漢廣1，余曉斌1*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

以黑曲霉為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體（ARTP）注入技術(shù)對(duì)前培養(yǎng)后的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，并結(jié)合改進(jìn)后的鄰聯(lián)茴香胺高效平板顯色圈進(jìn)行初篩及搖瓶復(fù)篩。獲得一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量由出發(fā)菌的45.6 U/mL提高到85.3 U/mL。通過(guò)對(duì)發(fā)酵關(guān)鍵條件碳酸鈣和吐溫-80添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示酶活提高到125.6 U/mL，較原始菌株提高了175.4%。經(jīng)6代傳代培養(yǎng)，產(chǎn)葡萄糖氧化酶性能穩(wěn)定。

常壓室溫等離子體；鄰聯(lián)茴香胺顯色圈；葡萄糖氧化酶；誘變；黑曲霉

葡萄糖氧化酶 （Glucose oxidase簡(jiǎn)稱GOD）作為一種需氧脫氫酶，能在有氧條件下專一地將β-D-葡萄糖催化生成過(guò)氧化氫和D-葡萄糖-δ-內(nèi)酯，且D-葡萄糖-δ-內(nèi)酯會(huì)自發(fā)地進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸［1-2］。在發(fā)酵工程、食品添加劑、生物傳感器、動(dòng)物飼料添加劑、生化材料和檢測(cè)試紙等方面葡萄糖氧化酶都有著廣泛的應(yīng)用［3］。目前，黑曲霉和青霉是大規(guī)模生產(chǎn)葡萄糖氧化酶最主要的菌株，但我國(guó)工業(yè)生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的活性、純度以及酶的穩(wěn)定性都普遍偏低，長(zhǎng)期依賴于進(jìn)口［4-5］。常壓室溫等離子體 （Atmospheric and Room Temperature Plasmas，簡(jiǎn)稱ARTP）誘變育種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐，證明其有對(duì)操作者安全、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、突變率高、突變快速、獲得的突變株性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，目前成功應(yīng)用于包括細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母、微藻等在內(nèi)的40多余種微生物的誘變育種［6］。因此，作者采用常壓室溫等離子體誘變育種技術(shù)并結(jié)合理性篩選模型獲得一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以提高該菌產(chǎn)酶能力。

1材料與方法

1.1菌種

作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，具有產(chǎn)葡萄糖氧化酶能力的黑曲霉菌株。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1固體平板培養(yǎng)基（g/L）馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20；pH自然。

1.2.2種子培養(yǎng)基（g/L）蔗糖 70，魚(yú)蛋白胨 10，玉米粉 15，吐溫-80 15，KH2PO40.2，（NH4）2HPO40.4，MgSO4·7H2O 0.2。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）蔗糖 85，牛肉膏 3.5，玉米粉 15，（NH4）2SO417，（NH4）2HPO40.6，KH2PO40.3，吐溫-80 20，CaCO335；pH 5.5。

1.3常壓室溫等離子體（ARTP）誘變

首先用無(wú)菌的種子培養(yǎng)液將已成熟（斜面培養(yǎng)5 d）的黑曲霉孢子洗下，加入玻璃珠于搖床180 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)6 h（前期培養(yǎng)）。用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾即得到處于萌發(fā)狀態(tài)的孢子懸液，調(diào)整孢子懸液濃度為106個(gè)/mL。打開(kāi)ARTP紫外殺菌預(yù)熱20 min，設(shè)定誘變處理參數(shù)。等離子工作氣體為氦氣，設(shè)定工作電源功率120 W，氣體流速為12 L/min，照射距離2 mm。吸取孢子懸液涂布于小鋼板上，每個(gè)鋼板涂布菌懸液10 μL。照射處理時(shí)間為0～240 s。用無(wú)菌生理鹽水將照射處理完的孢子洗下，涂布于篩選平板。通過(guò)菌落形成單位，計(jì)算菌株致死情況，并以此繪制致死率曲線［7］。誘變后顯色圈直徑大于誘變前的菌株顯色圈直徑5%以上的記為正突變菌株，正突變菌株數(shù)除以總顯色菌株數(shù)記為正突變率。

1.4篩選

1.4.1初篩利用雙層平板進(jìn)行高產(chǎn)葡萄氧化酶的初步篩選，下層平板為葡萄糖10 g/L，鄰聯(lián)茴香胺0.1 g/L，辣根過(guò)氧化酶0.05 g/L（200 U/mg）和瓊脂粉20 g/L；上層平板為20 g/L的瓊脂粉。為了保證酶的活力，待培養(yǎng)基溫度降低至50℃左右時(shí)候，加入辣根過(guò)氧化酶。經(jīng)誘變處理后的孢子，涂布在篩選平板上，30℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)呈現(xiàn)的棕色圈的大小，挑選棕色圈較大的進(jìn)行復(fù)篩［8］。

1.4.2復(fù)篩將初篩得到的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min、30℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定各自酶活，挑選出產(chǎn)酶提高大的菌株。

1.5酶活測(cè)定方法

15 mL刻度管里加入1 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；2.9 mL鄰聯(lián)茴香胺葡萄糖溶液（0.01 g鄰聯(lián)茴香胺溶解于8 mL甲醇，取5.25 mL加水定容到100 mL。再加入10%的葡萄糖溶液；葡萄糖溶液與鄰聯(lián)茴香胺溶液比為16：100）；100 μL辣根過(guò)氧化物酶（60 U/mL）；在38℃水浴鍋振蕩預(yù)熱20 min。取發(fā)酵液稀釋10倍，制成粗酶液，水浴預(yù)熱20 min。取酶液50 μL加入刻度管，振蕩反應(yīng)60 s，加入2 mL濃鹽酸（5 mol/L）終止反應(yīng)。置于涼水使得反應(yīng)顏色穩(wěn)定。

酶活單位定義：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，一分鐘內(nèi)葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產(chǎn)生1 μmol過(guò)氧化氫所需酶量為一個(gè)單位U。

1.6遺傳穩(wěn)定性分析

連續(xù)傳代6代，分析所篩選的高產(chǎn)菌株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的能力和性能變化。

2結(jié)果與分析

2.1ARTP對(duì)菌株的致死率和正突變率曲線

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期使用ARTP技術(shù)對(duì)黑曲霉孢子誘變發(fā)現(xiàn)，黑曲霉孢子在較長(zhǎng)的照射時(shí)間下仍然致死率低，同時(shí)發(fā)生正突變的菌株少。因此對(duì)孢子進(jìn)行前期培養(yǎng)，以期提高ARTP的作用效果。圖1-2分別為經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)和未經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)進(jìn)行誘變處理后致死率和突變率結(jié)果對(duì)比。

圖1　　菌株經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)不同照射時(shí)間下的致死率和正突變率Fig.1　Death rate and positive mutation of the strain at different irradiation time after pre-culture

圖2　菌株未經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)不同照射時(shí)間下的致死率和正突變率Fig.2　Death rate and positive mutation of the strain at different time without pre-culture

圖1-2分別為經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)和未經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)的誘變致死曲線和正突變曲線。可見(jiàn)黑曲霉孢子在經(jīng)過(guò)前期的培養(yǎng)后，在僅照射時(shí)間不同的情況下，其達(dá)到相同的致死率所需要的照射時(shí)間明顯縮短。經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)的孢子在照射時(shí)間120 s的時(shí)候，致死率達(dá)到95%以上。而沒(méi)有經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)的孢子，達(dá)到95%以上的致死率需要300 s以上。氦離子產(chǎn)生的活性粒子，一方面能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；另一方面穿過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，打斷基因和蛋白質(zhì)分子內(nèi)鍵等。大部分的微生物因此死亡，也有小部分微生物通過(guò)修復(fù)系統(tǒng)而存活。而正是在這過(guò)程中發(fā)生了基因突變［9］。所以通過(guò)ARTP技術(shù)操作來(lái)快速獲得突變菌株成為可能。孢子前期培養(yǎng)萌發(fā)進(jìn)入同步生長(zhǎng)狀態(tài)，生理活性較高。進(jìn)一步增強(qiáng)了離子對(duì)細(xì)胞的作用效果。經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)后誘變的正突變率明顯高于沒(méi)有前培養(yǎng)菌的正突變率；當(dāng)照射時(shí)間在90 s左右時(shí)，致死率在85%～95%的時(shí)候，正突變率最高，達(dá)到28%。因此確定誘變條件是，黑曲霉孢子經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)后，照射90 s左右，控制致死率在90%左右。

2.2葡萄糖氧化酶高產(chǎn)菌株的篩選

2.2.1初篩菌種選育是一項(xiàng)工作量巨大的工作，一種理性篩選模型能有效地減少工作量，提高選育效率。而在篩選高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的黑曲霉工作過(guò)程中，有效的平板篩選能大量減少后續(xù)工作。圖3-4為鄰聯(lián)茴香胺顯色平板改進(jìn)前后的顯色效果對(duì)比圖。

圖3　　改進(jìn)前鄰聯(lián)茴香胺顯色Fig.3　Colour reaction of the O-diani sidine befor improvement

圖4　改進(jìn)后鄰聯(lián)茴香胺顯色Fig.4　Colour reaction of the O-diani sidine after improvement

圖3為作者所在實(shí)驗(yàn)室較早的鄰聯(lián)茴香胺顯色平板，是將氮源以及碳酸鈣混合倒入一層平板。雖然顯色反應(yīng)很明顯，但是由于菌絲無(wú)規(guī)則蔓延和顏色的擴(kuò)散，使得顯色圈不規(guī)則且平板都有擴(kuò)散的褐色，難以區(qū)別產(chǎn)酶能力的差異。圖4為改進(jìn)后將篩選平板分為不含氮源的下層和僅有瓊脂的上層。所形成顯色圈規(guī)則，且平板背景沒(méi)有顏色擴(kuò)散。能夠更高效地篩選出產(chǎn)酶提高的菌株。因此應(yīng)用本篩選方法，初篩后共獲得48株差異較大的正突變菌株。

常用的產(chǎn)葡萄糖氧化酶篩選平板有Fiedure.K.J顯色法、甲基紅顯色以及鄰聯(lián)茴香胺顯色等［10］。Fiedure.K.J顯色法，即在培養(yǎng)平板中加入淀粉以及碘化鉀。當(dāng)微生物產(chǎn)生葡萄糖氧化酶與葡萄糖反應(yīng)時(shí)，會(huì)伴隨過(guò)氧化氫的產(chǎn)生。過(guò)氧化氫與碘化鉀作用形成碘單質(zhì)，并進(jìn)一步與淀粉反應(yīng)形成藍(lán)色圈。同樣的原理，與甲基紅反應(yīng)形成紅色圈，與鄰聯(lián)茴香胺反應(yīng)形成褐色圈。

由于顯色反應(yīng)都比較靈敏，因此菌株產(chǎn)酶與否很容易通過(guò)顯色觀察判斷。但當(dāng)菌株的產(chǎn)酶能力達(dá)到一定程度以后，這些顯色方法就難以區(qū)別菌株間產(chǎn)酶能力的提高與否。在碘化鉀平板顯色和甲基紅平板顯色過(guò)程中，篩選平板中容易形成很大的且形狀不規(guī)則的顯色圈，經(jīng)常顏色擴(kuò)散，覆蓋整個(gè)平板，導(dǎo)致難以區(qū)別篩選。本研究篩選平板為改進(jìn)后的顯色平板，下層為鄰聯(lián)茴香胺、辣根酶以及葡萄糖混合瓊脂平板；上層為碳酸鈣瓊脂平板。碳酸鈣瓊脂層的存在，使得孢子在萌發(fā)過(guò)程中吸收營(yíng)養(yǎng)成分受到限制。另一方面，在下層培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分缺少氮源，進(jìn)一步限制了孢子的生長(zhǎng)。涂布于表面的孢子更多的靠細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)以及隔層的葡萄糖生長(zhǎng)，在此過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖氧化酶通過(guò)瓊脂層滲透與下層顯色物質(zhì)反應(yīng)，以形成規(guī)則且區(qū)別度大的褐色圈。改進(jìn)后的篩選平板即有效的限制了菌絲的擴(kuò)大，又很好的區(qū)別不同產(chǎn)酶能力的菌株。再將顯色圈大的菌株，挑選接種于營(yíng)養(yǎng)豐富的平板繼續(xù)培養(yǎng)即可。

2.2.2復(fù)篩將初篩得到的48株正突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，48 h后依次測(cè)定每株的產(chǎn)酶能力，選出7株產(chǎn)酶能力提高大的菌株，分別命名為T1至T7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　　復(fù)篩突變菌株與原菌株產(chǎn)酶對(duì)比Fig.5　Enzyme production of the mutant strain and the parent strain

7株菌的產(chǎn)酶性能都有較大提高，其中菌株T6的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，達(dá)到85.3 U/mL，較對(duì)照菌株提高了87.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，常壓室溫等離子體誘變相對(duì)于操作過(guò)程繁雜、環(huán)境要求高的常規(guī)化學(xué)誘變和紫外誘變是一種簡(jiǎn)單、高效的誘變方法，能夠用于誘變篩選高葡萄糖氧化酶活力的黑曲霉菌株。

2.3突變株產(chǎn)酶性能研究

2.3.1胞外酶變化黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶是一種半分泌酶，且不同菌株的胞外酶所占比例并不相同。當(dāng)胞外酶比例大時(shí)更有利于酶的后期提取，故測(cè)定突變株胞外酶所占比例，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　突變菌株和原菌株不同培養(yǎng)時(shí)間下產(chǎn)胞外酶占總酶活比例Fig.6　Ratio of extracellular enzyme in total enzyme activity of the mutant and the parent strain at different culture time

由圖6可知，T6菌株與原菌株對(duì)比，總的酶活單位提高。而且在48 h培養(yǎng)總酶活達(dá)到最高時(shí)，胞外酶占總酶的比例也明顯高于原菌株。原菌株的胞外酶活比例達(dá)50%左右，而誘變菌株在48 h左右，胞外酶活比例達(dá)到76%，這將更便于酶的后期提取和純化。

2.3.2關(guān)鍵產(chǎn)酶激活劑效應(yīng)碳酸鈣對(duì)葡萄糖氧化酶的分泌有著重要意義。一方面是菌體生長(zhǎng)過(guò)程的載體，另一方面又可以中和反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖酸，從而可調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，因此是一種產(chǎn)酶促進(jìn)劑。同樣吐溫-80作為一種有效的表面活性劑，加入發(fā)酵液大大提高了細(xì)胞膜的通透性，有利于酶的釋放，兩者對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶都有重要意義。因此以不同的添加量加入發(fā)酵，以找到最合適的碳酸鈣和吐溫-80的添加量，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

圖7為誘變前后菌株不同碳酸鈣添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的產(chǎn)酶活力。經(jīng)過(guò)誘變菌株與原菌株對(duì)比，最適碳酸鈣的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來(lái)的3.5%提高到5.0%，酶活達(dá)到115.7 U/mL。如圖8所示，在最適碳酸鈣添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的基礎(chǔ)上，最適的吐溫-80添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來(lái)的2.0%變?yōu)?.0%，此時(shí)酶活達(dá)到125.6 U/mL。

圖7　　突變株和原菌株不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈣添加量下產(chǎn)酶對(duì)比Fig.7　Enzyme production of the mutant and the parent strain　atdifferent　concentrations　ofcalcium carbonate

圖8　突變菌株和原菌株不同吐溫-80的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)下產(chǎn)酶對(duì)比Fig.8　Enzyme production of the mutant and the parent strain at different concentrations of Tween 80

2.4產(chǎn)酶穩(wěn)定性研究

為了檢測(cè)變異菌株T-6產(chǎn)酶的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)6代，各代以優(yōu)化后培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，于搖床上30℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h。測(cè)定各代產(chǎn)酶活量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。

從圖9可以看出，傳代6代中產(chǎn)酶活力雖然有所波動(dòng)，但都在120 U/mL左右，第四代和第六代略微有點(diǎn)降低?？傮w誘變菌株T-6具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖9　　不同傳代數(shù)下產(chǎn)酶能力差異Fig.9　Enzyme production of the mutant during generations

3結(jié)語(yǔ)

作者構(gòu)建了黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的ARTP快速誘變和有效篩選方法，并對(duì)影響產(chǎn)酶發(fā)酵關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化。主要結(jié)論如下：通過(guò)黑曲霉前培養(yǎng)，有效地提高了相同處理?xiàng)l件下的正突變發(fā)生率。最高的正突變率能達(dá)到28%。通過(guò)改良后的鄰聯(lián)茴香胺顯色平板，使得平板能形成均勻?qū)Ρ刃詮?qiáng)的顯色圈，因此該方法是一種篩選產(chǎn)葡萄糖氧化酶高活力菌有效方法，很大程度上提高了篩選效率。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，誘變菌株最大產(chǎn)酶活力達(dá)到125.6 U/mL，較出發(fā)菌株提高了175.4%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。相對(duì)于常規(guī)的誘變處理，ARTP誘變技術(shù)是一種高效、安全的誘變方式，實(shí)踐證明能有效作用于黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株，獲得高產(chǎn)突變株。但與2014年報(bào)道朱運(yùn)平等人［11］對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化后最高葡萄糖氧化酶產(chǎn)量達(dá)到363.04 U/mL還有一定的差距，通過(guò)選育優(yōu)良菌株以及優(yōu)化培養(yǎng)條件來(lái)一步提高產(chǎn)酶能力是今后研究的方向。同時(shí)，我國(guó)工業(yè)生產(chǎn)葡萄糖氧化酶活力普遍偏低、純度不高，長(zhǎng)期依賴進(jìn)口，如何更經(jīng)濟(jì)有效的制取高純度的葡萄糖氧化酶也有待解決。

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Screening Mutation of High Glucose Oxidase Activity Using Atmospheric and Room Temperature Plasmas

XIAO Chengjian1，CHENG Nan1，JIANG Wei2，LUO Wei1，WANG Qiang1，LI Hanguang1，YU Xiaobin1*
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Pre-cultured Aspergillus niger was treated using ARTP for the development of high glucose oxidase strain.Improved O-dianisidine color-developing circle method was used for preliminary screening and the mutant strains were re-screened by liquid state fermentation in flasks. Mutant strain T-6's enzyme activity increased from 45.6 U/mL to 85.3 U/mL and was selected for its high glucose oxidase-producing ability.Glucose oxidase activity reached 125.6 U/mL which was 175.4%higher than that of the original strain when the critical fermentation conditions，calcium carbonate and Tween-80 were optimized.The genetic expression of glucose oxidase was showed to be stable when the strain was cultured for 6 generations.

ARTP，O-dianisidine color-developing circle，glucose oxidase，mutagenesis，Aspergillus niger

Q 814

A

1673—1689（2016）05—0525—06

2014-10-23

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130130）。
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余曉斌（1965—），男，安徽蕪湖人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵健康食品和酶技術(shù)方面的研究。E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn