盧桂義，鄔敏辰，黃衛(wèi)寧*，張　巒，李　寧，Courtin Christopher

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122；3.南京百合貝可生物科技有限公司，江蘇南京210000）

嗜熱裂孢菌木聚糖酶在畢赤酵母中的表達及酶學性質(zhì)

盧桂義1，鄔敏辰2，黃衛(wèi)寧1*，張巒3，李寧3，Courtin Christopher3

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122；3.南京百合貝可生物科技有限公司，江蘇南京210000）

將優(yōu)化后的來自嗜熱裂孢菌的木聚糖酶基因在畢赤酵母中進行異源表達并分析了其表達產(chǎn)物的酶學性質(zhì)。對來源于嗜熱裂孢菌的木聚糖酶基因催化域進行密碼子優(yōu)化，人工合成優(yōu)化后的木聚糖酶成熟肽基因xyl11M，構建重組表達質(zhì)粒pPIC9K-xyl11M，將其經(jīng)SalⅠ線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)G418篩選得到重組工程菌GS115/xyl11M，甲醇誘導表達重組蛋白。表達的重組蛋白reXyl11M經(jīng)SDS-PAGE分析，其相對分子質(zhì)量約34 000，酶活性可達到105.3 U/mL，最適反應溫度為70℃，并在30～75℃溫度內(nèi)較穩(wěn)定；最適反應pH為6.0，在pH 6.5～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定；Co2+、Ba2+、Cu2+、Li+對酶活性有強烈的激活作用，F(xiàn)e3+有明顯的抑制作用，其它金屬離子及EDTA對reXyl11M酶活性影響不大。結(jié)果表明xyl11M成功在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)表達，且reXyl11M的酶學特性優(yōu)良。

耐熱木聚糖酶；畢赤酵母；合成基因；基因表達；酶學性質(zhì)

利用生物技術提高面包品質(zhì)及延長貨架期有著重要的意義。大量研究表明，添加適量木聚糖酶能夠提高面團的操作性能及改善產(chǎn)品的營養(yǎng)與品質(zhì)，如提高面團的彈性、機械操作性及穩(wěn)定性，增加面包的比容，改善面包瓤的組織結(jié)構，降低面包的硬度，延長面包的貨架期等［1-3］。

木聚糖酶 （Xylanase）是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括三類：1）β-1，4-D-內(nèi)切木聚糖酶（EC 3.2.1.8），從木聚糖主鏈的內(nèi)部切割β-1，4-糖苷鍵，使木聚糖溶液的粘度迅速降低；2）β-1，4-D-外切木聚糖酶（EC 3.2.1.92），以單個木糖為切割單位作用于木聚糖的非還原性末端，使反應體系的還原性不斷增加；3）β-木糖苷酶（EC 3.2.1.37），切割低聚木糖和木二糖，有助于木聚糖徹底降解為木糖。通過酶分子一級結(jié)構的序列比對和疏水簇分析，大多數(shù)木聚糖酶屬于糖苷水解酶10和11家族［4］。

目前，已經(jīng)有來源于黑曲霉［5］、枯草芽孢桿菌［6］、綿毛嗜熱絲孢菌［7］等微生物的木聚糖酶應用于面包中，但其均屬于中溫木聚糖酶，在面包烘焙階段便迅速失活。xyl11（GenBank登錄號：AY795559）是從Thermobifide fusca NTU22基因文庫中篩選出的表達木聚糖酶活性最高的基因，表達的木聚糖酶在70℃保溫3 h，殘余酶活仍保留70%，表觀相對分子質(zhì)量為36 000。但該基因編碼區(qū)由1 014個堿基對組成，編碼338個氨基酸［8］，包含一個不具木聚糖酶活性的纖維素結(jié)合結(jié)構域，取xyl11的催化域基因（586 bp）在Pichia pastoris GS115中進行表達。由于它來源于細菌，其密碼子偏好性與畢赤酵母有較大差異，于是對該耐熱基因中的稀有密碼子進行優(yōu)化，有效提高外源蛋白質(zhì)的表達量［9］，并且該基因命名為xyl11M。人工合成xyl11M后克隆至pMD19-T質(zhì)粒，構建重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-xyl11M和重組表達質(zhì)粒pPIC9K-xyl11M，實現(xiàn)重組木聚糖酶reXyl11M在P.pastoris GS115中的表達，并分析reXyl11M的酶學性質(zhì)。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

E.coli JM 109、E.coli DH5α為克隆宿主菌，P.Pastoris GS115為表達宿主菌，pPIC9K為真核表達質(zhì)粒：均由江南大學無錫醫(yī)學院分子生物學研究室保存。

1.2工具酶和主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、250 bp DNA Ladder Marker和低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker：大連TaKaRa公司；YNB、生物素、酵母提取物、蛋白胨、G418、Tryptone：上海Sangon公司；標準木糖、樺木木聚糖：Sigma公司；SnCl2、CaCl2、FeCl3、FeCl2、CoCl2、LiCl2、ZnCl2、NaCl、MgCl2、MnCl2、EDTA：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基的配制參考Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.4重組克隆質(zhì)粒的構建

對照畢赤酵母密碼子偏好性表xyl11中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并在基因兩端分別加入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點，該基因命名為xyl11M，合成后克隆至pMD19-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM 109細胞，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定篩選陽性克隆，送上海Sangon公司測序，鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒命名為pMD19-T-xyl11M。

1.5重組表達質(zhì)粒的構建

將測序驗證正確的 pMD19-T-xyl11M和pPIC9K質(zhì)粒同時用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收目的基因xyl11M和pPIC9K質(zhì)粒片段，具體操作參見EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit說明書。用T4 DNA連接酶16℃連接4 h，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)通用引物（5'-AOX和3'-AOX）PCR篩選鑒定后，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-xyl11M。

1.6重組P.pastoris GS115的篩選及誘導表達

pPIC9K和重組表達質(zhì)粒pPIC9K-xyl11M經(jīng)SalⅠ酶切線性化后，用電穿孔法導入GS115中，涂布MD平板上篩選重組子；將MD平板上生長良好的菌落用牙簽點種至含0.5、1.0、2.0 mg/mL G418的YPD平板上，篩選抗2.0 mg/mL G418的畢赤酵母重組子，分別命名為GS115/9K和GS115/xyl11M；參照《分子克隆實驗指南》的方法提取重組GS115基因組DNA，利用通用引物5'-AOX和3'-AOX PCR鑒定目的基因是否整合GS115基因組內(nèi)。GS115/9K和GS115/xyl11M的常規(guī)誘導表達參照 Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊。

1.7重組木聚糖酶的活性測定與SDS-PAGE分析

木聚糖酶酶活測定采用改良的DNS試劑法［10］：移取2.4 mL 0.5 g/dL樺木木聚糖溶液 （0.2 mol/L，pH 4.6磷酸鹽緩沖液配制）于25 mL具塞管中，40℃保溫10 min，加入0.1 mL適當稀釋的酶液，準確反應10 min后煮沸7 min終止反應，用可見分光光度計在540 nm下測定其OD值。酶活定義為：在此測定的條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行分析，確定其表觀相對分子質(zhì)量。用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/ protparam）預測重組蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量。用在線軟件 NetNGlyc1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlyc/）和NetOGlyc4.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/NetOGlyc/）預測N-和O-糖基化位點。

1.8reXyl11M酶學性質(zhì)的測定

1.8.1reXyl11M的最適溫度及溫度穩(wěn)定性按照1.7的測定方法，在30～100℃下每隔5℃測定reXyl11M的酶活，以酶活性最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫1 h后，測定殘余酶活性，以未經(jīng)保溫酶液的酶活性為100%，作溫度-相對酶活性曲線。當殘余酶活性達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。

1.8.2reXyl11M的最適pH及pH穩(wěn)定性按照1.7的方法在最適溫度下分別測定木聚糖酶在不同pH值（4.0～9.0）下的酶活性。以酶活性最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40℃保溫1 h，測定殘余酶活性，以酶活性最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。反應所用的緩沖液為0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 （pH 4.0～8.0）和0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化納緩沖液（pH 8.0～9.0）。

1.8.3金屬離子和EDTA對reXyl11M酶活性的影響向重組木聚糖酶酶液中分別加入SnCl2、CaCl2、FeCl3、FeCl2、CoCl2、LiCl2、ZnCl2、NaCl、MgCl2、MnCl2、EDTA等至終濃度為2 mmol/L，40℃保溫 1 h，按1.7的方法在最適溫度和pH值下測定殘余酶活性，以不加金屬離子和EDTA時所測的酶活性定義為100%。

2結(jié)果與討論

2.1pPIC9K-xyl11M的構建

質(zhì)粒pMD19-T-xyl11M的雙酶切 （EcoRⅠ/NotⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約600 bp和3 000 bp的特異性條帶，分別為目的基因xyl11M和線性化的pMD19-T，見圖1。將xyl11M與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K割膠回收并連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)通用引物鑒定后，送上海Sangon公司測序，結(jié)果顯示測序結(jié)果與預期相符。測序基因長586 bp，與xyl11M同源性達到100%。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-xyl11M。

2.2重組畢赤酵母GS115的構建及鑒定

提取重組畢氏酵母GS115/xyl11M基因組進行PCR擴增鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖2。GS115/xyl11M的PCR產(chǎn)物在約1 100 bp和2 100 bp處可見兩條清晰的條帶 （圖2泳道2-5），2 100 bp的產(chǎn)物為GS115本身的AOX1基因，1 100 bp的產(chǎn)物包括約為600 bp的目的基因（586 bp）和500 bp pPIC9K質(zhì)粒上的5'-AOX和3'-AOX引物序列之間的片段，而對照組GS115/9K PCR產(chǎn)物的兩條條帶大小分別約為 500 bp和2 100 bp（圖2泳道1），表明reXyl11M已整合入畢赤酵母GS115基因組內(nèi)。從PCR驗證正確的重組畢赤酵母中隨機挑取 4株重組畢赤酵母GS115/ xyl11M-1、-2、-3、-4和1株畢赤酵母GS115進行誘導表達。

圖1　　質(zhì)粒pMD19-T-xyl11M的雙酶切電泳圖Fig.1　Double digestionof pMD19-T-xyl11M

圖2　畢赤酵母重組子基因組PCR驗證Fig.2　Verification of P.pastoris transformants by PCR

2.3重組蛋白的表達與鑒定

重組畢赤酵母經(jīng)誘導表達后，8 000 r/min離心10 min后收集發(fā)酵上清液，取上清液按照1.7的方法測定木聚糖酶活性。結(jié)果表明，GS115/xyl11M發(fā)酵上清液木聚糖酶酶活性最高可達到105.3 U/mL，而GS115/9K并未檢測到木聚糖酶活性。SDS-PAGE結(jié)果見圖3。GS115/xyl11M的表達產(chǎn)物在相對分子質(zhì)量34 000處有一條明顯的蛋白質(zhì)條帶 （圖3泳道1-2），而對照GS115/9K在該處無條帶 （圖3泳道3）。reXyl11M相對分子質(zhì)量比前期預測的理論相對分子質(zhì)量大 （24 845），分析其原因可能是由于reXyl11M氨基酸序列在酵母GS115表達過程中發(fā)生了糖基化修飾［11］。用在線軟件NetNGlyc1.0（http：// www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和 NetOGlyc4.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分別對N-糖基化位點及O-糖基化位點進行預測，結(jié)果表明xyl11M氨基酸序列中含有3個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點。

圖3reXyl11M的SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of reXyl11M

2.4reXyl11M的酶學性質(zhì)分析

2.4.1酶的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性在50～80℃范圍內(nèi)，reXyl11M酶活性較高，相對酶活性可達95%以上，其中最適反應溫度為70℃；reXyl11M在50～75℃范圍內(nèi)殘余酶活性在85%以上。在75℃保存1 h后，酶活性僅損失4.62%。說明該酶的熱穩(wěn)定性好，在高溫下可保持穩(wěn)定，見圖4。

圖4　溫度對reXyl11M酶活性的影響Fig.4　Effect of temperature on the activity of the reXyl11M

2.4.2酶的最適pH及pH穩(wěn)定性在不同pH值下進行酶活性檢測，結(jié)果見圖5。該酶的最適反應pH為6.0，pH在5.5～6.5范圍內(nèi)相對酶活性均在99%以上，在當pH＞7.5時，酶活性下降較快，但相對酶活性仍在50%以上；該重組酶在pH 6.5～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，當pH值低于6.5或高于7.5時，該酶的穩(wěn)定性較差，殘余酶活性在55%～83%之間?？梢娫撁笧橹行阅揪厶敲?，適用于烘焙產(chǎn)品。

圖5　pH對reXyl11M酶活性的影響Fig.5　Effect of pH on the activity of the reXyl11M

2.4.3金屬離子對酶活性的影響Fe3+對reXyl11M酶活性有明顯的抑制作用，使reXyl11M酶活性降低23.7%，Co2+、Ba2+、Cu2+、Li+對酶有強烈的激活作用，分別使reXyl11M酶活性提高54.1%，47.7%，40.5%，36.9%，可能是Co2+、Ba2+、Cu2+、Li+對酶與底物的結(jié)合和解離狀態(tài)有影響，具體機制還有待進一步的研究［17］；EDTA和其它離子對reXyl11M酶活性影響不大，見圖6。

圖6　　金屬離子和EDTA對reXyl11M酶活性的影響Fig.6　Effects of various metal ions and EDTA on the activity of the reXyl11M

3結(jié)語

耐熱木聚糖酶有著重要的工業(yè)應用價值，通過基因工程技術實現(xiàn)耐熱木聚糖酶的異源高效表達是降低其工業(yè)應用成本、適應工業(yè)應用條件的有效手段。畢赤酵母是一個優(yōu)良的表達體系，具有操作簡便、可高水平地胞外表達、可進行糖基化、二硫鍵形成等真核翻譯后修飾等優(yōu)點［13］。目前，已經(jīng)有耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了分泌表達。

作者成功實現(xiàn)了11家族耐熱木聚糖酶密碼子優(yōu)化基因xyl11M在P.pastoris GS115中的分泌表達。以樺木木聚糖為底物，reXyl11M酶液的酶活性可達到105.3 U/mL，明顯高于其它在畢赤酵母表達的耐熱木聚糖酶，如張慧敏等［12］克隆了來自于細菌的耐熱木聚糖酶基因Syxyn11，并在P.pastoris GS115中進行了表達，其最高酶活性為 17.74 U/mL；Ghaffar等克隆了來自于Chaetomium thermophilum的耐熱木聚糖酶基因xyn11A，在P.pastoris GS115中表達最高酶活性為15.6 U/mL［14］；Berrin等［15］將黑曲霉的xynA基因在巴斯德畢赤酵母中表達，分泌量僅為15.6 U/mL；楊夢華等克隆了海棲熱袍MSB8菌的XylB基因在P.pastoris中表達，培養(yǎng)液上清液木聚糖酶比活為50 U/mL［16］。經(jīng)SDS-PAGE分析reXyl11M的表觀相對分子質(zhì)量約為34 000。初步的酶學性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應溫度為70℃，并在30～75℃較穩(wěn)定；最適反應pH為6.0，在pH 6.5～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定；Co2+、Ba2+、Cu2+、Li+對酶活性有強烈的激活作用；Fe3+有明顯的抑制作用，其它金屬離子及EDTA對reXyl11M酶活性影響不大。這些優(yōu)良的酶學特性表明了該酶在烘焙體系以及其他領域具有廣泛的應用潛力。

［1］Santala O，Lehtinen P，Nordlund E，et al.Impact of water content on the solubilisation of arabinoxylan during xylanase treatment of wheat bran［J］. Journal of Cereal Science，2011，54（2）：187-194.

［2］Caballero P A，Gmez M，Rosell C M.Improvement of dough rheology，bread quality and bread shelflife by enzymes combination ［J］. Journal of Food Engineering，2007，81（1）：42-53.

［3］Jia C L，Huang W N，Mohamed A S，et al.Dough rheological，mixolab mixing，and nutritional characteristics of almond cookies with and without xylanase［J］.Journal of Food Engineering，2011（105）：227-232.

［4］Polizeli M L T M，Rizzatti A C S，Monti R，et a1.Xylanases from fungi：properties and industrial applications［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2005（67）：577-591.

［5］Courtin C M，Delcour.Arabinoxylans and endoxylanases in wheat flour bread-making［J］.Cereal Science，2002（35）：225-243.

［6］Courtin C M，Gelders G G，Delcour J A.Use of two endoxylanases with different substrate selectivity for understanding arabinoxylan functionality in wheat flour bread making［J］.Cereal Chemistry，2001（5）：564-571.

［7］Jiang Z Q，Yang S Q，Tan S S，et al.Characterization of xylanase from the newly isolated thermophilic Thermomyces lanuginosus CAU44 and its application in bread making［J］.Letters in Applied Microbiology，2005（41）：69-7.

［8］Cheng Y F，Yang C F，Liu W H.Cloning and expression of thermobifida xylanase gene in the methylotrophic yeast Pichia pastoris ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2005（37）：541-546.

［9］Jin G Z，Duan Z Y，Zhang L F，et al.Expression of the fusion protein human serumalbum/mutant human interleukin 2C125A in Pichia pastoris［J］. Journal of Food Science and Biotechnology，2010（29）：595-601.

［10］Zhou C Y，Bai J Y，Deng S S，et al.Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli［J］. Bioresource Technology，2008（99）：831-838.

［11］Zachary J M，Eugenia M，Wei L，et al.Crystal structure of human inerferon-λ1 in complex with its high-affinity receptor interferon-λR1［J］. Journal of Molecular Biology，2010，404（4）：650-664.

［12］張慧敏，李劍芳，鄔敏辰，等.耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質(zhì)［J］.食品與生物技術學報，2013，32（2）：124-128. ZHANG Huiming，LI Jianfang，WU Mingcheng，et al.Expression of a thermostable xylanase gene in Pichia pastoris and its enzymatic characterization［J］. Journal of Food Science and Biotechnology，2013（32）：124-128.（in Chinese）

［13］諶斌，唐雪明，沈微，等.粗糙脈孢菌漆酶基因的克隆及在畢赤酵母中的初步表達［J］.食品與生物技術學報，2012，23（4）：43-47. CHEN Bin，TANG Xueming，SHEN Wei，et al.Cloning of a laccase gene from Neurospora crassa and it's preliminary expression in Pichia pastoris［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2012，23（4）：43-47.（in Chinese）

［14］Ghaffar A，Khan S A，Mukhtar Z，et al.Heterologous expression of a gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in Pichia pastoris GS115［J］. Molecular Biology Reports，2011（38）：3227-3233.

［15］Berrin J G，Williamson G，Puigserver A，et al.High-level production of recombinant fungal endo-beta-1，4-xylanase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.Protein Expression and Purification，2000（1）：179-187.

［16］楊夢華，李穎，關國華，等.極端耐熱木聚糖酶基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的高效表達［J］.微生物學報，2005（2）：236-240. YANG Menghua，LI Ying，GUAN Guohua，et al.Efficient expression of therostable xylanase gene in E.coli and in Pichia pastoris［J］.Acta Microbiologica Sinica，2005（2）：236-240.（in Chinese）

［17］鄒永龍，桑月嬋，彭建新，等.β-l，4-內(nèi)切木聚糖酶的分離純化及其性質(zhì)［J］.植物學報，1999，41（11）：1212-1216. ZOU Yonglong，SANG Yuechan，PENG Jianxin，et al.Purification and properties of β-1，4-endoxylanase［J］.Acta Botanica Sinica，1999（41）：1212-1216.（in Chinese）

Expression of A Xylanase from Thermobifide fusca in Pichia pastoris And Its Characterization Analysis

LU Guiyi1，WU Minchen2，HUANG Weining1*，ZHANG Luan2，LI Ning3，Courtin Christopher3
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Nanjing BaihoBake Biotechnology International，Inc.Nanjing 210000，China）

A codon-optimized mature peptide gene encoding a thermostable xylanase from Thermobifidefusca has been cloned into the expression plasmid pPIC9K and named as pPIC9K-xyl11M.The pPIC9K-xyl11Mwas linearized with SalⅠand integrated into the genome of Pichia pastoris GS115 by electroporation.The recombinant P.pastoris GS115/xyl11Mwas screened by G418 and then was induced with methanol to express reXyl11M.The reXyl11Mactivity expressed by P.pastoris transformant reached 105.3 U/mL.The molecular weight of reXyl11Mwas estimated to be 34 000 by SDS-PAGE.The reXyl11Mdisplayed the highest activity at 70℃and pH 6.0.It wasstable at a temperature range of 30～75℃，and at a pH range of 6.5～7.5.Co2+，Ba2+，Cu2+，Li+had a strong enzyme activation effect，F(xiàn)e3+had obvious inhibitory effect，its activity was not significantly affected by other metal ions and EDTA.This revealed that reXyl11Mwas successfully expressed in P.pastoris and had good enzymatic characterizations.

thermostable xylanase，Pichiapastoris，synthetic gene，gene expression，enzymatic characterization

Q 78

A

1673—1689（2016）05—0492—06

2014-10-12

國家863計劃項目（2012AA022207C）；江蘇省產(chǎn)學研聯(lián)合創(chuàng)新基金——前瞻性聯(lián)合研究項目（BY2014023-16）；國家自然科學基金項目 （31071595，20576046）；張家港市科技支撐計劃項目 （ZKN1301）；江蘇省科技支撐計劃項目 （BE2012310，BE2011380）；蘇州市科技支撐計劃項目（SNG201401）。
*

黃衛(wèi)寧（1963—），男，江蘇南通人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事烘焙科學與發(fā)酵技術、谷物食品化學方面的研究。E-mail：wnhuang@jiangnan.edu.cn