王　旭，孫曉紅，潘迎捷，趙　勇*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

單增李斯特菌WaX12及其sigB缺失突變株在不同pH下生長動力學(xué)的比較

王旭1，2，3，孫曉紅1，2，3，潘迎捷1，2，3，趙勇1，2，3*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

為了探究σB因子對單增李斯特菌（LM）的生長影響，比較了LM-WaX12及其sigma B缺失突變株在不同pH值下生長動力學(xué)的差異。作者運(yùn)用重疊延伸PCR（SOE-PCR）和同源重組的方法構(gòu)建缺失SigB基因的LM突變株WaX12-ΔsigB；利用sigB外圍引物擴(kuò)增其兩側(cè)片段鑒定突變株，并且通過修正的Logistic模型擬合兩個(gè)菌株在不同酸堿度下（pH 5～9）的生長曲線，分析各生長參數(shù)之間的差異性。結(jié)果表明，單增李斯特菌sigB缺失突變株構(gòu)建成功；WaX12-ΔsigB 和WaX12在pH 5的環(huán)境下最大比生長速率μmax、延滯期λ與最大菌濃MPD-OD均存在顯著性差異（P＜0.05），而在中性和堿性環(huán)境下二者無明顯差異。

單增李斯特菌；σB因子；酸性環(huán)境；生長動力學(xué)參數(shù)

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患病食源性致病菌［1］，在食品安全中處于 II型，屬于嚴(yán)重危害級別，能引起人和動物的腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，是WHO公布的四大食源性致病菌之一［2］，為典型的革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛存在于土壤、污水、動物性食品及飼草等環(huán)境中，主要通過消化道引起人和動物感染［3］。單增李斯特菌之所以能適應(yīng)多種的生存環(huán)境，與其內(nèi)部環(huán)境調(diào)節(jié)因子σ家族有密切關(guān)系［4］。

σ因子是sigma基因的編碼產(chǎn)物，σ因子可結(jié)合在RNA核心酶上形成RNA聚合酶全酶，是RNA聚合酶的一個(gè)亞基。σ家族通過感受外界環(huán)境對自身控制的基因起到調(diào)節(jié)作用，主要是通過調(diào)控各基因的啟動子來完成［5］，其中σ家族中的σB因子是最重要的環(huán)境調(diào)控因子：σB由sigB基因編碼，可使單增李斯特菌在多種逆境下生存，并且較快的適應(yīng)外界環(huán)境［6］。根據(jù)不同的血清型，單增李斯特菌能在1～50℃，10%的鹽溶液，pH值4.4～9.6［7］的范圍內(nèi)都可以生長，而且在一定的抗生素、光照、重金屬等逆境中都可以生存［8-9］。Becker L等人驗(yàn)證了σB在穩(wěn)定期對單增李斯特菌有明顯的調(diào)控作用［10］，而利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)對σB操縱子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有105個(gè)σB正調(diào)控的基因和111個(gè)負(fù)調(diào)控的基因［11］，而其中的有些基因分別調(diào)節(jié)單增李斯特菌在不同環(huán)境下的生長以及衰亡。

因此，作者利用本實(shí)驗(yàn)室從豬肉中分離的單增李斯特菌LM-WaX12菌株構(gòu)建其SigB基因缺失菌株WaX12-ΔsigB，利用修正的Logistic模型擬合原始菌株與突變株的生長情況，探究σB因子在不同pH值下對單增李斯特菌的生長影響，為σB因子對單增李斯特菌在酸性環(huán)境中的調(diào)控作用奠定了分子基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、儀器與試劑

WaX12：上海市蘆潮港菜市場購買的生豬肉中分離的野生致病菌，血清型為4b，經(jīng)過形態(tài)學(xué)分析、生化特性以及分子生物學(xué)鑒定，由上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室保藏；Premix Taq酶、pMD-18T載體、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTMRT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒：購自Takara；熒光定量SYBR Green Master：購自羅氏生物；腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）：購自北京陸橋；穿梭質(zhì)粒pKSV7：由美國康奈爾大學(xué)Martin Wiedmann教授和浙江大學(xué)方維煥教授饋贈；Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀：購自芬蘭 Oy Growth Curves Ab公司；其他試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI中已經(jīng)公布的 L.monocytogenes ATCC 19117（NC_018584）全基因組序列，設(shè)計(jì)sigB基因的上游和下游序列的特異性引物，見表1，所有引物均由上海生工合成。

表1　　引物名稱和序列Table 1　Primers and sequences

1.3WaX12-ΔsigB缺失菌株的構(gòu)建

1.3.1SigmaB基因的缺失提取LM-WaX12野生株的基因組，用psigB-1F和psigB-2R擴(kuò)增包含了sigB基因ORF的整個(gè)上下游臂的片段 （sigB1F-2R）；再用sigB-1F、sigB-1R和sigB-2F、sigB-2R分別擴(kuò)增上下游同源臂sigB1F-1R和 sigB2F-2R（sigB1F-1R長440 bp，sigB2F-2R長427 bp）；然后以sigB1F-1R和sigB2F-2R為模版，PrimeSTAR? HS（Premix）高保真酶對上下游臂再次擴(kuò)增。利用SOE-PCR技術(shù)重疊融合上下游臂，擴(kuò)增無sigB的片段 ΔsigB1F-2R，見圖 1。隨后構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-ΔsigB1F-2R，經(jīng)過酶切驗(yàn)證結(jié)果正確。

圖1　單增李斯特菌sigB基因ORF的去除Fig.1　Cleavage of sigB gene open reading frame in L.monocytogenes

1.3.2穿梭載體的構(gòu)建以及電轉(zhuǎn)化pMD18TΔsigB1F-2R和pKSV7經(jīng)過EcoRI、SalI雙酶切，二者用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKSV7-ΔsigB1F-2R。用HEPES緩沖液配置單增李斯特菌的感受態(tài)細(xì)胞，在其中加入重組穿梭質(zhì)粒，電擊后涂布在BHI瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)。挑取單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定后得到帶有重組質(zhì)粒的陽性菌。

1.3.3WaX12-△sigB缺失株的篩選與鑒定將帶有重組質(zhì)粒的陽性菌接種于含Cm（10 μg/mL）的液體BHI中，41℃?zhèn)鞔?次，涂布于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)出單菌落后挑取至30℃培養(yǎng)10 h，涂布于BHI+ Cm上，挑取單菌落分別接種于BHI和BHI+Cm固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。為了去除穿梭質(zhì)粒的干擾，以 sigB基因的外圍序列設(shè)計(jì)引物 psigB-knockCHKf，psigB-knockCHKR，挑取可疑的單菌落進(jìn)行菌液 PCR驗(yàn)證，獲得缺失sigB的突變株WaX12-ΔsigB。

1.4WaX12和WaX12-ΔsigB不同pH值下生長情況將WaX12和WaX12-ΔsigB挑取單菌落至5 mL BHI液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h至OD600約0.6（9lgCFU/mL），菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至104CFU/mL。在全自動微生物生長曲線分析儀配套的100微孔板中進(jìn)行梯度稀釋，分別吸取20 μL接種至180 μL不同濃度的BHI（用HCl和NaOH分別調(diào)至pH 4，pH 5，pH 6，pH 7，pH 8和pH 9）中，保證每孔中的菌落數(shù)為103CFU/mL。用將全自動微生物生長曲線分析儀設(shè)置為每30分鐘讀取OD600值一次，測定37℃下兩株菌的生長曲線，每個(gè)菌株做3個(gè)孔平行。

1.5生物動力學(xué)參數(shù)的計(jì)算方法

應(yīng)用微生物模型修正Logistic方程［12］擬合37℃下的生長曲線，并且計(jì)算出兩株菌在不同pH值下的λ（λ為單增李斯特菌菌液的 OD600）達(dá)到Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀可檢測水平（107CFU/mL）時(shí)的時(shí)間（h）；μmax為單增李斯特菌最大比生長速率（OD/h）；MPD-OD為單增李斯特菌達(dá)到最大菌液濃度時(shí)候的OD600值。

修正Logistic方程：lgNt=A+C/（1+exp（-B（t-M）））

其中l(wèi)ogNt是t時(shí)間（h）時(shí)的菌數(shù)OD值，A是初始菌數(shù)OD值，C是初始菌數(shù)和最大菌數(shù)之間OD值，M是達(dá)到相對最大生長速率的時(shí)間 （h），B是最大生長速率μmax，把修正 Logistic方程的A、C、B和M參數(shù)賦予微生物學(xué)意義，即λ為M-（2/B），MPDOD（最大菌濃）為A+C。

1.6數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，采用SAS 8.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，運(yùn)用LSD法（P＜0.5）比較生長動力學(xué)參數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1SigmaB突變株的構(gòu)建

2.1.1sigB-1F-2R全長的擴(kuò)增以野生菌株WaX12的基因組為模版，以psigB-1F和psigB-2R為引物擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的1 647 bp的片段 （sigB基因上游臂440 bp，sigB基因下游臂427 bp和 sigB基因 780 bp），連接 pMD-18T，構(gòu)建pMD18T-sigB-1F-2R，酶切驗(yàn)證見圖2。結(jié)果表明含有sigB開放閱讀框和上下游臂的這段DNA序列正確插入到pMD-18T中，表明pMD18T-sigB-1F-2R載體構(gòu)建成功。

2.1.2pKSV7-△sigB穿梭載體的構(gòu)建將sigB基因上游臂sigB-1F-1R（440 bp）和下游臂sigB-2F-2R片段（427 bp）分別連接 pMD-18T，獲得pMD18T-sigB-1F-1R和pMD18T-sigB-2F-2R載體；再以兩個(gè)載體為模版，用高保真酶分別擴(kuò)增sigB-1F-1R和sigB-2F-2R片段。將兩個(gè)片段經(jīng)過重疊PCR得到缺失sigB的片段ΔsigB-1F-2R，見圖3，結(jié)果大小與預(yù)測相符，為867 bp。

將ΔsigB-1F-2R與pKSV7連接，構(gòu)建穿梭載體pKSV7-ΔsigB-1F-2R，酶切驗(yàn)證見圖4。表明含有sigB上下游臂的DNA序列正確插入到穿梭載體pKSV7，pKSV7-ΔsigB構(gòu)建成功，見圖5。

圖2pMD18T-sigB-1F-2R的酶切驗(yàn)證Fig.2　pMD18T-sigB-1F-2Rdigested by restriction endonuclease

圖3　　高保真酶擴(kuò)增ΔsigB-1F-2R片段Fig.3　Amplification of ΔsigB-1F-2R

圖4pKSV7-ΔsigB的酶切驗(yàn)證Fig.4　pKSV7-ΔsigB digested by restriction endonuclease

圖5　重組菌的突變株鑒定Fig.5　Identification of recombinantmutation

2.1.3SigB缺失突變株的篩選與鑒定挑取電轉(zhuǎn)化的單轉(zhuǎn)化子并且過夜培養(yǎng)，用psigB-1F和psigB-2R為引物進(jìn)行菌液PCR鑒定。挑取以上陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行同源重組，篩選缺失菌株，見圖6。提取疑似缺失單菌落 （在BHI+Cm上不生長但在BHI上生長，圖中紅框標(biāo)出）的基因組DNA。以sigB基因的外圍引物psigB-knockCHKf，psigB-knockCHKR為引物鑒定，篩選出缺失菌株命名為WaX12-ΔsigB?；蚪MPCR結(jié)果與預(yù)期值相符，用WaX12基因組擴(kuò)增的結(jié)果為1 748 bp，而以缺失株WaX12-ΔsigB基因組擴(kuò)增的結(jié)果為968 bp，鑒定了陽性菌為穩(wěn)定傳代，即同源重組成功，獲得了WaX12-ΔsigB基因敲除突變株。

圖6　疑似陽性sigB缺失突變株的篩選Fig.6　Screen of suspected sigB gene-knock mutant

2.2WaX12和WaX12-ΔsigB生長動力學(xué)比較

通過修正的Logistic生長模型擬合WaX12和WaX12-Δ sigB在不同pH值下（pH 5～9）的生長曲線，并根據(jù)擬合的生長曲線計(jì)算生長動力學(xué)參數(shù)最大比生長速率μmax、延滯期λ（h）和最大細(xì)菌濃度MPD-OD。結(jié)果表明，兩株菌在pH 4的情況下均不能生長，而在pH 5～9的環(huán)境生長并能夠用修正的

Logistic生長模型較好的擬合（R2＞0.99）。

原始菌株與突變株在不同pH條件下的生長曲線與修正Logistic模型擬合的生長動力學(xué)參數(shù)見圖7及表2。結(jié)果表明，pH 5條件下，兩株菌的生長存在明顯差異。通過模型擬合得到的λ（WaX12-ΔsigB）為20.543 h，而λ（WaX12）為17.934 h，表明突變株（WaX12-ΔsigB）的延滯期顯著大于原始菌株（P＜0.05）。此外，μmax（WaX12-ΔsigB）為0.065 OD/h，μmax（WaX12）為0.077 OD/h，表明突變株的最大比生長速率顯著低于原始菌株（P＜0.05）。同時(shí)，比較原始菌株與突變株的MPD-OD發(fā)現(xiàn)，MPD-OD（WaX12-ΔsigB）為 0.411，MPD-OD（WaX12）為 0.492，表明SigB的缺失顯著降低了菌株的最大細(xì)菌濃度 （P＜0.05）。上述結(jié)果進(jìn)一步說明，細(xì)菌在低酸性條件（pH 5）下，σB因子對其生長具有重要的調(diào)控作用。而在pH 8和pH 9的條件下，原始菌株與突變株的生長不存在顯著差異。

圖7WaX12-ΔsigB與WaX12在不同pH值下的生長曲線Fig.7　Growth curve of WaX12-ΔsigB and WaX12 at different pH values

表2　WaX12-ΔsigB與WaX12在不同pH值下的3種生長動力學(xué)參數(shù)Table 2　Three different parameters of WaX12-ΔsigB and WaX12 at different pH values

單增李斯特菌SigmaB基因做為單增李斯特菌中應(yīng)激環(huán)境變化的因子，在外界變化中存在調(diào)控作用，提高細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力。修正的Logistic預(yù)測模型能夠較好地?cái)M合 WaX12以及WaX12-ΔsigB缺失突變株在不同pH值下的生長情況，兩株菌的從pH 5到pH 7的生長速率都變快，延滯期變短，最大菌濃也上升，而從pH 7到pH 9的生長速率變慢，延滯期變長，最大菌濃下降，表明pH 7最適合兩株菌的生長。但是在酸性情況下，WaX12-ΔsigB各參數(shù)之間與WaX12存在顯著性差異，表明σB因子在pH 5下對生長最敏感，這與O'Driscoll等［13］人研究的單增李斯特菌亞致死有關(guān)，亞致死是生存與死亡的臨界狀態(tài)，相對于原始菌株有一定的細(xì)胞損傷，而在同樣細(xì)胞受損的sigB基因缺失突變株，其適應(yīng)環(huán)境的能力明顯下降；FERREIRAA.［14］等人做了在pH 2.5的情況下，原始菌株比缺失sigB的突變株的耐酸能力有提高，并且在2 h之內(nèi)原始菌株的衰亡率沒有降低，而原始菌株和ΔsigB經(jīng)過亞致死情況的馴化后，其適應(yīng)環(huán)境的能力都有輕微提高，這為σB因子對LM亞致死機(jī)制的研究奠定了一定的分子基礎(chǔ)。

同時(shí)，ATR（Acid Tolerance Response）是LM在受到酸刺激情況下所表現(xiàn)出的耐受因子，它可以增加LM的抗酸性，并且σB因子可以調(diào)控ATR的活性［15］。σB因子促使LM耐受酸性條件的作用機(jī)理可能是σB因子能調(diào)控一些與耐受酸性環(huán)境相關(guān)基因的表達(dá)，比如ATR、GAD等［16］。單增李斯特菌的GAD系統(tǒng)（谷氨酸脫羧酶，glutamate-decarboxylase）對細(xì)菌在胃液（pH 2.5）中的存活至關(guān)重要，而單增李斯特菌的σB因子亦與細(xì)菌在胃液（pH 2.5）中的存活相關(guān)［17］，即σB因子可能參與調(diào)控GAD系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)除了GAD還有Glu/γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，GABA）反向轉(zhuǎn)運(yùn)子，反向轉(zhuǎn)運(yùn)子起到了維持體內(nèi)pH的恒定。LM中GAD由gadA，gadB和gadD基因編碼，反向轉(zhuǎn)運(yùn)子由gadC和gadE基因編碼，在基因gadCB和gadD啟動子上游分別具有σB的結(jié)合位點(diǎn)［18-19］。從而使σB因子在酸性應(yīng)激條件下，開始調(diào)控GAD系統(tǒng)基因的表達(dá)［20］。其中g(shù)adD基因中分為gadD1，gadD2和gadD3等，其中GadD2在單增李斯特菌受低酸中對其生長能力起到了主要作用［21］。σB因子則是在酸性環(huán)境中可以正調(diào)控gadD2和gadD3，缺失了σB因子的單增李斯特菌對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力有所降低。Wemekamp等人［22］將sigB缺失菌株與原始菌株同時(shí)在pH 4.5的酸中暴露1 h后，通過熒光定量的方法發(fā)現(xiàn)gadA的表達(dá)量幾乎沒有變化，而其余的gad家族的基因表達(dá)則減少，揭示了σB因子可能通過直接或間接的方式轉(zhuǎn)錄調(diào)控除gadA外的gad家族的表達(dá)來介導(dǎo)LM對酸性環(huán)境的耐受。由此機(jī)理看出，在低酸的情況下，sigB缺失株比原始菌株耐受環(huán)境的能力有所降低。而在高pH值下的結(jié)果表明，sigB缺失株對高pH值下的應(yīng)激能力稍低于野生菌株，但是LM耐受堿的機(jī)制尚不明確［23］。

作者通過修正Logistic預(yù)測模型，更加直觀的獲得了WaX12-△sigB與WaX12在不同pH值下的生長動力學(xué)差異，但是本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于沒有將不同pH值與不同溫度相互結(jié)合起來進(jìn)行研究σB因子的敏感性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會對pH值和溫度正交實(shí)驗(yàn)并逐步分析。

3結(jié)語

作者構(gòu)建了敲除了SigmaB基因開放閱讀框（ORF）的突變株WaX12-ΔsigB，通過修正的Logistic模型揭示了σB因子對LM應(yīng)對環(huán)境反應(yīng)過程中起到了重要的作用，得出在 pH 5的鹽酸環(huán)境下，WaX12-ΔsigB和WaX12的最大比生長速率μmax、延滯期λ與最大細(xì)菌濃度MPD-OD均存在顯著性差異，為下一步研究σB對LM在酸性環(huán)境下對毒力基因以及生長情況的調(diào)控作用提供了重要的分子理論依據(jù)。

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Comparison of Growth Kinetics of Listeria monocytogenes WaX12 and Dull sigB Mutant at Different pH Values

WANG Xu1，2，3，SUN Xiaohong1，2，3，PAN Yingjie1，2，3，ZHAO Yong1，2，3*
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Shanghai EngineeringResearchCenterofAquatic-ProductProcessing&Preservation，Shanghai201306，China；3. Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation（Shanghai），Shanghai 201306，China）

To explore the effect of σBin the growth of Listeria monocytogenes（LM），we compared the growth kinetics of LM-WaX12 and its dull sigB mutant at different pH values.We used splicing by overlap extension PCR（SOE-PCR）and homologous recombination to construct the sigmaB gene deleted mutant；The mutant was identified by the fragments that amplified by two sides primer of sigB.The growth curve of WaX12 and WaX12-sigB were fitted by modified Logistic model from pH 5 to pH 9，as well as both growth kinetic parameters were analyzed.The results showed the ΔsigB mutant was constructed correctly.The maximum exponential growth rate（μmax），lag phase duration（λ）and maximum population density（MPD-OD）of WaX12-ΔsigB and WaX12 had all significant difference（p＜0.05）at pH 5，but had no different significant at neutral and alkali. Keywords：Listeria monocytgenes，σBfactor，acid stress stimulate，growth kinetic parameters

Q 78

A

1673—1689（2016）05—0477—08

2014-11-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271870）；上海市科委計(jì)劃項(xiàng)目（14DZ1205100，14320502100，12391901300）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字2014第3-5號）。

王 旭（1984—），男，安徽蕪湖人，食品微生物博士研究生。E-mail：shouwainwang@126.com

趙勇（1975—），男，湖北英山人，理學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)方面的研究。E-mail:yzhao@shou.edu.cn