路瑞秋，張薄博，許贛榮

（江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中安卓奎諾爾的提取純化

路瑞秋，張薄博，許贛榮*

（江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

對樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中的生理活性物質(zhì)安卓奎諾爾的提取純化工藝技術(shù)進行了研究。結(jié)果表明，安卓奎諾爾的最佳的提取條件為：提取溶劑為95%乙醇，料液比1∶25（g/mL），提取溫度為35℃，提取時間為85 min。提取液再經(jīng)過二次柱層析進一步純化。第一次硅膠柱層析最佳條件為：上樣量1∶40（w樣品∶w硅膠），徑高比1∶30，洗脫流速2.0 BV/h，產(chǎn)物中安卓奎諾爾的純度為70.2%；第二次硅膠柱層析最佳條件為：洗脫劑v苯∶v丙酮=7∶3，上樣量w樣品∶w硅膠=1∶30，徑高比1∶10，洗脫流速1.0 BV/h，最終產(chǎn)品中安卓奎諾爾的純度達到91.0%。

安卓奎諾爾；提??；純化；層析；樟芝菌

樟芝（Antrodia camphorata），俗稱牛樟芝、紅樟菇，是中國臺灣特有的珍稀食用與藥用真菌，含有多種藥理活性成分，有“靈芝之王”、“森林紅寶石”之稱［1-2］。樟芝培養(yǎng)物具有保肝、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、抗炎癥等藥理活性［3］。

2007年，Lee［4］等人用正己烷萃取樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末，得到一個新化合物安卓奎諾爾（Antroquinonol），屬于泛醌類化合物。Yu［5］等人研究顯示，安卓奎諾爾對胰腺癌具有顯著地抑制作用。Kumar［6］等人研究顯示在肝癌細胞中安卓奎諾爾可以顯著的抑制乙醇誘導產(chǎn)生的AST、ALT、ROS、NO、MDA和GSH的消耗。Kumar［7］等人研究顯示，安卓奎諾爾可以顯著的抑制3種NSCLS癌細胞的增殖。安卓奎諾爾具有顯著的抗癌活性，并且它對于肝癌細胞與正常細胞有選擇性［8］，目前已進入FDA二期臨床實驗，是具有優(yōu)良前景的抗癌化合物。

研究者及產(chǎn)品開發(fā)者對樟芝人工培養(yǎng)菌絲體產(chǎn)物特征代謝產(chǎn)物仍缺乏系統(tǒng)的鑒定，特征性代謝產(chǎn)物的分離、純化、鑒定、標準品的制備、分析方法的建立是高質(zhì)量樟芝產(chǎn)物開發(fā)的瓶頸之一［9］。而對于安卓奎諾爾的提取、純化技術(shù)的報道幾乎是空白。由于市場上并無安卓奎諾爾標準品的銷售，這使得對發(fā)酵及制備過程中安卓奎諾爾的濃度無法準確定量，嚴重阻礙含安卓奎諾爾樟芝發(fā)酵產(chǎn)品的研究和開發(fā)。

作者利用響應面設(shè)計優(yōu)化了從樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中提取安卓奎諾爾的工藝，將有效成分從發(fā)酵物中高效浸提出來，同時探討了安卓奎諾爾的兩次柱層析條件，獲得了安卓奎諾爾純度較高的產(chǎn)品，為樟芝產(chǎn)品的進一步研究及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1原料及試劑

樟芝發(fā)酵產(chǎn)物：作者所在實驗室自制；無水乙醇、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、苯等：均為分析純；薄層色譜硅膠板、硅膠柱填料100-200目柱層析硅膠：青島海洋化工廠分廠。

1.2儀器

海耐高速萬能粉碎機：浙江屹立工貿(mào)有限公司；AB204-N電子天平：METTLER TOLEDO；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；YH6-300BS型遠紅外鼓風恒溫干燥箱：上?？德穬x器設(shè)備有限公司；色譜柱：Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm；5 μm）；RE-52 AAB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海嘉鵬科技有限公司；BS2-100自動部分收集器、HL-1恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1安卓奎諾爾的分析檢測方法樟芝產(chǎn)品中的安卓奎諾爾的HPLC分析檢測方法：參照文獻［10］。純度的測定方法：用面積歸一化法計算樣品的峰面積百分比。

1.3.2安卓奎諾爾的提取實驗

1）樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的預處理實驗：取樟芝發(fā)酵產(chǎn)物在45℃的鼓風烘干條件下烘干36 h。將烘干產(chǎn)物置于磨粉機中磨粉，得到樟芝發(fā)酵粉末。

2）提取溶劑對安卓奎諾爾提取率的影響：取樟芝發(fā)酵粉末10 g，以料液比1∶10（g/mL）的比例添加有機溶劑浸提，將物料混合均勻后放入恒溫水浴鍋內(nèi)20℃振蕩120 min，取出樣品，放置過夜，然后進行高效液相測定。有機溶劑有正己烷、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇。

3）料液比對安卓奎諾爾提取率的影響：分別選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶60（g/mL）不同的料液比，乙醇濃度為95%，溫度為35℃，提取時間為120 min，篩選出對安卓奎諾爾提取效果最佳的料液比。

4）提取時間對安卓奎諾爾提取率的影響：將水浴提取時間分別設(shè)定為 30、60、90、120、150、180 min，料液比1∶20（g/mL），乙醇體積分數(shù)為95%，溫度為35℃進行提取，篩選出安卓奎諾爾提取效果最佳的提取時間。

5）提取溫度對安卓奎諾爾提取率的影響：將水浴溫度分別設(shè)定為25、30、35、40、50℃，料液比1∶20（g/mL），乙醇體積分數(shù)為95%，提取時間為90 min進行提取，篩選出對安卓奎諾爾提取效果最佳的提取溫度。

6）響應面法優(yōu)化樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中安卓奎諾爾提取條件：綜合單因素實驗結(jié)果，應用Design Expert 8.05軟件，采用Box-Behnken Design建立數(shù)學模型，以料液比A、提取溫度B、提取時間C為自變量，以安卓奎諾爾提取量Y為因變量共設(shè)立了17個處理組，因子編碼及水平見表1。

表1　　響應面3因素3水平試驗設(shè)計Table 1　Factors and levels in response surface analysis

1.3.3硅膠柱層析純化安卓奎諾爾

1）第一次硅膠柱層析分離：硅膠（100～200目）作為固定相，裝柱前在烘箱中110℃活化1 h，冷卻后以正己烷為溶劑濕法裝柱［11］。將安卓奎諾爾粗提濃縮液與硅膠混合進行干法上樣，選擇適合的正己烷/乙酸乙酯體積比為流動相，調(diào)節(jié)洗脫流速，每5分鐘收集一次樣品，對各管進行檢測，合并含安卓奎諾爾的洗脫液進行濃縮。

2）第二次硅膠柱層析分離：裝柱方法同上。將合并的含有效成分的部分與硅膠混合，置于通風櫥中，常溫下風干，進行干法上樣，選擇合適苯/丙酮體積比為流動相進行洗脫，每5分鐘收集一次樣品，對各管進行檢測，合并含安卓奎諾爾的洗脫液進行濃縮。

1.3.4硅膠層析得到物質(zhì)的鑒定將上述經(jīng)兩次硅膠層析得到的物質(zhì)進行質(zhì)譜、核磁檢測。

2結(jié)果與討論

2.1安卓奎諾爾的提取實驗

2.1.1提取溶劑對安卓奎諾爾提取率的影響在不同的提取溶劑條件下，安卓奎諾爾的提取率明顯不同，乙醚對安卓奎諾爾的提取效果最好，提取率達到81.42%，95%乙醇次之，提取率為81.13%。極性最小的正己烷提取效果最差，提取率僅有30.01%。乙醚對安卓奎諾爾的提取效果雖然稍高于95%乙醇，但是95%乙醇的危險性要遠低于乙醚。因此，選用95%乙醇作為提取樟芝發(fā)酵樣品中活性產(chǎn)物安卓奎諾爾的有機溶劑。

2.1.2料液比對安卓奎諾爾提取率的影響不同的料液比對安卓奎諾爾的提取率有著較為明顯的影響。隨著料液比的增大，安卓奎諾爾的提取率逐漸增加；當料液比達到1∶20（g/mL）時，安卓奎諾爾的提取率最大，約為95.15%；料液比超過1∶20（g/mL）時安卓奎諾爾的提取率幾乎不再發(fā)生變化。所以選擇料液比為1∶20（g/mL）作為提取安卓奎諾爾的最適料液比。

2.1.3提取時間對安卓奎諾爾提取率的影響樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末的顆粒度比較小，物料與提取溶劑的接觸面積大，因此90 min內(nèi)安卓奎諾爾提取率基本趨于穩(wěn)定。在前90分鐘內(nèi)，隨著提取時間的延長，安卓奎諾爾提取率也顯著上升，90 min時安卓奎諾爾的提取率為95.16%。但當提取時間超過90 min后，安卓奎諾爾提取率幾乎不再發(fā)生變化，因此選擇提取時間為90 min。

2.1.4提取溫度對安卓奎諾爾提取率的影響隨著提取溫度的上升，安卓奎諾爾的提取率也隨之顯著上升，35℃時安卓奎諾爾提取率達到最高為95.13%，但在溫度超過35℃后，安卓奎諾爾的提取率幾乎不再發(fā)生變化，因此選擇提取的溫度為35℃。

2.1.5響應面法優(yōu)化樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末中安卓奎諾爾提取條件

1）由Box-Behnken Design實驗：實驗結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken設(shè)計方案及響應值Table 2　Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2）數(shù)學模型的建立：按照Design Expert8.05軟件中的Box-Behnken Design模型對試驗獲得的安卓奎諾爾提取率響應值進行回歸，建立二次回歸模型。得到的回歸方程為：

Y=95.18+6.91A+1.93B+2.00C+1.54AB-1.84AC+0.88BC-6.20A2-3.40B-1.18C2

對回歸方程進行檢驗，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 9，P＜0.000 1，表明回歸模型顯著，擬合程度好，有實際應用價值。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗見表3。表明料液比A、料液比二次項A2及提取溫度二次項B2對樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末中安卓奎諾爾提取率有極度顯著影響；提取溫度B、提取時間C、料液比和提取溫度的交互項AB、料液比和提取時間的交互項AC對樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末中安卓奎諾爾提取率的影響高度顯著；提取時間的二次項C2對樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末提取液中安卓奎諾爾提取率有顯著影響；其他變量的影響均不顯著（P＞0.05）。一次系數(shù)估計值A(chǔ)= 6.91、B=1.93、C=2.00，可知因素的主效應關(guān)系為料液比＞提取時間＞提取溫度。

表3　　回歸方程方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression equation with polysaccharide yield as a function

3）響應面分析與優(yōu)化：由圖1可以看出，料液比和提取溫度的交互影響及料液比和提取時間的交互影響對樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末中安卓奎諾爾的提取率均有較顯著的影響。

4）模型驗證性試驗：從上述回歸模型中求得最優(yōu)工藝條件為料液比1∶25.50（g/mL），提取溫度35.02℃，提取時間85.08 min，樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末中安卓奎諾爾的提取率為97.02%。由于以上最佳條件未包括在響應面優(yōu)化的17組試驗中，需進一步驗證。為了操作方便，將以上條件修正為料液比1∶25 g/mL，提取溫度35℃，提取時間85 min。驗證試驗結(jié)果表明，在最佳提取條件下，樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末中安卓奎諾爾的提取率為96.97%（RSD=0.17%）與預測值相差不大，說明該方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末中安卓奎諾爾物質(zhì)提取工藝。

圖1　各兩因素交互作用對樟芝固態(tài)粉末安卓奎諾爾提取率的影響Fig.1　Response surface of the effect of any two factors on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

2.2硅膠柱層析純化安卓奎諾爾

2.2.1第一次硅膠柱層析

1）洗脫劑的選擇：由于樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末乙醇提取物中含有多種物質(zhì)，有許多未知的物質(zhì)，所以在洗脫時應選擇合適的洗脫劑進行梯度洗脫，去掉大部分的雜質(zhì)。不同展開劑的薄層層析結(jié)果見表4。

表4　　不同展開劑的TLC結(jié)果Table 4　TLC results of different developing solvents

根據(jù)TLC的結(jié)果，當v正己烷∶v乙酸乙酯為7∶3時，安卓奎諾爾與雜質(zhì)分開，可實現(xiàn)安卓奎諾爾的初步除雜；展開劑為v正己烷∶v乙酸乙酯=8∶2時，安卓奎諾爾雖與雜質(zhì)未分開，但有一部分雜質(zhì)的Rf≥0.75，因此第一次柱層析依序采用不同比例的正己烷：乙酸乙酯為流動相進行梯度洗脫（100%～50%），對含安卓奎諾爾的部分進行收集。

2）上樣量對分離效果的影響：柱層析時，選擇徑高比為1∶40的層析柱，流速為2.0 BV/h，考察不同的上樣量對分離效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　不同的上樣量對安卓奎諾爾純度的影響Fig.2　Effect of sample volume on antroquinonol purity

由圖2可知，隨著上樣量的減少，安卓奎諾爾純度逐漸升高后趨于穩(wěn)定，這是因為上樣量大時，硅膠對樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末提取濃縮物的吸附達到飽和，過量的濃縮物隨著安卓奎諾爾一起被洗脫下來，所以最適上樣量應選擇1∶40（w樣品∶w硅膠）。

3）裝柱徑高比對安卓奎諾爾純化的影響：柱層析時，上樣量為1∶40（w樣品∶w硅膠），流速為2.0 BV/h，考察不同的徑高比對分離效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　不同的徑高比對安卓奎諾爾純度的影響Fig.3　Effect of diameter-length ratio on antroquinonol purity

由圖3可知，隨著徑高比的增加，安卓奎諾爾純度呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。由于樟芝發(fā)酵產(chǎn)物乙醇萃取濃縮物中的物質(zhì)較多，較高的徑高比有利于安卓奎諾爾的純化，徑高比越大，理論塔板數(shù)越高，分離效果越好，當徑高比太大時，雖然達到了分離純化的目的，但所消耗的溶劑及洗脫時間較長，使工作效率降低，所以最適徑高比為1∶30。

4）洗脫流速對安卓奎諾爾純化的影響：柱層析時，選擇上樣量為1∶40（w樣品∶w硅膠），徑高比為1∶30，考察不同流速對安卓奎諾爾純化的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　不同的洗脫流速對安卓奎諾爾純度的影響Fig.4　Effect of eluant flow rate on antroquinonol purity

由圖4可知，隨著洗脫流速的增大，安卓奎諾爾的純度呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，當洗脫流速較低時，導致安卓奎諾爾的軸向擴散較嚴重，使得層析結(jié)果變差；當洗脫流速達到并超過2.0 BV/h時，硅膠還未對安卓奎諾爾形成有效的吸附便被洗脫劑帶走，沒有達到層析效果，導致安卓奎諾爾純度較低，因此安卓奎諾爾純化最適洗脫流速為2.0 BV/h。

第一次硅膠柱層析純化安卓奎諾爾的最佳上樣量為1∶40（w樣品∶w硅膠），徑高比為1∶30，洗脫流速為2.0BV/h，在此條件下得到的安卓奎諾爾純度為70.2%。

2.2.2第二次硅膠柱層析采用2.2.1所用到的方法確定了第二次硅膠柱層析的條件，利用溶劑體系v苯∶v丙酮=7∶3作為洗脫劑，最佳上樣量為1∶30（w樣品∶w硅膠），最適徑高比為1∶10，洗脫流速為1.0 BV/h。經(jīng)過第二次硅膠柱層析后，安卓奎諾爾的純度達到了91.0%以上，見圖5。

圖5　　硅膠純化后安卓奎諾爾的HPLC檢測圖譜Fig.5　Antroquinonol HPLC analysis

2.2.3硅膠層析得到物質(zhì)的鑒定結(jié)果分離純化得到的物質(zhì)為淡黃色油狀液體，UV（乙醇）最大吸收波長為268.2nm，EIMSm/z：391［M+1］+、373、341、 181、169。為進一步確認其結(jié)構(gòu)，隨后對該物質(zhì)進行1H-NMR和13C-NMR的分析，結(jié)果見圖6-7。

圖6　　純化物的1H-NMR（400 Hz，CDCl3，δ：μg/g）Fig.6　1H-NMR of Antroquinonol

圖7　　純化物的13C-NMR（100 Hz，CDCl3，δ：μg/g）Fig.7　13C-NMR of Antroquinonol

3結(jié)語

利用試驗設(shè)計軟件 Design Expert8.05，采用Box-Behnken Design建立了物料比A、提取溫度B和提取時間C與樟芝發(fā)酵產(chǎn)物粉末安卓奎諾爾提取率之間的二次多項數(shù)學模型：

Y=95.18+6.91A+1.93B+2.00C+1.54AB-1.84AC+0.88BC-6.20A2-3.40B2-1.18C2

回歸分析表明，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 9，P＜0.000 1，表明回歸模型顯著，擬合程度好，有實際應用意義。通過模型系數(shù)顯著性檢驗，得到因素的主效應關(guān)系為：物料比＞提取時間＞提取溫度。

柱層析法是一種非常有效的分離純化方法，廣泛應用于天然產(chǎn)物的分離純化過程中［12］。作者采用正相硅膠柱層析法對有效成分進行了分離純化，經(jīng)過兩次硅膠柱層析后獲得了純度較高的有效成分。

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Recovery and Purification of Antroquinonol from Antrodia camphorata Fermentation Products

LU Ruiqiu，ZHANG Bobo，XU Ganrong*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This paper discusses the antroquinonol purification process，the response surface method was used to extract more antroquinonol，and silica gel column chromatography to obtain high purity of antroquinonol.The experimental results show that the optimal conditions for the extraction were as follows：material ratio 1∶25（g/mL），the extraction temperature was 35℃，the extraction time was 85 min.The best conditions for the first silica gel column chromatography：sample volum 1∶40，diameter-length ratio 1∶30，elution flow rate 2.0 BV/h，the purity is 70.2%；The second optimum separation was achieved with eluant benzene∶acetone=7∶3（v/v），sample volume at 1∶40，diameter-length ratio 1∶10 and elution velocity at 1.0 BV/h，the purity is 91%.

Antroquinonol，recovery，purification，chromatography，Antrodia camphorata

S 642.5

A

1673—1689（2016）05—0549—07

2014-09-19
*

許贛榮（1957—），男，江西贛州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發(fā)酵工程與生物化工方面的研究。E-mail：grxu123@126.com