王小青, 高　楊, 尹志峰, 宮聞婧, 趙紅玲, 王良友*

(1. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德　067000；2. 承德天創(chuàng)生物制品有限公司，河北 承德　067000)

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抗菌肽IB-367的固相合成與抑菌活性

王小青1, 高楊1, 尹志峰1, 宮聞婧2, 趙紅玲1, 王良友1*

(1. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德067000；2. 承德天創(chuàng)生物制品有限公司，河北 承德067000)

摘要：采用固相合成方法，以Rink Amide樹脂為載體，F(xiàn)moc保護(hù)氨基酸為原料，經(jīng)苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)/N,N-二異丙基乙胺(DIEA)縮合，三氟乙酸/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚裂解體系脫除保護(hù)基制得IB-367線性肽(4)； 4經(jīng)雙氧水氧化制得IB-367一環(huán)肽(5)； 5經(jīng)碘乙醇溶液氧化合成抗菌肽IB-367(6)，收率34.1%，純度>95.0%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS(ESI)和氨基酸組成分析確證。抑菌活性研究結(jié)果表明：6對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5.0 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞：依色格南; 固相合成; 二硫鍵; 抑菌活性

依色格南(IB-367)為含有4個(gè)Cys殘基的抗菌活性17肽(Chart 1)，是豬中性粒細(xì)胞肽-1(PG-1)的類似物[1]，能與細(xì)菌的胞外成分如脂多糖或脂膜酸等結(jié)合，引起細(xì)菌膨脹、破裂，通過破壞細(xì)胞膜殺死細(xì)菌[2-5]，其抗菌譜廣泛，對(duì)革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌及真菌、酵母菌等均有抑制作用，且耐藥性較低[6]。有關(guān)IB-367的合成法，目前主要有片段縮合法、固相合成法和基因工程法[7-8]等。其中基因工程方法純化困難，難以得到純品，尚未形成一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的方法；片段縮合法會(huì)增加反應(yīng)步驟和處理難度，降低產(chǎn)物的合成效率；全固相合成法因無法控制反應(yīng)停止時(shí)間，成本過高，產(chǎn)率不穩(wěn)定無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

Chart 1

Scheme 1

本文采用固相合成與液相環(huán)化相結(jié)合的方法，首先采用固相合成方法，以Rink Amide Resin為載體，F(xiàn)moc保護(hù)氨基酸為原料，經(jīng)苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)/N,N-二異丙基乙胺(DIEA)縮合， 三氟乙酸/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚裂解體系脫除保護(hù)基制得7,12-位帶Acm保護(hù)基的IB-367線性肽(4)； 4在液相中以雙氧水環(huán)化Cys5-Cys14制得IB-367一環(huán)肽(5)； 5通過碘的乙醇溶液脫掉Acm保護(hù)基同時(shí)環(huán)化Cys7-Cys12合成IB-367(6， Scheme 1)，收率34.1%，純度>95.0%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS(ESI)和氨基酸組成分析確證。并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Agilent Technologies 1200型高效液相色譜儀(UV檢測器)；Newstyle型反相高效制備液相色譜儀；Hedera 50型半制備液相色譜儀[ODS-2反相硅膠柱(10 mm×250 mm， 10 μm)，檢測波長:215 nm；流動(dòng)相：乙腈/0.1%TFA水溶液，流速5 mL·min-1，乙腈26%～40%，洗脫時(shí)間30 min]； SPH-100B型小容量恒溫培養(yǎng)振蕩器。

大腸桿菌L與Z(分離自醫(yī)院感染科)，金黃色葡萄球菌26001-26，白葡萄球菌26069-5， LB培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Rink 樹脂(替代度為0.5 mmol·g-1)，天津南開合成科技有限公司；Fmoc保護(hù)氨基酸，成都誠諾新技術(shù)有限公司；乙腈，色譜純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) NH2-Rink-Resin(1)的合成

在反應(yīng)柱中加入Rink樹脂1.977 g(0.5 mmol·g-1)和DMF 20 mL，通氮?dú)馊軡q30 min，用DMF洗滌，加入20%哌啶的DMF(20 mL)溶液，反應(yīng)20 min，用茚三酮檢測合格后，用DMF洗滌得1。

(2) Fmoc-Arg(pbf)-Rink Resin(2)的合成

在1中加入Fmoc-Arg(pbf)-OH 1.301 g(2 mmol)， HBTU 0.927 g(1 mmol)和DIEA 0.7 mL(2 mmol)，通氮?dú)夥磻?yīng)1.5 h，用DMF洗滌，加入醋酸酐與吡啶(V/V=6/5)混合液40 mL，反應(yīng)14 h。加甲醇(20 mL)收縮2次(10 min/次)，減壓干燥至恒重得2 2.421 g，替代度0.323 mmol·g-1。

(3) IB-367-Rink Resin(3)的合成

將2置反應(yīng)柱中，加入DMF 20 mL，充分溶漲并洗滌后，加20%哌啶的DMF(20 mL)溶液，反應(yīng)20 min，茚三酮檢測合格后，洗滌并抽干。根據(jù)IB-367的氨基酸序列用按1.2(2)方法自C端向N端依次在2上依次連接Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Tyr(tBu)-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH，用甲醇收縮，減壓干燥至恒重得3 4.007 g。

(4) 4的合成

將3置燒瓶中，加入裂解液[V(TFA) ∶V(苯甲硫醚) ∶V(EDT) ∶V(苯甲醚)=90 ∶5 ∶3 ∶2]40 mL，冰浴冷卻30 min，于室溫反應(yīng)2 h。過濾，濾液傾入無水冰乙醚(400 mL)中(析出白色沉淀)，4000 r·min-1離心4 min，沉淀真空干燥至恒重。用無氧水溶解，經(jīng)半制備RP-HPLC純化，凍干得白色固體4 1.035 g； MS(ESI)m/z： 512.1[M+4H]4+。

4經(jīng)酸水解(6 mol·L-1鹽酸水溶液，于110 ℃反應(yīng)22 h，方法下同)的氨基酸組成實(shí)測值與理論值(括號(hào)內(nèi)，下同)相符：Arg 4.09(4)， Gly 4.21(4)， Leu 0.98(1)， Gys 4.11(4)， Tyr 1.07(1)， Phe 0.96(1)， Val 1.92(2)。

(5) 5的合成[9]

將4 1.035 g溶于1 L水中，攪拌使其溶解，配制1 mg·mL-1溶液，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)至pH 7.2，加雙氧水100 mL，環(huán)化反應(yīng)20 min(HPLC監(jiān)測)。用冰醋酸調(diào)至pH 3.0，按1.2(4)制得白色固體5 0.724 g； MS(ESI)m/z： 511.9[M+4H]4+， 682.5 [M+3H]3+， 1022.9 [M+2H]2+；經(jīng)酸水解的氨基酸組成實(shí)測值與理論值相符：Arg 4.14(4)， Gly 4.12(4)， Leu 1.16(1)， Gys 3.89(4)， Tyr 1.15(1)， Phe 1.11(1)， Val 2.10(2)。

(6) 6的合成

取5 0.724 g配制成1 mg·mL-1水溶液，用冰醋酸調(diào)至pH 3.0，攪拌下緩慢滴加20 mg·mL-1碘乙醇至溶液顏色穩(wěn)定為黃色，環(huán)化反應(yīng)1 h(HPLC監(jiān)測)，按1.2(4)制得白色固體6 0.419 g； MALDI-TOF-MSm/z： 1 901.389[M+H]+；經(jīng)酸水解的氨基酸組成實(shí)測值與理論值相符： Arg 3.97(4)， Gly 4.01(4)， Leu 1.05(1)， Gys 4. 07(4)， Tyr 1.13(1)， Phe 0. 88(1)， Val 2.00(2)。

1.3抑菌活性測定

(1) 最小抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)[10]

精密稱取6 2.0 mg于4 mL離心管，用無菌水溶解，制備成1.0 mg·mL-1的供試品溶液，并稀釋為0.5， 0.25， 0.125， 0.1， 0.05和0.025 mg·mL-1系列濃度。在無菌操作狀態(tài)下，將金黃色葡萄球菌26001-26，白葡萄球菌26069-5，大腸桿菌臨床菌L與Z， 4種菌接種于LB平板中，培養(yǎng)24 h活化菌株，挑取單克隆菌株轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h，用分光光度計(jì)測量其OD值(600 nm)，并稀釋使其菌懸液OD值為0.2左右，即菌液濃度約為2×1011cfu·mL-1。取10 μL 6供試品溶液，10 μL菌液，80 μL液體培養(yǎng)基于96孔板，無菌水代替供試品溶液作為陰性對(duì)照(CK)。培養(yǎng)8 h后觀察長菌情況。

(2) 抑菌圈實(shí)驗(yàn)[11]

取無菌并干燥的濾紙片(Φ=6 mm)，每片精密滴加1 mg·mL-16 20 μL，置清潔無菌平皿內(nèi)，無菌操作臺(tái)干燥后備用。取無菌干燥濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水20 μL，制備成陰性對(duì)照樣片。將指示細(xì)菌菌液(約1×108cfu·mL-1)涂布于LB 平板，在適當(dāng)位置貼上己滅菌的濾紙片，于37 ℃培養(yǎng)16～24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果與討論

2.1合成

在固相合成中，載體對(duì)合成影響較大，本研究比較了Rink Amide Resin，Rink Amide AM Resin與Rink Amide MBHA Resin 3種樹脂，結(jié)果顯示不同載體對(duì)IB-367的合成影響不大，本研究最終選擇價(jià)格相對(duì)較低的Rink Amide Resin為固相載體；Rink-Amide-Am-Resin接第一個(gè)氨基酸時(shí)替代度的大小對(duì)后面16個(gè)氨基酸的偶聯(lián)非常重要，其原始替代度為0.5 mmol·g-1，連接Fmoc-Arg(pbf)-OH理論100%連接替代度為0.378 mmol·g-1，替代度選用較高的0.323 mmol·g-1，可以提高收率，降低成本。IB-367含17個(gè)氨基酸，每個(gè)氨基酸與上一個(gè)氨基酸偶聯(lián)程度對(duì)合成后粗肽的純率有很大的影響，比較了DIC/HOBt，HBTU/DIEA與HBTU/HOBt/DIEA 3種縮合體系，最終選擇合成效率最高且副產(chǎn)物少的HBTU/HOBt/DIEA為縮合劑；比較1 ∶4， 1 ∶3與1 ∶2等投料比，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，考慮合成成本和合成效率最終選擇1 ∶3為投料比。

固相合成中切割反應(yīng)在各種酸條件下完成，一般不同的樹脂需要不同的切割試劑，同一樹脂也因肽側(cè)鏈保護(hù)基不同而需要不同的試劑配方，以減少副反應(yīng)，提高純度。本文比較了TFA(100)， TFA ∶H2O(95∶5)， TFA ∶苯甲硫醚 ∶EDT ∶苯甲醚(90 ∶5 ∶3 ∶2)， TFA ∶TIS ∶H2O (95 ∶2.5 ∶2.5)， TFA ∶苯甲硫醚 ∶EDT ∶TIS(90 ∶5 ∶3 ∶2)與TFA ∶苯甲硫醚 ∶間甲酚 ∶EDT(91 ∶5 ∶1 ∶3)等6種裂解體系，結(jié)合純度、收率與成本確定TFA ∶苯甲硫醚 ∶EDT ∶苯甲醚(90 ∶5 ∶3 ∶2)為裂解體系。

許多生物活性肽存在二硫鍵，二硫鍵對(duì)多肽的構(gòu)象及生物活性有重要影響，首次環(huán)化時(shí)本文對(duì)空氣氧化，鐵氰化鉀氧化法，DMSO 氧化和H2O2氧化形成二硫鍵進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)H2O2氧化操作簡單、用時(shí)短，產(chǎn)品純度較高，并且產(chǎn)生的副產(chǎn)物為水，對(duì)多肽的影響較少。第二對(duì)二硫鍵環(huán)化時(shí)采用的碘氧化法，脫出Cys上的Acm保護(hù)基同時(shí)進(jìn)行二硫鍵的鏈接。該方法操作簡便，純化時(shí)碘易除去。

2.26的抑菌活性

6的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可以看出，6對(duì)金黃色葡萄球菌26001-26，白葡萄球菌26069-5，大腸桿菌臨床菌L與Z的MIC均為5.0 μg·mL-1。

6的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可以看出，6對(duì)四種菌均有明星的抑菌活性。本合成方法合成的6具有對(duì)抗革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用，且作用明顯。

表1　6對(duì)供試菌的MIC

*“-”表示未長菌，“+”表示長菌。

表2　6的抑菌活性

依據(jù)IB-367的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以固相合成法合成IB-367線性肽，并經(jīng)過兩次環(huán)化合成了IB-367，收率34.1%，純度>95.0%。初步抑菌活性測試結(jié)果表明：IB-367對(duì)所有供試菌均有一定抑菌活性。

該文所采用的合成方法提高了收率，降低了成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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收稿日期：2016-04-29

基金項(xiàng)目：河北省海外高層次人才“百人計(jì)劃”資助項(xiàng)目(E201200002)； 河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

作者簡介：王小青(1984-)，女，漢族，河北承德人，碩士研究生，助理研究員，主要從事生物活性多肽藥物的研發(fā)。 Tel. 0314-2290474， E-mail: wangxqsmart@163.com 通信聯(lián)系人： 王良友，副研究員， Tel.0314-2290640， E-mail: liangywang@yahoo.com

中圖分類號(hào)：R914.5; O629.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.07.16116

Solid Phase Synthesis and Anti-microbial Activities of the Antibacterial Peptide IB-367

WANG Xiao-qing1,GAO Yang1,YIN Zhi-feng1,GONG Wen-jing2,ZHAO Hong-ling1,WANG Liang-you1*

(1. Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College,Chengde 067000, China; 2 Chengde Tianchuang Biological Products Corporation, Chengde 067000, China)

Abstract：The linear peptides of IB-367(4) was synthesized according to its peptide sequence by condensation with O-(benzotriazol-yl)-N,N,N′,N′-tetramethy-luronium(HBTU)/N-Ethyldiisopropylamine(DIEA) and deprotection with trifluoroacetic acid/thioanisole/1,2-ethanedithiol/anisole, using rink amide resin as the solid supporter, and Fmoc-amino acids as raw materials. The cyclic peptide of IB-367(5) was formed by oxidation of 4 with H2O2. The antibacterial peptide IB-367(6) with yield of 34.1% and purity>95.0% was obtained by oxidation of 5 with I2. The structure was confirmed by MS(ESI) and amino acid composition analysis. MIC of 6 on Escherichia coli and Staphylococcus aureus was 5.0 μg·mL-1.

Keywords：IB-367; solid phase synthesis; disulfide bond; antimicrobial activity