付　浩, 馮昌雨, 詹曉北, 朱　莉, 吳劍榮

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫　214122)

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·研究論文·

聚唾液酸-透明質(zhì)酸接枝聚合物的合成及其在藥物緩釋載體中的應(yīng)用

付浩, 馮昌雨, 詹曉北, 朱莉, 吳劍榮*

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122)

摘要：聚唾液酸(PSA)經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后，與透明質(zhì)酸(HA)在堿性條件下反應(yīng)合成了系列PSA-HA接枝聚合物(P1～P5, PSA與HA質(zhì)量比分別為1 ∶1～5 ∶1)，合成率40%～89%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)FT-IR，元素分析和SEM表征。以胰島素為模型藥物，將P2與胰島素按2 ∶1(m/m)混合時，包封率和載藥率分別為85%和38%，平均粒徑為3.2 μm。體外釋藥試驗結(jié)果表明: P2對胰島素有一定的體外緩釋能力，在6 h內(nèi)釋藥89%；在pH 1.2條件下的釋藥速度大于pH 7.4條件下的釋藥速度。

關(guān)鍵詞：聚唾液酸; 透明質(zhì)酸; 接枝聚合物; 合成; 胰島素; 藥物緩釋

聚唾液酸(PSA)是由N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸的一種)以α-2,8或α-2,9糖苷鍵連接的同型聚合物，具有非免疫原性、優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，是一種優(yōu)良的生物材料[1-2]。目前，PSA經(jīng)修飾后廣泛應(yīng)用于蛋白藥物的緩釋包埋材料和神經(jīng)修復(fù)手術(shù)中的支架材料[3-4]。此外，PSA還具有誘導(dǎo)和支持神經(jīng)原細胞再生的功能，可以加速神經(jīng)創(chuàng)傷的愈合，也用作神經(jīng)細胞組織工程材料[5-6]。

透明質(zhì)酸(HA)是一種存在于高等動物機體內(nèi)多種組織器官中的天然大分子多聚糖，主要成分是葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖，具有良好的生物相容性和高粘彈性[7]，以其獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能[8]。但HA屬于糖胺多糖(GAGs)，在體內(nèi)易被酶降解，而HA可修飾位點較多，因此通過合成改性后的HA聚合物穩(wěn)定性將得到提高[9]。目前，與HA接枝合成的聚合物包括羧甲基纖維素鈉、葡聚糖、聚乙二醇、海藻酸鈉、殼聚糖及明膠等[10-15]。此外，HA還具有與細胞表面特異受體專一性結(jié)合的能力，以達到藥物增稠、藥物緩釋、促進藥物透皮吸收及靶向性的目的，使得HA及其衍生物常作為藥物緩釋基材[16]。例如，Jederstrom等[17]利用HA作為多肽類藥物胰島素的載體進行動物實驗，研究發(fā)現(xiàn)血液中葡萄糖濃度明顯降低，證實HA對胰島素進入機體起到很好的保護作用。

胰島素是臨床上治療Ι型糖尿病的一線藥物[18]，但是胰島素自身穩(wěn)定性差，口服易被胃腸道酶水解，且對腸道粘膜通透性低，口服生物利用度一直較低[19]。

鑒于此，本研究結(jié)合PSA和HA的優(yōu)點，以PSA和HA為基質(zhì)材料，將PSA經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后，與HA在堿性條件下合成了系列PSA-HA接枝聚合物(P1～P5, PSA與HA質(zhì)量比分別為1 ∶1～5 ∶1, Scheme 1)，合成率40%～89%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)FT-IR、元素分析和SEM表征。

以胰島素為酸性多肽模型藥物，用接枝聚合物包埋胰島素，使其兼具PSA的抗免疫識別和HA的與細胞表面特異受體專一性結(jié)合的能力，促進藥物吸收，提高藥物穩(wěn)定性和半衰期。并通過體外釋放試驗測定接枝聚合物對胰島素的體外緩釋能力。

Scheme 1

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Thermo Nicolet NEXUS型紅外光譜儀(KBr壓片)；Vario EL Ⅲ型元素分析儀；Agilent 1100型高效液相色譜儀[色譜柱：InertSustain C18(4.6 mm×250 mm i.d, 5 μm)，柱溫:40 ℃，流動相：0.2 mol·L-1硫酸鹽緩沖液，流速：1 mL·min-1，進樣體積：20 μL；檢測波長：214 nm]； FEI Quanta 200型掃描電鏡。

PSA(α-2,8糖苷鍵連接，相對分子質(zhì)量為10萬Da)，自制；HA，山東福瑞達生物醫(yī)藥有限公司；胰島素(28.2 U·mg-1)，徐州萬邦金橋制藥有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2P1～P5的制備

將PSA 1.5 g溶于10 mL水中，加入環(huán)氧氯丙烷0.4 mL和NaOH 0.05 g，攪拌下于30 ℃反應(yīng)3 h。旋蒸除去環(huán)氧氯丙烷，以水/乙醇(V/V=1/4)為溶劑采用離心-溶劑沉淀法制得活化的PSA(采用硫代硫酸鈉滴定法[20]測定PSA的環(huán)氧基修飾密度)。

取活化的PSA 1.5 g加至1.5%(w/V)的HA溶液(100 mL)中，攪拌下于30 ℃反應(yīng)56 h。減壓濃縮后用分子截留量為50萬Da的透析袋透析，利用間苯二酚法[21]檢測透析液中的PSA，直至溶液中未檢測出PSA，將透析袋內(nèi)溶液經(jīng)冷凍干燥得P1(PSA與HA質(zhì)量比為1 ∶1)。

改變PSA與HA質(zhì)量比，用類似方法制得P2, P3, P4和P5(PSA與HA質(zhì)量比分別為2 ∶1, 3 ∶1, 4 ∶1和5 ∶1)。

1.3藥物包埋

將P 0.5 g凍干粉末溶于1 mol·L-1Na2SO4溶液中(P終濃度為8.5 mg·mL-1)，靜置過夜，用1 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH 2.0。另取胰島素60 mg溶于0.01 mol·L-1鹽酸(3 mL)中，依據(jù)P與胰島素的質(zhì)量比分別為6 ∶1, 6 ∶2, 6 ∶3, 6 ∶4, 6 ∶5和6 ∶6，將兩溶液混合反應(yīng)1 h。置于Tris緩沖液(0.5 mmol·L-1， pH 6.5)中透析48 h，其間更換透析液一次，袋內(nèi)懸濁液于20 000 r·min-1離心30 min，沉淀冷凍干燥后得P/胰島素粉末。

1.4包封率與載藥率測定

采用HPLC檢測上述透析液及離心所得上清液中的胰島素含量。按下式計算胰島素包封率和載胰島素率：

1.5P/胰島素體外釋放試驗

將P/胰島素分別置于pH 1.2鹽酸溶液10 mL和pH 7.4 PBS緩沖溶液10 mL中，于37 ℃恒溫水浴中振蕩(100 r·min-1)，每隔30 min移取1 mL釋放介質(zhì)，用HPLC檢測樣品中胰島素含量，同時補充同溫同體積的釋放介質(zhì)。

2結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)條件優(yōu)化

(1) PSA的活化

環(huán)氧氯丙烷分子中含有高活性易于進行取代反應(yīng)的氯離子以及易于開環(huán)聚合的環(huán)氧結(jié)構(gòu)，在聚合物合成、介質(zhì)交聯(lián)中具有方便、快速、活化率高、毒性低等特點而得到廣泛應(yīng)用。本研究采用環(huán)氧氯丙烷活化PSA，進行單因素試驗，分別考察了環(huán)氧氯丙烷濃度、氫氧化鈉濃度、活化時間和活化溫度對PSA上環(huán)氧基活化密度的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，基于獲得高環(huán)氧基活化密度為目標，綜合考慮各因素的影響，得出最佳反應(yīng)條件為：環(huán)氧氯丙烷濃度6%(V/V)，氫氧化鈉濃度0.7%(w/V)，活化時間4 h，活化溫度35 ℃，其環(huán)氧基活化密度可以達到1.5 mmol·g-1。

該方法制得的活化PSA沒有發(fā)現(xiàn)不溶物，但由于PSA是大分子，本身活化過程不易進行，且活化反應(yīng)的產(chǎn)物因帶有環(huán)氧基可以繼續(xù)與PSA上的羥基反應(yīng)生成交聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物，生成的交聯(lián)產(chǎn)物又可與活化產(chǎn)物或環(huán)氧氯丙烷發(fā)生反應(yīng)生成更進一步的交聯(lián)產(chǎn)物，因此活化的時間不宜過長，已活化的PSA需盡快進行下一步反應(yīng)。

(2) P的合成

將已活化PSA與HA反應(yīng)合成PSA-HA聚合物P， PSA與HA的質(zhì)量比[x=m(PSA) ∶m(HA)]對透析液中PSA含量和P接枝率的影響見圖2。由圖2可見，P的接枝率為40%～89%；當(dāng)x=1 ∶1～2 ∶1時，PSA得到高效利用，接枝率高達87%～89%；而當(dāng)x>2 ∶1后，PSA的利用率逐漸下降。這是由于HA的量固定，提高PSA的量，并不能增加HA上連接的PSA量。但由于HA分子量較大，在體內(nèi)降解速率較快，如聚合物中HA所占比例越大，其降解速度越快。因此選擇x=2 ∶1制備PSA-HA聚合物(P2)進行下一步反應(yīng)，以期提高PSA的量，降低聚合物的降解速率和提高藥物的附載量。

環(huán)氧氯丙烷濃度/(V/V)

NaOH/(w/V)

活化溫度/℃

m(PSA) ∶m(HA)

2.2表征

(1) SEM

PSA, HA和P2的掃描電鏡分析結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，PSA為片狀；HA為枝狀，形狀規(guī)則，結(jié)構(gòu)疏松，易和PSA發(fā)生接枝合成反應(yīng)；P2中可以看到交錯枝狀分子上包裹有片狀物質(zhì)，推測其為PSA，交錯枝狀分子為HA，可初步判斷PSA與HA發(fā)生了接枝合成反應(yīng)。

PSAHA

P2

(2) FT-IR

圖4為PSA, HA和P2的IR譜圖。由圖4可見，HA和PSA在3 450 cm-1處出現(xiàn)O—H與N—H的伸縮振動吸收峰重疊而成的寬峰，說明羥基和氨基之間存在著強弱不同的分子內(nèi)或分子間氫鍵，峰寬的差異反映了氫鍵的強弱。P2在3 385 cm-1處強而寬的吸收峰，可能是由于PSA與HA結(jié)合后增強了羥基和氨基之間的氫鍵，使吸收加強；2 892 cm-1處吸收峰為HA和PSA上的甲基和次甲基的C—H伸縮振動吸收峰；1 738 cm-1和1 616處的吸收峰分別為HA上的(COO-)和酰胺帶Ⅲ的特征吸收峰，表明P2上有HA的特征吸收峰；PSA上的1 433 cm-1處吸收峰消失，1 102 cm-1處吸收峰發(fā)生遷移，HA上1 151 cm-1處吸收峰發(fā)生遷移。上述分析表明PSA和HA發(fā)生了有效的接枝合成反應(yīng)。

ν/cm-1

(3) 元素分析

PSA, HA和P2的元素分析結(jié)果見表1。由表1可以看出，PSA的N和C含量相對較少，而純HA的N和C含量分別為3.87%與39.79%， P2的N和C含量介于兩者之間，進一步證明PSA與HA接枝合成成功。通過C和N含量利用元素分析法[22]計算得P2的接枝率為88%。

表1　PSA, HA和P2的CHN元素分析結(jié)果

(4) Zeta電位

PSA, HA和P2的電位分布測試結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，當(dāng)pH<3時，P2帶正電荷；當(dāng)pH>3時，P2帶負電，隨著pH增大，出現(xiàn)了電荷由正到負的轉(zhuǎn)變。對比HA和PSA發(fā)現(xiàn)，P2的電荷介于兩者之間，這是由于在低pH環(huán)境下，HA上的基團質(zhì)子化程度較大，使得P2的凈電荷為正，Zeta電位值為正。隨著pH值升高，HA上的羧酸根電離程度增大，使得Zeta電位值遞減較PSA的快，進而P2的Zeta電位值也逐漸遞減，從帶正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж撾姾?，而由于HA與PSA存在相互作用，受PSA的影響，P2的電位值小于HA的電位。因而，當(dāng)pH>3時，P2由于所帶負電荷逐漸增加，利用靜電作用，P2可作為帶相反電荷多肽類藥物的載體。

pH

2.3P2包埋胰島素及表征

為了考察P2對多肽類藥物的緩釋能力，以胰島素為模型蛋白進行包埋實驗。胰島素的羧基隨pH升高而逐漸電離，只要pH低于其等電點(等電點為5.4)，胰島素分子始終帶正電。因此，選擇pH在3.0～5.4之間，通過改變P2與胰島素的質(zhì)量比，考察P2的包封率和載藥率的變化，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，P2的包封率和載藥率與胰島素的添加量有關(guān)，當(dāng)二者質(zhì)量比小于6 ∶3時，包封率增加，載藥率上升，說明P2與胰島素具有良好的親和力；隨著胰島素添加量的增加，質(zhì)量比高于6 ∶3時，載藥率上升緩慢，包封率下降。這是因為聚合物對于胰島素的負載能力是有一定限度的，即呈現(xiàn)飽和性。綜合考慮包封率與載藥率，當(dāng)P2與胰島素質(zhì)量比為6 ∶3時，包封率較高(≥85%)，同時載藥率也較高(≥38%)，效果最佳。因此，選擇P2與胰島素質(zhì)量比為6 ∶3進行后續(xù)試驗。

m(P2) ∶m(胰島素)

對P2載胰島素進行電鏡掃描，結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，P2粒子大小為1～10 μm。通過Zeta電位儀檢測粒度平均大小為3.2 μm，屬于小腸有效吸收的范圍。2004年，Jederstrom等[16]曾用HA和重組生長激素(rhGH)在低pH(<3)下混合制備成了小于1 nm的粒子；用HA復(fù)合胰島素后得到了2～10 nm大小的復(fù)合物，溶液澄清透明。而本實驗中P2/胰島素復(fù)合物簇擁成團，這可能是在透析過程中，由于透析袋內(nèi)溶液(初始pH為2.0)與Tris緩沖液(初始pH為6.5)中和，使得透析袋內(nèi)溶液pH值不斷升高，胰島素的羧基逐漸電離，只要pH值低于其等電點5.4，胰島素分子始終帶正電；P2在pH 3.0以上時，帶負電。從而在pH 3.0～5.4間，P2與胰島素之間的電荷吸引力成為主導(dǎo)，而HA分子量大導(dǎo)致形成了聚離子復(fù)合物。

圖7 P2載胰島素掃描電鏡圖

2.4P2包埋胰島素體外釋放試驗

以pH 1.2鹽酸溶液、pH 7.4 PBS緩沖液分別模擬胃液和腸液pH環(huán)境，考察P2載胰島素在不同pH介質(zhì)中釋放胰島素的情況，結(jié)果見圖8。由圖8可以看出，在pH 1.2鹽酸溶液中，胰島素的釋藥速度大于在pH 7.4的PBS緩沖液中的釋藥速度，在6 h內(nèi)逐漸釋放率為89%。聚離子復(fù)合物主要靠聚離子與兩性大分子上電荷基團相互靜電引力形成，當(dāng)外界環(huán)境pH偏離等電點時，電荷性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致復(fù)合物解離，胰島素釋放出來。在pH 1.2條件下的釋藥速度較快，一方面可能是由于PSA在酸性條件下較活潑，容易從聚合物上解離下來，導(dǎo)致聚合物的性質(zhì)發(fā)生變化，另一方面與介質(zhì)的pH值遠遠偏離等電點有關(guān)，當(dāng)介質(zhì)在pH 2.0以下時，P2帶正電荷(如圖5所示)，而胰島素在介質(zhì)pH低于5.4時也帶正電荷。所以在pH 1.2 的介質(zhì)中，P2很快解離，胰島素釋放較快。

時間/h

利用聚唾液酸(PSA)和透明質(zhì)酸(HA)為基質(zhì)材料，通過環(huán)氧氯丙烷合成了系列PSA-HA聚合物(P1～P5, PSA與HA質(zhì)量比分別為1 ∶1～5 ∶1)，合成率40%～89%。最佳合成條件為：環(huán)氧氯丙烷濃度6%(V/V)，氫氧化鈉濃度0.7%(w/V)，活化時間4 h，活化溫度35 ℃， PSA與HA質(zhì)量比為2 ∶1時合成達到飽和。

以胰島素為模型藥物，將PSA-HA聚合物與胰島素混合，當(dāng)PSA-HA ∶胰島素質(zhì)量比為2 ∶1時，既能達到較高的包封率(≥85%)又可達到較高的載藥率(≥38%)，平均粒徑為3.2 μm。體外釋放試驗表明：包封胰島素在6 h內(nèi)釋藥89%；由于在pH 1.2的介質(zhì)中，復(fù)合物很快解離，胰島素釋放較快，使得在pH 1.2條件下的釋藥速度大于pH 7.4條件下的釋藥速度。因此，PSA-HA作為新的聚合物有望成為多肽類藥物的緩釋載體。

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收稿日期：2015-08-25;

修訂日期:2016-02-25

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK2011158)

作者簡介：付浩(1990-),男,漢族,貴州遵義人,碩士研究生,主要從事糖生物工程的研究。 E-mail: fhao005@163.com 通信聯(lián)系人： 吳劍榮，碩士生導(dǎo)師， E-mail: kinowu@jiangnan.edu.cn

中圖分類號：O63; R318.08

文獻標志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.07.15299

Preparation and Application of Polysialic Acid-Hyaluronan Grafted Polymer as Drug Delivery Carrier

FU Hao,FENG Chang-yu,ZHAN Xiao-bei,ZHU Li,WU Jian-rong*

(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract：The grafted polymers(P1～P5) with different mass ratio(1 ∶1～1 ∶5) of hyaluronic acid with polysialic acid were prepared by reaction of hyaluronic acid(HA) with activated polysialic acid(PSA) by epichlorohydrin under alkaline conditions. The synthetic ratio was about 40%～89%. The structures were characterized by FT-IR, elemental analysis and SEM. Taking insulin as a model drug, when the P2and insulin were mixed by the ratio of 2 ∶1(m/m), the encapsulation efficiency and drug loading was 85% and 38%, respectively. The average particle size was 3.2 μm. In vitro release test showed a slow-release capability of the embedding insulin by P2. The drug release rate reached 89% within 6 h. The drug release rate was faster in pH 1.2 than that in pH 7.4.

Keywords：polysialic acid; hyaluronan; grafted polymer; preparation; insulin; drug delivery