周 藝，聶玉強(qiáng)，林 泳，杜艷蕾

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510180

miR-181a及其靶基因Atg5在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

周 藝，聶玉強(qiáng)，林 泳，杜艷蕾

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510180

目的 研究miR-181a及其靶基因Atg5在人胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株(MGC-803、SGC-7901、BGC-823)和正常胃黏膜細(xì)胞株(GSE-1)，收集30例胃癌血清和手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織，并以30名正常人血清標(biāo)本為對(duì)照，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)血清、細(xì)胞株、組織中miR-181a及細(xì)胞株、組織中Atg5 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 胃癌細(xì)胞株、組織、血液中miR-181a的表達(dá)較正常細(xì)胞、癌旁正常組織及正常人血清明顯升高(P<0.05)；Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量在胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中均分別低于正常胃黏膜細(xì)胞株和癌旁正常組織(P<0.05)。在胃癌組織和癌旁正常組織中，miR-181a與Atg5 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 miR-181a在胃癌細(xì)胞株、胃癌組織和血清中顯著高表達(dá)，提示其有望成為潛在的胃癌標(biāo)志物。Atg5在胃癌中低表達(dá)并與miR-181a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示其可能是miR-181a在胃癌中的潛在作用靶基因。

胃癌；miR-181a；Atg5；RT-PCR

在世界范圍內(nèi)，胃癌正嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。microRNA(miRNA)參與了腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等多種惡性生物學(xué)行為的調(diào)控[2]。miRNA通過(guò)其“種子區(qū)”與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的完整配對(duì)，使mRNA降解或者抑止mRNA的翻譯，從而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)[3]。我們課題組前期通過(guò)基因芯片和qRT-PCR證實(shí)miR-181a作為癌基因在胃癌的進(jìn)展中起重要作用[4-5]。自噬是細(xì)胞一個(gè)有高度保護(hù)作用的代謝途徑，能降解異常的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，是保護(hù)細(xì)胞癌變的一個(gè)機(jī)制[6]。

自噬也是惡性腫瘤形成及惡性腫瘤發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵步驟，一些自噬相關(guān)蛋白(如:Bif-1、Beclin1、Atg4C、Atg5、UVRAG)具有腫瘤抑制活性[7-8]。Tekirdag等[9]研究發(fā)現(xiàn)Atg5是miR-181a的靶基因，miR-181a的過(guò)表達(dá)會(huì)減少Atg5蛋白和mRNA的表達(dá)水平，miR-181a是一種新的自噬調(diào)控通路。因此，本研究探討miR-181a、Atg5的表達(dá)水平在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義，為胃癌的診治等提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、血液組織標(biāo)本來(lái)源 GES-1、BGC-823、MGC-803均由南方醫(yī)科大學(xué)消化科惠贈(zèng)，SGC-7901購(gòu)自南京凱基生物。配對(duì)胃癌組織血液標(biāo)本30例，其中高分化腺癌1例，中分化腺癌16例，低分化腺癌13例;18例有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。25例為外科手術(shù)切除病灶獲得，5例胃鏡活檢所得，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，全部病例收取標(biāo)本前均未行放療、化療。對(duì)照組外周血為在廣州市第一人民醫(yī)院住院的非腫瘤患者(經(jīng)胃、腸鏡、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查排除腫瘤)，以急性胃腸炎、功能性胃腸病等疾病為主，并排除合并有胃腸道息肉、胃潰瘍、炎癥性腸病等共30例。標(biāo)本取出立即放液氮速凍后存放在-80 ℃冰箱。血液用抗凝管采集1～2 h，3 000 r/min離心置于-80 ℃冰箱，用于提取總RNA 或microRNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 miR-181a及內(nèi)參U6由Qiagen公司設(shè)計(jì)合成，Atg5自UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/) 查找基因序列，用Primer-Express 2.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA和miRNA提?。河肨RIZOL提取細(xì)胞和組織中的總RNA，血液中miRNA按QIGEN血清中提取miRNA試劑盒的操作說(shuō)明，檢測(cè)OD260/280值，判斷純度；RNA樣品在1%瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA中的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA條帶，3條條帶完整即證明總RNA抽提比較完整。

1.3.2 miR-181a的檢測(cè)：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)miR-181a的表達(dá)：按照QIGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明合成cDNA，qRT-PCR使用的是MJ Research熒光定量PCR儀和Opticon Monitor 2軟件操作系統(tǒng)，PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自QIGEN，U6和miR-181a的PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，15 min，PCR反應(yīng)：94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s。對(duì)55 ℃到95 ℃升溫過(guò)程進(jìn)行全程熒光信號(hào)收集，繪制溶解曲線。以U6作為內(nèi)參，用2-△△Ct比較目的基因在癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)差異。

1.3.3 Atg5 mRNA的檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)組織中Atg5的表達(dá)，總mRNA提取，mRNA濃度、純度及完整性測(cè)定方法與上述相同：按照TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA，PCR反應(yīng)條件為： 預(yù)變性95 ℃，30 s，1個(gè)循環(huán)； PCR反應(yīng)：95 ℃，5 s；60 ℃，20 s；40個(gè)循環(huán)，融解曲線分析 95 ℃，60 s；65 ℃，60 s；從65 ℃開(kāi)始每1 s加熱0.1 ℃直至95 ℃。用U6作為內(nèi)參進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-181a的表達(dá)量 胃癌細(xì)胞株中miR-181a的表達(dá)量均高于正常胃黏膜細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)量(P<0.05)，而MGC-803、 SGC-7901、BGC-823 三種癌細(xì)胞柱間miR-181a的表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-181a在正常組織和胃癌組織中的mRNA的表達(dá)量分別為1.0021和3.1205，而在血液中mRNA 的表達(dá)量正常組為 0.4536，胃癌組為1.2702，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

注：1組為組織中miR-181a含量水平;2組為血液中miR-181a含量水平，與正常組比較，*P<0.05。

圖1 胃癌組與正常組miR-181a的表達(dá)量比較

Fig 1 Comparison of miR-181a expression between gastric cancer group and control group

2.2 Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量 胃癌細(xì)胞株中Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常胃黏膜細(xì)胞株(P<0.05)，MGC-803、 SGC-7901、BGC-823 三種癌細(xì)胞株間Atg5 的表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Atg5 在正常組和胃癌組組織中表達(dá)量分別為0.6896和0.2429，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Atg5表達(dá)與miR-181a表達(dá)的關(guān)系 在正常細(xì)胞株和胃癌細(xì)胞株中Atg5與miR-181a呈負(fù)相關(guān)(r=-0.999，P<0.05)。在30例胃癌組織中28例Atg5的表達(dá)降低，26例的miR-181a高表達(dá)，顯示在胃癌組織中Atg5與miR-181a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.459，P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 胃癌組織中Atg5與miR-181a的相關(guān)性分析

Fig 2 Correlation analysis of Atg5 and miR-181a expression in gastric cancer

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性的19～25個(gè)核苷酸組成的小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，經(jīng)由核糖核酸酶Drosha和Dice切割。miR-181家族的成員有4個(gè)：miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR181d，研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)mRNAs受這4個(gè)成員的調(diào)控，而miR-181a是其中重要的一員，能通過(guò)與Bcl-2等基因的靶向調(diào)節(jié)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在口腔癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌等腫瘤的形成和發(fā)展中起重要作用。Yang 等[10 ]發(fā)現(xiàn)miR-181可調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，在口腔癌中呈高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲及不良預(yù)后密切相關(guān)。Guo 等[11]通過(guò) qRT-PCR 等方法發(fā)現(xiàn)miR-181家族4個(gè)成員在人胃癌細(xì)胞系中與正常胃黏膜細(xì)胞相比表達(dá)均上調(diào)。

Huang等[12]發(fā)現(xiàn)某些miRNA調(diào)控的mRNA參與自噬過(guò)程，包括miR-181a和miR-374a。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-181a抑制劑能增加Atg5蛋白表達(dá)，Tekirdag等[13]發(fā)現(xiàn)在饑餓和雷帕霉素兩種常見(jiàn)的自噬應(yīng)激條件下都有miR-181a的過(guò)表達(dá)。miR-181a作為一個(gè)新的分子調(diào)控自噬通路，在細(xì)胞自噬調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。miR-181a的過(guò)表達(dá)會(huì)減少Atg5蛋白和mRNA的表達(dá)水平，由于在Atg5基因的3’UTR區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了MRE作為miR-181a的應(yīng)答區(qū)域，且這段序列的突變會(huì)影響到miRNA的作用，因此在細(xì)胞自噬過(guò)程中，Atg5是作為miR-181a的限速靶基因和重要因素。根據(jù)本研究結(jié)果miR-181a高表達(dá)，推測(cè)miR-181a升高引起自噬活性抑制導(dǎo)致自噬基因Atg5表達(dá)下調(diào)有關(guān)，即隨著淋巴轉(zhuǎn)移的增加，miR-181a 蛋白的表達(dá)水平也隨之升高；隨著細(xì)胞分化程度降低，Atg5的 mRNA表達(dá)水平也隨之下降。提示胃癌的發(fā)生、發(fā)展與miR-181a和Atg5 密切相關(guān)。因此，結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們認(rèn)為：在胃癌中miR-181a的高表達(dá)引起Atg5的表達(dá)降低，從而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。胃癌患者血清中miR-181a表達(dá)量明顯上調(diào)，可作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯：李 健)

Expression and clinical significance of miR-181a and its target gene Atg5 in gastric cancer

ZHOU Yi, NIE Yuqiang, LIN Yong, DU Yanlei

Department of Gastroenterology, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China

Objective To study expressions of miR-181a and its target gene Atg5 in human gastric cancer tissue and cell lines and to investigate whether these two genes expression changes were related with the clinicopathological parameters. Methods The miRNA levels of both miR-181a and Atg5 were detected by qRT-PCR in the gastric cancer cell line (MGC-803, SGC-7901 and BGC-823) and normal gastric mucosa cell lines (GSE) in vitro, in the gastric adenocarcinoma tissue and the adjacent to non-carcinoma tissue specimens from 30 gastric cancer patients. qRt-PCR was used to detect miR-181a expression in the serum of 30 gastric cancer patients and 30 healthy people. Results The expression of miR-181a in gastric cancer cells, serum and the gastric cancer tissue was increased significantly compared with the cells and the serum of healthy controls groups, and also the adjacent to non-carcinoma specimens (P<0.05). Atg5 mRNA expression in gastric cancer cells and the gastric cancer tissue was significantly lower than that in normal gastric mucosa cell lines and normal tissue adjacent to carcinoma (P<0.05). miR-181a mRNA expression had a negative correlation with Atg5 mRNA expression in gastric cancer tissue and normal tissue adjacent to carcinoma. Conclusion In gastric cancer cell lines, cancer tissue and serum of gastric cancer patients, miR-181a expression is significantly elevated, suggesting that it may be the potential markers for gastric carcinoma. Atg5 has low expression in gastric cancer and has a negative correlation with miR-181a, suggesting it may be the potential target gene of miR-181a in gastric cancer.

Gastric cancer; MiR-181a; Atg5; RT-PCR

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.010

國(guó)家自然科學(xué)基金(813802078)

周藝，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤。E-mail：158005515@qq.com

聶玉強(qiáng)，主任醫(yī)師，博士，E-mail：158005515@qq.com

R735.2

A

1006-5709(2016)03-0276-03

2015-05-12