袁小剛， 黃艷娟， 章任兵， 胡紅松

深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 1. 消化內(nèi)科； 2. 婦產(chǎn)科； 3. 病理科，廣東 深圳 518172

Tregs及巨噬細(xì)胞在幽門螺桿菌相關(guān)的不同病變中浸潤差異研究

袁小剛1， 黃艷娟2， 章任兵3， 胡紅松1

深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 1. 消化內(nèi)科； 2. 婦產(chǎn)科； 3. 病理科，廣東 深圳 518172

目的 分析幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)陽性和陰性的慢性淺表性胃炎、胃潰瘍標(biāo)本中 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Tregs)及巨噬細(xì)胞浸潤差異，探討Tregs及巨噬細(xì)胞在H.pylori致病中的作用。方法 168例慢性淺表性胃炎、胃潰瘍標(biāo)本中，H.pylori陽性89例，H.pylori陰性79例，采用免疫組化(IHC)檢測病理標(biāo)本中Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果H.pylori陽性組胃黏膜標(biāo)本中Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤程度顯著高于H.pylori陰性組(P<0.01)；在H.pylori陽性病變組中，慢性淺表性胃炎組與胃潰瘍組比較，Tregs浸潤程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而巨噬細(xì)胞在胃潰瘍組中浸潤程度顯著高于慢性淺表性胃炎組(P<0.01)；在H.pylori陰性病變患者中，Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論H.pylori感染后 Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量均顯著增加，前者抑制黏膜局部免疫反應(yīng)，后者增加局部黏膜損傷，兩者浸潤差異及比例失衡可能是導(dǎo)致H.pylori感染后產(chǎn)生不同病變結(jié)局的原因之一。

幽門螺桿菌；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；免疫反應(yīng)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染后，可刺激機(jī)體募集多種炎癥細(xì)胞聚集在胃黏膜層，從而產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，包括宿主固有免疫應(yīng)答和獲得性H.pylori特異性T細(xì)胞及B細(xì)胞相關(guān)的免疫應(yīng)答，這些免疫應(yīng)答可能清除體內(nèi)H.pylori，同時(shí)導(dǎo)致黏膜不同程度的炎癥及損傷。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)可抑制病原微生物感染后機(jī)體產(chǎn)生的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，從而減輕組織的免疫損傷，但同時(shí)也保護(hù)了病原微生物，造成病原微生物的慢性持續(xù)感染[1]。巨噬細(xì)胞具有吞噬、抗原遞呈及分泌細(xì)胞因子等多種生物學(xué)功能，在促進(jìn)炎癥反應(yīng)、清除病原微生物等多種生物學(xué)過程中扮演了重要角色。

H.pylori感染機(jī)體后，Tregs及巨噬細(xì)胞均會被募集至胃黏膜組織中，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。然而，在H.pylori相關(guān)的不同胃黏膜病變中，這種募集是否存在差異以及Tregs和巨噬細(xì)胞浸潤差異是否可能成為H.pylori感染后致胃黏膜形成不同病變的原因之一？本研究以人體胃竇黏膜標(biāo)本為研究對象，采用IHC法比較H.pylori相關(guān)的不同病變中胃黏膜Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤差異，旨在探討Tregs及巨噬細(xì)胞在人H.pylori感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 168例胃竇黏膜標(biāo)本均取自因上消化道癥狀就診的患者，通過內(nèi)鏡及活檢病理診斷為慢性淺表性胃炎者80例，胃潰瘍者88例，患者行胃鏡檢查時(shí)，在幽門前2 cm胃竇小彎側(cè)活檢胃竇黏膜2塊置于中性甲醛中固定。H.pylori陽性組共納入89例，其中淺表性胃炎者42例，胃潰瘍者47例；H.pylori陰性組共納入79例，其中淺表性胃炎者38例，胃潰瘍者41例。試劑：濃縮型鼠抗人Foxp3單克隆抗體(ab22510，美國abcam公司)，工作濃度均為1∶300(體積比)；濃縮型鼠抗人巨噬細(xì)胞單克隆抗體(ab22506，美國abcam公司)，工作濃度均為1∶500(體積比)；PV-9000第二代通用型二步法IHC染色試劑盒及濃縮型 DAB 試劑盒(614864A；3 ml)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori檢測：胃竇黏膜石蠟標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片, 行病理常規(guī)HE染色，采用改良Giemsa 染色方法檢測H.pylori。Giemsa染液配制： 2 g Giemsa染料，加入蒸餾水100 ml，過濾。染色主要步驟：(1) 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；(2)蒸餾水洗3遍，滴染Giemsa染液，25 min后自來水稍洗，95%酒精分化3次，100%酒精分化2次，自然晾干、封片?；颊呶哥R檢查前行14C呼氣試驗(yàn)檢查，以改良Giemsa染色，14C呼氣試驗(yàn)兩項(xiàng)檢查均陽性者判斷為H.pylori陽性，兩項(xiàng)檢查均陰性者判斷為H.pylori陰性(見圖1)。

1.2.2 Treg及巨噬細(xì)胞檢測：均采用IHC二步法，主要步驟: (1) 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；(2) 3%過氧化氫浸泡8 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(3) 切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐熱修復(fù)抗原15 min；(4) 分別滴加新鮮配制的鼠抗人Foxp3單克隆抗體，工作濃度均為1∶300(體積比)；鼠抗人巨噬細(xì)胞單克隆抗體，工作濃度均為1∶500(體積比)；4 ℃冰箱恒溫過夜；(5) 滴加聚合酶輔助劑(Polymer Helper)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min；(6)滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37 ℃恒溫孵育30 min；(7)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。對照：淋巴結(jié)組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：以細(xì)胞核染成棕黃色為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞及所有炎癥細(xì)胞，Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤比率=陽性細(xì)胞數(shù)/總炎癥細(xì)胞數(shù)，以該比率的平均值作為Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤程度。

2 結(jié)果

2.1 Tregs及巨噬細(xì)胞在H.pylori陽性與陰性病變組中的浸潤情況 IHC研究結(jié)果顯示H.pylori陽性組胃黏膜Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤程度顯著高于H.pylori陰性組[(8.9±0.9)%vs(2.4±0.3)%、(15.3±1.2)%vs(8.2±0.7)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 Tregs及巨噬細(xì)胞在H.pylori陽性患者不同病變組中的浸潤情況 在H.pylori陽性病變患者中，Tregs在慢性淺表性胃炎組與胃潰瘍組中的浸潤程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(9.0±0.5)%vs(8.7±0.4)%,P>0.05]，而巨噬細(xì)胞在胃潰瘍組中浸潤程度顯著高于慢性淺表性胃炎組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(18.2±1.3)%vs(11.3±0.9)%,P<0.01](見圖1)。

圖1 Tregs及巨噬細(xì)胞在不同病變中的浸潤情況及H.pyloriA：潰瘍組巨噬細(xì)胞(400×)；B：慢性淺表性胃炎組巨噬細(xì)胞(400×)；C：潰瘍組Tregs(400×)；D：改良Giemsa顯示H.pylori(400×)

Fig 1 Tregs and macrophages infiltrated in different lesions andH.pyloriA: macrophages infiltrated in gastric ulcer lesions (400×); B: macrophages infiltrated in chronic superficial gastritis lesions (400×); C: Tregs infiltrated in gastric ulcer lesions (400×); D: modified Giemsa showedH.pylori(400×)

2.3 Tregs及巨噬細(xì)胞在H.pylori陰性患者不同病變組中的浸潤情況 在H.pylori陰性病變患者中，Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(2.5±0.2)%vs(2.2±0.2)%, (8.3±0.4)%vs(8.0±0.4)%,P>0.05](見圖1)。

3 討論

全球半數(shù)以上人群感染H.pylori[3]，我國普通人群H.pylori感染率在60%左右。已證實(shí)H.pylori是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃MALT淋巴瘤的主要病因，同時(shí)也是胃癌的Ⅰ類致癌原。然而，不同地域、同一地域不同個(gè)體，或同一個(gè)體不同時(shí)間或空間，H.pylori感染的結(jié)局不盡相同，有的是慢性胃炎或消化性潰瘍，有的可能直接發(fā)展為胃癌。目前多數(shù)學(xué)者[4]認(rèn)為H.pylori感染后產(chǎn)生的不同結(jié)局是由H.pylori菌株、個(gè)體與環(huán)境3種因素相互作用所致。然而，其具體機(jī)制尚不清楚。

獲得性H.pylori特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答分為Th1型和Th2型。Th1型免疫反應(yīng)釋放大量細(xì)胞因子，如IL-12、IL-18、TNF-α、IFN-1等作用于B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，使其在胃黏膜局部增殖、分化、激活，產(chǎn)生特異性和非特異性免疫反應(yīng)，過度Th1型免疫反應(yīng)可造成胃黏膜組織炎性損傷，導(dǎo)致胃十二指腸潰瘍等[5-8]。而Th2型免疫反應(yīng)具有免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制Th1型免疫應(yīng)答，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)損傷組織修復(fù)、潰瘍愈合。有研究[9]顯示H.pylori感染機(jī)體后，激活宿主抗原提呈細(xì)胞，募集大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤至胃黏膜層，誘導(dǎo)以Th1型免疫應(yīng)答為主的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制Th2型免疫反應(yīng)，減少B細(xì)胞分泌IgA，造成免疫系統(tǒng)不足以清除H.pylori，致H.pylori持續(xù)慢性感染。本研究發(fā)現(xiàn)H.pylori陽性的病變胃黏膜中Tregs及巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量均顯著多于H.pylori陰性者，提示H.pylori感染后，Tregs及巨噬細(xì)胞被募集至胃黏膜組織中，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

巨噬細(xì)胞在不同的刺激因子作用或微環(huán)境下可極化成不同的表型，根據(jù)極化后細(xì)胞表面標(biāo)志分子及其功能的不同，可將巨噬細(xì)胞分為M1和M2型。M1型巨噬細(xì)胞能高效遞呈抗原、分泌大量促炎細(xì)胞因子，是激活Th1細(xì)胞反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，具有抗病原微生物等作用。相反，M2型巨噬細(xì)胞以發(fā)揮Th2型免疫反應(yīng)為主，可抑制Th1免疫反應(yīng)，具有促進(jìn)損傷組織修復(fù)等功能。有研究[10]發(fā)現(xiàn)H.pylori感染后, 巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如 IL-1β、IL-6及TNF-α顯著升高。這提示H.pylori感染后，胃黏膜層募集的巨噬細(xì)胞極化為M1型為主。智利一項(xiàng)以5～18歲未成年人為調(diào)查對象的研究[11]發(fā)現(xiàn)H.pylori陽性患者胃黏膜組織勻漿中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α顯著高于H.pylori陰性患者，潰瘍患者IL-1β和IL-8的濃度顯著高于非潰瘍患者。本研究發(fā)現(xiàn)在H.pylori陽性病變組中，巨噬細(xì)胞在胃潰瘍組中浸潤程度顯著高于慢性淺表性胃炎組，這提示在H.pylori相關(guān)性潰瘍患者中，胃黏膜內(nèi)聚集的巨噬細(xì)胞以M1型為主，發(fā)生Th1型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢，當(dāng)Th1型免疫應(yīng)答得不到有效的免疫調(diào)節(jié)時(shí)，過度的Th1型免疫反應(yīng)可能造成黏膜損傷，從而形成潰瘍。因此，本研究結(jié)果提示胃黏膜內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤差異在H.pylori感染后形成不同結(jié)局中發(fā)揮了重要的作用。

Tregs可通過細(xì)胞接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子等方式抑制功能性T細(xì)胞，從而抑制Th1型免疫反應(yīng)，增強(qiáng)Th2型免疫反應(yīng)。研究顯示H.pylori感染后胃黏膜內(nèi)Tregs顯著增加，Tregs 可調(diào)節(jié)H.pylori感染所產(chǎn)生的Th1型免疫反應(yīng)，減輕組織損傷，但同時(shí)也導(dǎo)致H.pylori逃逸免疫清除[12-13]。本研究顯示H.pylori陽性胃竇黏膜中Treg浸潤顯著高于H.pylori陰性者，但在H.pylori陽性組中，Tregs浸潤程度在慢性淺表性胃炎組與胃潰瘍組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果提示在H.pylori感染后，Tregs可能與巨噬細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答，避免Th1型免疫反應(yīng)過度造成組織損傷，使得Th1/Th2免疫反應(yīng)達(dá)到一種平衡狀態(tài)，黏膜損傷及修復(fù)平行進(jìn)行，從而導(dǎo)致胃黏膜炎癥持續(xù)慢性存在，這就形成了H.pylori相關(guān)性慢性胃炎；當(dāng)巨噬細(xì)胞浸潤密度顯著增高或相對增高時(shí)，Tregs不足以調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的Th1型免疫反應(yīng)時(shí)，Th1/Th2免疫應(yīng)答就失衡，Th1型免疫反應(yīng)占優(yōu)勢，過度的Th1型免疫反應(yīng)造成了胃黏膜組織炎性損傷，從而形成H.pylori相關(guān)性消化性潰瘍。

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(責(zé)任編輯：李 健)

Differences of Tregs and macrophages infiltrated inH.pylori-related lesions

YUAN Xiaogang1, HUANG Yanjuan2, ZHANG Renbing3, HU Hongsong1

1. Department of Gastroenterology; 2. Department of Obstetrics and Gynecology; 3. Department of Pathology, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518172, China

Objective To analyze the differences of Tregs and macrophages infiltrated in the tissue specimens ofH.pylori-positive andH.pylori-negative chronic superficial gastritis and gastric ulcer,and to investigate the role of Tregs and macrophages in the pathogenesis ofH.pyloriinfection. Methods A total of 168 biopsies of chronic superficial gastritis and gastric ulcer were recruited, included 89H.pylori-positive and 79H.pylori-negative patients. Immunohistochemistry(IHC) was used to semi-quantify the number of Tregs and macrophages infiltrated in gastric mucosa.Results The proportion of Tregs and macrophages infiltrated in gastric mucosa inH.pyloripositive group was significantly higher than that inH.pylorinegative group (P<0.01). In theH.pyloripositive group, there was no significant difference of Tregs infiltration between chronic superficial gastritis and gastric ulcer group (P>0.05), but the degree of macrophage infiltrated in the gastric ulcer group was significantly higher than that in chronic superficial gastritis group(P<0.01). In theH.pylorinegative group, there was no significant difference of Tregs and macrophages infiltration between two groups(P>0.05).Conclusion The number of Tregs and macrophages infiltrated inH.pylori-positive disease is significantly increased, the former suppresses the local mucosa immune response, while the latter increases local mucosal injury. The difference of Tregs and macrophage invasion or imbalance may be one of the causes of determining the different clinical outcomes.

Helicobacter pylori; Regulatory T cells; Macrophages; Immune response

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.012

深圳市龍崗區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.YS2013011, No.YLWS20150514112402687)；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20150402164314694)第一作者簡介：袁小剛，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：幽門螺桿菌及消化性腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:xiaogangyuan@hotmail.com

R573

A

1006-5709(2016)03-0283-04

2015-05-23