陳麗梅，康穎娜，程紅平，李貴春，方　科△

(1.江西省鷹潭市人民醫(yī)院腫瘤科　335000；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院腫瘤科　417000)

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HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌中的表達及其意義

陳麗梅1，康穎娜2，程紅平1，李貴春1，方科1△

(1.江西省鷹潭市人民醫(yī)院腫瘤科335000；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院腫瘤科417000)

[摘要]目的探討同源盒基因9(HOXB9)和E2F1在結(jié)腸癌中的表達及其是否存在相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)染色法和Western blot法檢測江西省鷹潭市人民醫(yī)院2012年1月至2015年1月65例結(jié)腸癌術(shù)后病理標(biāo)本中結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中HOXB9和E2F1蛋白的表達，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中均高表達(P<0.05)，HOXB9在結(jié)腸癌中的表達程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)(均P<0.05)；而E2F1在結(jié)腸癌中的表達程度與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)(均P<0.05)；HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論HOXB9和E2F1與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)，并且在其侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸腫瘤；基因，同源盒；HOXB9；E2F1；侵襲與轉(zhuǎn)移

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，近些年其發(fā)病率呈上升趨勢。盡管隨著新型腹腔鏡手術(shù)方式的開展和新型靶向藥物的應(yīng)用，結(jié)腸癌患者5年生存率已經(jīng)有了很大改善，但病死率仍高。主要死亡原因為腫瘤的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、WNT5α和KITENIN，但目前能應(yīng)用于臨床治療的靶向藥物主要靶點只有Ras基因和VEGF[1]。

HOXB9是HOX家族中的成員，包括39個基因，分為4個基因簇，分別是HOX A、B、C和D，并且分布在4條不同染色體上。HOX基因家族在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用，近些年的研究表明HOX基因家族在腫瘤中有表達，包括白血病、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌[2]。研究表明，HOXB9是WNT/T細胞因子4(TCF4)信號通路的靶基因，WNT/TCF4信號通路參與了細胞增殖、分化、胚胎分割和四肢形成等過程[3]。HOXB9還可通過上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑促進新生血管形成和遠處轉(zhuǎn)移從而促進乳腺癌進展[4]。研究表明，HOXB9蛋白在乳腺癌中表達上調(diào)并促進腫瘤進展，并且在乳腺癌中的研究顯示E2F1可以與HOXB9基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點結(jié)合，上調(diào)HOXB9的表達[5]。在實體標(biāo)本中免疫組織化學(xué)結(jié)果也證實HOXB9和E2F1表達存在顯著的相關(guān)性(P<0.01)。但在胃癌中表達卻下降，低表達的HOXB9與胃癌的不良預(yù)后有關(guān)[6]。

但在結(jié)腸癌中的觀點有分歧，Zhan等[2]認為HOXB9在分化良好的結(jié)腸癌患者組織中高表達，并且與較長的生存時間相關(guān)，并且體外實驗顯示HOXB9過表達可以抑制結(jié)腸癌細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。但Huang等[1]卻認為HOXB9在結(jié)腸癌組織中過表達，并且與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)HOXB9高表達，下調(diào)HOXB9表達后可以抑制癌細胞的遷移和侵襲能力，而增強HOXB9的表達卻能加強癌細胞的侵襲和遷移。筆者為了證實HOXB9在結(jié)腸癌中是否高表達，是否與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，開展了本研究，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取江西省鷹潭市人民醫(yī)院2012年1月至2015年1月經(jīng)病理確診的結(jié)腸癌術(shù)后新鮮標(biāo)本和石蠟包埋的病理標(biāo)本65例，分別選擇結(jié)腸癌陰性切緣(正常結(jié)腸組織，距腫瘤組織5～8 cm)和結(jié)腸癌組織進行切片。

1.2主要試劑免疫組織化學(xué)一抗為美國Molecular Tag公司原裝進口；多聚賴氨酸、SP二抗試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司進口分裝；Western blot一抗為兔抗人HOXB9多克隆抗體、兔抗人E2F1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)法采用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測人結(jié)腸癌術(shù)后標(biāo)本中腫瘤組織和陰性切緣中HOXB9和E2F1的表達部位及強度。操作步驟：切片4 μm，60 ℃烤片過夜；常規(guī)脫蠟水化，水洗；高溫、高壓修復(fù)5 min；滴加一抗4 ℃過夜；滴加二抗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃，20 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；顯微鏡觀察；圖像分析。

1.3.2Western blot法取術(shù)后新鮮病理標(biāo)本，在腫瘤組織和陰性結(jié)腸切緣進行取材，將組織剪碎，使用細胞裂解液提取蛋白。用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法進行蛋白水平測定。取75～100 μg蛋白在100 g/L進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉(zhuǎn)移至硝基纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶37 ℃封閉1 h，加入兔抗人一抗，于4 ℃孵育過夜；加入羊抗兔二抗常溫孵育1 h，在凝膠1次成像儀內(nèi)曝光成像，以β-actin為內(nèi)參照。

1.3.3結(jié)果判定HOXB9和E2F1染色陽性信號為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，每張切片選取5個高倍鏡視野(細胞計數(shù)200)，觀察陽性細胞染色強度并計數(shù)陽性細胞百分率。首先按照染色強度計分：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；再按照陽性細胞百分比計分：陽性細胞小于5%為0分；5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，大于或等于75%為4分。二者相乘為最后得分[7]。并采用最后得分作為染色程度進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果為等級資料，采用配對Wilcoxon秩和檢驗；病理學(xué)參數(shù)和免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)為等級資料，他們之間的相關(guān)性分析采用兩變量之間的Spearman秩相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)。

2結(jié)果

2.1HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌中高表達HOXB9和E2F1在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌中的免疫組織化學(xué)染色圖片，見圖1～4。從圖1、2的比較可以看出HOXB9在結(jié)腸癌細胞的細胞核中深染，呈棕黃色。在正常結(jié)腸組織細胞核中淡染。同一個視野下染色細胞數(shù)量較正常結(jié)腸組織中多，可以認為HOXB9在結(jié)腸癌中高表達；同樣，從圖3、4的比較可以看出E2F1在結(jié)腸癌細胞胞核中深染，在正常結(jié)腸組織中淡染，并且同一個視野下染色細胞較正常結(jié)腸組織明顯多。Western blot 結(jié)果也顯示腫瘤組織中HOXB9和E2F1高表達，正常結(jié)腸組織中少量表達，與免疫組織化學(xué)結(jié)果相符(圖5)。以免疫組織化學(xué)最后評分代表HOXB9和E2F1的免疫組織化學(xué)染色程度，其值的高低表示HOXB9和E2F1的表達程度高低。對正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中HOXB9和E2F1免疫組織化學(xué)染色評分進行配對樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗，HOXB9在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-6.943,P<0.05)，在結(jié)腸癌組織中高表達。E2F1在結(jié)腸癌組織中也處于高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-7.023，P<0.05)，見表1。

圖1　HOXB9在結(jié)腸癌組織中的表達(SP,×100)

圖2　HOXB9在正常結(jié)腸組織中的表達(SP,×100)

圖3　E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達(SP,×400)

圖4　E2F1在正常結(jié)腸組織中的表達(SP，×100)

圖5　HoxB9和E2F1的Western blot 成像結(jié)果

項目n免疫組織化學(xué)染色評分1分2分3分4分6分8分9分ZP正常結(jié)腸組織HOXB96594367000-6.9430.000結(jié)腸癌組織HOXB9650101537012正常結(jié)腸組織E2F165124265000-7.0230.000結(jié)腸癌組織E2F16500095015

2.2HOXB9的表達程度與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系將HOXB9在結(jié)腸癌的免疫組織化學(xué)染色評分結(jié)果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和病理分期(AJCC2003年版TNM分期)分別進行Spearman秩相關(guān)分析，HOXB9在結(jié)腸癌中的表達與性別、年齡、分化程度、浸潤深度無相關(guān)(P>0.05)，而HOXB9在結(jié)腸癌中的表達程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)(r=0.406、0.550、0.475，P<0.05)，見表2。

表2　HOXB9表達與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的Spearman秩相關(guān)分析

2.3E2F1的表達程度與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系同樣，將E2F1在結(jié)腸癌的免疫組織化學(xué)染色評分結(jié)果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和病理分期分別進行Spearman秩相關(guān)分析，E2F1在結(jié)腸癌中的表達與性別、年齡、分化程度均無相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而E2F1在結(jié)腸癌中的表達程度與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)(r=0.295、0.387、0.542、0.375，P<0.05)，見表3。

表3　E2F1表達與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的Spearman秩相關(guān)分析

2.4HOXB9與E2F1在結(jié)腸癌中的表達關(guān)系將HOXB9與E2F1在結(jié)腸癌中的表達程度作Spearman檢驗，HOXB9、E2F1在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達均無相關(guān)性(P>0.05)；而HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.356，P<0.05)，見表4。

表4　HOXB9與E2F1在結(jié)腸癌中表達的Spearman秩相關(guān)分析

3討論

結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，也是美國癌癥相關(guān)病死率中位于第2位，每年全球也有將近120萬新發(fā)結(jié)腸癌患者[8]。Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期結(jié)腸癌手術(shù)治療效果好，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌治療以化療為主，近幾十年以表皮生長因子受體(EGFR)、VEGF等靶點的分子靶向治療取得了很大進步。但這些靶向藥物通常需聯(lián)合化療，單獨應(yīng)用效果不佳，通常只能作為二、三線方案，或不適合化療的患者。因此更多的治療靶點有待挖掘。

HOXB9在多種腫瘤組織中高表達，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。研究顯示E2F1可以結(jié)合到HOXB9基因啟動子-404至-392核苷酸區(qū)域，促進基因轉(zhuǎn)錄，HOXB9可以活化TGFβ-ATM軸，引起細胞周期檢查點活化和啟動基因修復(fù)，從而使細胞從G1期到S期，啟動細胞增殖[5]。本研究結(jié)果顯示，HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中均高表達，在正常結(jié)腸組織中低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而且HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達程度與在相應(yīng)正常結(jié)腸組織中的表達程度無相關(guān)性(P>0.05)，也就是說在結(jié)腸癌組織中高表達并不受正常結(jié)腸組織中表達程度的影響?？梢哉J為HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌形成過程中發(fā)揮作用。

HOXB9在結(jié)腸癌中的表達程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高，HOXB9蛋白表達越高，有遠處轉(zhuǎn)移患者HOXB9表達越高，TNM分期越晚，其表達程度越高。而E2F1在結(jié)腸癌中的表達程度與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。同樣，結(jié)腸癌浸潤越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高，E2F1表達程度越高，有遠處轉(zhuǎn)移患者E2F1表達程度也越高，以及TNM分期越晚，其表達程度也越高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期正是結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的病理學(xué)參數(shù)，結(jié)合本研究結(jié)果，可以看出HOXB9和E2F1可能在結(jié)腸癌浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。并且在結(jié)腸癌組織中，HOXB9和E2F1的表達也呈正相關(guān)(P<0.05)，這與他們之間的相互作用關(guān)系有關(guān)。正是由于E2F1可以結(jié)合到HOXB9啟動子區(qū)域，促進其轉(zhuǎn)錄，如果能阻斷這一相互作用，就能有效抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程。

總之，HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中高表達，可能參與了結(jié)腸癌的形成過程，并且與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是否能針對HOXB9與E2F1研究有效的治療藥物還需要進行阻斷這一相互作用的藥物進行結(jié)腸癌動物模型的實驗。

參考文獻

[1]Huang K,Yuan R,Wang K,et al.Overexpression of HOXB9 promotes metastasis and indicates poor prognosis in colon cancer[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):72-80.

[2]Zhan J,Wang P,Niu M,et al.High expression of transcriptional factor HOXB9 predicts poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma[J].Histopathology,2015,66(7):955-965.

[3]Hatzis P,van del Flier LG,van Driel MA,et al.Genome-wide pattern of tcf712/tcf4 chromatin occupancy in colorectal cancer cells[J].Mol Cell Biol,2008,28(8):2732-2744.

[4]Chiba N,Comaills V,Shiotani B,et al.Homeobox b9 induces epithelial-to-mesenchymal transition-associated radioresistance by accelerating DNA damage responses[J].ProcNati Acad Sci U S A,2012,109(8):2760-2765.

[5]Zhussupova A,Hayashida T,Takahashi M,et al.An E2F1-HOXB9 transcriptional circuit is associated with breast cancer progression[J].PLoS One,2014,9(8):e105285.

[6]Sha S,Gu Y,Xu B,et al.Decreased expression of hoxb9 is related to poor overall survival in patients with gastric carcinoma[J].Dig liver Dis,2013,45(5):422-429.

[7]方科,莊建良,蘇子劍,等.成纖維細胞生長因子19和成纖維細胞生長因子受體4在食管鱗癌中的表達及其意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013，38(8):876-880.

[8]Recondo G,Diaz-Canton E,de la Vega M,et al.Advances and new perspectives in the treatment of metastatic colon cancer[J].World J Gastrointest Oncol,2014,6(7):211-224.

作者簡介：陳麗梅(1984-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。 △通訊作者，E-mail:fangkeqq88@163.com。

doi:·經(jīng)驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.023

[中圖分類號]R735.1

[文獻標(biāo)識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)15-2104-03

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-02-06)