王玉娟,張　斌,何　威,王儒鵬,周春麗，劉　蓮，王　為，黃　珂

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科，重慶 400037)

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鹵米松與他扎羅汀對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞RAR-γ和RXR-α表達(dá)的影響*

王玉娟,張斌,何威△,王儒鵬,周春麗，劉蓮，王為，黃珂

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科，重慶 400037)

[摘要]目的觀察不同濃度鹵米松和他扎羅汀對(duì)體外培養(yǎng)人永生化HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的維甲酸受體(RAR)-γ和維甲酸X受體(RXR)-α表達(dá)的影響，探討鹵米松對(duì)他扎羅汀治療銀屑病效應(yīng)的潛在影響。方法CCK-8方法檢測(cè)不同濃度鹵米松和他扎羅汀對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響；Western blot法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)不同濃度鹵米松和他扎羅汀作用12 h、24 h 后，HaCaT細(xì)胞中RAR-γ和RXR-α 的mRNA水平和蛋白水平的變化。結(jié)果鹵米松和他扎羅汀均可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。鹵米松使HaCaT細(xì)胞的RAR-γ和RXR-α mRNA水平和蛋白水平升高。他扎羅汀作用后RAR-γ和RXR-α的mRNA水平降低，而蛋白水平在12 h升高，24 h降低。結(jié)論鹵米松作用角質(zhì)形成細(xì)胞后可上調(diào)RAR-γ和RXR-α表達(dá)，這可能有助于提高角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)他扎羅汀作用的反應(yīng)性，從而提高他扎羅汀的作用效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]RNA，信使；銀屑??；受體，維甲酸；鹵米松；他扎羅?。籋aCaT細(xì)胞；RAR-γ；RXR-α

銀屑病是皮膚科臨床上常見(jiàn)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，外用療法是目前銀屑病治療的主要方法之一，糖皮質(zhì)激素與他扎羅汀聯(lián)合使用治療銀屑病已得到多國(guó)銀屑病治療指南的肯定[1-3]。作為核激素受體超家族成員，糖皮質(zhì)激素與維甲酸均通過(guò)與其各自的受體結(jié)合而發(fā)揮藥理效應(yīng)。鑒于核受體超家族成員間可能存在著一定程度的相互影響[4-5]，當(dāng)外用激素與他扎羅汀聯(lián)合治療銀屑病時(shí)，糖皮質(zhì)激素是否會(huì)對(duì)他扎羅汀的治療效應(yīng)產(chǎn)生影響尚有待探索。為此，本研究以HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象，以表皮中表達(dá)量最高的維甲酸受體(RAR)-γ和維甲酸X受體(RXR)-α[6-7]為主要研究指標(biāo)，觀察不同濃度鹵米松和他扎羅汀作用對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中RAR-γ和RXR-α的表達(dá)影響，以探討鹵米松對(duì)他扎羅汀治療銀屑病效應(yīng)的潛在影響。

1材料與方法

1.1材料HaCaT細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。主要試劑及器材：RPMI 1640 培養(yǎng)液(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，兔抗人RAR-γ多克隆抗體、兔抗人RXR-α多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz)，辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京中杉金橋)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒(碧云天)，聚偏二氧乙烯膜(PVDF膜，Millipore)，鹵米松(香港澳美制藥有限公司)，他扎羅汀(美國(guó)Sigma公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀(ViiA7DX,新加坡ABI)，超靈敏凝膠成像系統(tǒng)(LAS4010，美國(guó)GE)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，1～2 d傳代1次，待細(xì)胞傳至3～5代時(shí)接種至孔板。

1.2.2鹵米松和他扎羅汀的使用及分組將鹵米松和他扎羅汀溶于DMSO配成10-2mol/L原液，臨用時(shí)用培養(yǎng)基配成終濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和國(guó)外相關(guān)研究設(shè)定他扎羅汀的濃度為10-9、10-8、10-7、10-6mol/L為他扎羅汀處理組[8]，依次命名為T(mén)9組、T8組、T7組、T6組；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和國(guó)外相關(guān)研究設(shè)定鹵米松的濃度為10-9、10-8、10-7、10-6mol/L為鹵米松處理組，依次命名為H9組、H8組、H7組、H6組，同時(shí)設(shè)定DMSO為空白對(duì)照組。分別作用HaCaT細(xì)胞12、24 h后，收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋白。

1.2.3細(xì)胞增殖測(cè)定將傳至3～5代的細(xì)胞接種至96孔板，每孔細(xì)胞接種數(shù)約(4～5)×104，按照上述設(shè)置的濃度和分組進(jìn)行培養(yǎng)。12 h后棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑，30 min后在酶標(biāo)儀上設(shè)定波長(zhǎng)450 μm檢測(cè)光密度(OD值)。

1.2.4細(xì)胞總RNA提取參照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度(A260/A280)，并取適量RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)RNA的質(zhì)量。

1.2.5引物設(shè)計(jì)與合成RXR-α引物上游：5′-TGC GCA AGG ACC TGA CCT ACA C-3′，下游：5′-GAC TCC ACC TCA TTC TCG TTC CG-3′；RAR-γ引物上游：5′-AGA GAG GGC AAA GGG ATG AG-3′，下游5′-GTG GAA TGG CAG GTC TTC-3′；用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作內(nèi)參校準(zhǔn)基因，上游：5′-CAT CAA GAA GGT GGT GAA GCA G-3′，下游：5′-CGT CAA AGG TGG AGG AGT GG-3′。以上引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)和Invitrogen公司合成。

1.2.6反轉(zhuǎn)錄cDNA RT-PCR反應(yīng)和結(jié)果分析按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(日本 TaKaRa公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA模板于ViiA7DX PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。20.0 μL體系中含上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，擴(kuò)增步驟和條件：(1)預(yù)變性，1個(gè)循環(huán) 95 ℃ 30 s；(2)PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；(3)溶解曲線(xiàn)，90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法，ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組(CT目的-CT內(nèi)參)-對(duì)照組(CT目的-CT內(nèi)參)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.7Western blot分別收集各藥物濃度處理組及空白對(duì)照組總蛋白用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，加入1 mL PBS于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后吸入至離心管，4 ℃ 3 000 r/min離心3 min，去上清液，加入預(yù)冷的細(xì)胞蛋白裂解液冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液于新的離心管中用BCA法測(cè)蛋白濃度。按照蛋白總體積∶十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液為4∶1的比例加入上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性。配SDS-PAGE：下層10%分離膠和上層5%濃縮膠。100 V恒壓電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(270 mA，90 min)，5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST洗膜3次×5 min，加入第一抗體：RAR-γ 1/200； RXR-α 1/200；GAPDH為內(nèi)參抗體，工作濃度為1/1 000，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次×15 min，目的蛋白膜上加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗1/5 000，GAPDH膜上加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗1/5 000，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3×15 min。最后按ECL顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)顯色。

2結(jié)果

2.1鹵米松與他扎羅汀對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖活性的影響隨著鹵米松和他扎羅汀濃度的升高，OD值降低，細(xì)胞的增殖活力越弱，見(jiàn)圖1。

2.2鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中RAR-γ和RXR-α表達(dá)的影響

2.2.1鹵米松對(duì)HaCaT細(xì)胞RAR-γ和RXR-α mRNA表達(dá)的影響RAR-γ在鹵米松處理組均比在空白對(duì)照組的基因水平表達(dá)量高，隨著鹵米松濃度的增高，RAR-γ mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.983，P=0.000)。RXR-α在鹵米松作用于HaCaT細(xì)胞12 h后均比空白對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量低，但RXR-α在鹵米松作用HaCaT細(xì)胞24 h后比空白對(duì)照組表達(dá)高，且隨著濃度的增高而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.763，P=0.000)，見(jiàn)圖2。

A：鹵米松處理組；B：他扎羅汀處理組。

圖1不同濃度鹵米松和他扎羅汀作用HaCaT細(xì)胞12 hOD值

A：RAR-γ mRNA水平；B：RXR-α mRNA水平。

圖2不同濃度鹵米松作用12 h和24 h對(duì)RAR-γ和RXR-α mRNA表達(dá)的影響

2.2.2鹵米松對(duì)HaCaT細(xì)胞RAR-γ和RXR-α蛋白水平的影響不同濃度鹵米松作用于角質(zhì)形成細(xì)胞后RAR-γ和RXR-α蛋白水平均比空白對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：RAR-γ蛋白水平；C：RXR-α蛋白水平。

圖3不同濃度鹵米松作用HaCaT細(xì)胞12 h和24 h后RAR-γ和RXR-α蛋白水平

2.3他扎羅汀對(duì)RAR-γ和RXR-α表達(dá)的影響

2.3.1他扎羅汀對(duì)HaCaT細(xì)胞RAR-γ和RXR-α的mRNA水平的影響RAR-γ和RXR-α mRNA在他扎羅汀作用HaCaT細(xì)胞12 h和24 h后均比空白對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但不存在濃度依賴(lài)關(guān)系，見(jiàn)圖4。

A：RAR-γ mRNA水平；B：RXR-α mRNA水平。

圖4不同濃度他扎羅汀作用HaCaT細(xì)胞12 h和24 h后RAR-γ和RXR-α基因的影響

2.3.2他扎羅汀對(duì)HaCaT細(xì)胞RAR-γ和RXR-α蛋白水平的影響不同濃度他扎羅汀作用于角質(zhì)形成細(xì)胞12 h后RAR-γ和RXR-α蛋白表達(dá)量比空白對(duì)照組高，但24 h后蛋白表達(dá)量降低，見(jiàn)圖5。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：RAR-γ蛋白水平；C：RXR-α蛋白水平。

圖5不同濃度他扎羅汀作用HaCaT細(xì)胞12 h和24 hRAR-γ和RXR-α蛋白水平

3討論

銀屑病是皮膚科臨床上常見(jiàn)的以紅斑鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，病理上以表皮細(xì)胞過(guò)度增殖、異常分化等為主要特征。外用療法是治療銀屑病的主要手段，糖皮質(zhì)激素、維甲酸類(lèi)藥物、維生素D3衍生物等是目前銀屑病外用療法中的常用藥物[9]。鹵米松是一種具有抗炎、抗過(guò)敏、收縮血管、止癢、對(duì)局部皮損有免疫調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素外用制劑，其起效迅速、作用強(qiáng)大，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起皮膚局部萎縮、色素沉著等不良反應(yīng)，限制了其臨床的應(yīng)用。他扎羅汀作為第3代維甲酸藥物，具有調(diào)節(jié)表皮分化和增殖等作用，促使角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化正常化，降低角質(zhì)形成細(xì)胞的增生和降低炎癥標(biāo)志物的表達(dá)，使皮膚恢復(fù)正常。二者聯(lián)合使用既減少了激素的劑量，增強(qiáng)了療效，還減少了不良反應(yīng)，但其具體機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)鹵米松與他扎羅汀作用角質(zhì)形成細(xì)胞后均可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，二者聯(lián)用可增強(qiáng)彼此的抑制作用，提示激素和維甲酸類(lèi)藥物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞有抗增殖的能力，從而使角化過(guò)度的角質(zhì)形成細(xì)胞趨于正?；_(dá)到治療目的。目前研究已確定，糖皮質(zhì)激素主要是通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中的核激素受體GRα結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，GC與GRα的復(fù)合體移位至細(xì)胞核內(nèi)與糖皮質(zhì)激素受體操縱元件(GRE)結(jié)合后，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[10]。維甲酸的調(diào)節(jié)作用通過(guò)RAR和RXR介導(dǎo)發(fā)揮，二者的受體均屬于核激素受體家族成員。眾多研究表明，核受體超家族成員間可能存在交叉對(duì)話(huà)，且RXR與其他核受體之間形成二聚體發(fā)揮作用。鑒于此，Yamaguchi等[11]研究地塞米松作用小鼠肝細(xì)胞對(duì)RXR的影響，發(fā)現(xiàn)地塞米松能增加RXR-α的mRNA水平和蛋白水平，增強(qiáng)甲狀腺激素的活性。而Grummer等[12]發(fā)現(xiàn)地塞米松作用小鼠肺泡細(xì)胞后等增加RAR-β和表面蛋白C的表達(dá)，促進(jìn)肺泡細(xì)胞分化和發(fā)育。本研究也發(fā)現(xiàn)，他扎羅汀作用角質(zhì)形成細(xì)胞后以下調(diào)RAR-γ和RXR-α表達(dá)為主，而鹵米松作用角質(zhì)形成細(xì)胞后上調(diào)細(xì)胞中RAR-γ和RXR-α表達(dá)，因而可能通過(guò)此路徑達(dá)到增加他扎羅汀調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞正常分化、抗增殖的活性的作用，以提高其治療銀屑病的效應(yīng)，在一定程度上解釋了臨床上鹵米松聯(lián)合他扎羅汀治療銀屑病療效優(yōu)于單用的現(xiàn)象，為臨床上外用激素與他扎羅汀聯(lián)合治療銀屑病提供了一定的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)和理論基礎(chǔ)。但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.006

*基金項(xiàng)目：中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)-澳美制藥銀屑病研究基金資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：王玉娟(1989-)，住院醫(yī)師，在讀碩士， 主要從事鹵米松調(diào)節(jié)他扎羅汀對(duì)表皮細(xì)胞作用的影響及機(jī)制研究。 △通訊作者，E-mail:weiheskin@163.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R758.63

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2048-03

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-02-16)

Effects of halometasone and tazarotene on expression of RAR-γ and RXR-α in human keratinocytes*

Wang Yujuan,Zhang Bin,He Wei△,Wang Rupeng,Zhou Chunli,Liu Lian,Wang Wei,Huang Ke

(DepartmentofDermatology,XinqiaoHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of halometasone and tazarotene on the expression of retinoic acid receptors (RAR-γ、RXR-α) in cultured immortalized keratinocyte line-HaCaT cell in vitro,and to explore the potential effect of halometasone on tazarotene in psoriasis treatment.MethodsCCK-8 was used to detect the cell proliferation of HaCaT cells treated by different concentration of halometasone and tazarotene.The expressions of RAR-γ and RXR-α mRNA and protein in HaCaT cells treated by different concentration of halometasone and tazarotene for 12 h and 24 h were detected by RT-PCR and western blotting.ResultsHalometasone and tazarotene both inhibited cell proliferation of keratinocytes.The expressions of RAR-γ and RXR-α were increased through treatment with halometasone for 12 h and 24 h.And the mRNA expression of RAR-γ and RXR-α were decreased with tazarotene treatment,while the expressions of protein was increased after 12 h and decreased after 24 h.ConclusionThe expressions of RAR-γ and RXR-α are upregulated by halometasone in keratinocytes,which might contributes to improve the activity of tazarotene and raise its effect.

[Key words]RNA，messenger；psoriasis；receptors,retinoic acid;halometasone;tazarotene;HaCaT cell;RAR-γ;RXR-α