張　韜，陳冬冬，翁　艷，馮爾宥，張怡元*

(1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科研究所，2.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科，福建福州350007)

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白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用機(jī)制

張韜1，陳冬冬2，翁艷2，馮爾宥2，張怡元2*

(1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科研究所，2.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科，福建福州350007)

摘要：為探討白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)活性成分對骨肉瘤的作用及其機(jī)制，對白花蛇舌草中分別提取的黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類化合物，用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測不同提取物對MG-63細(xì)胞活性的影響；同時建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型，觀察不同提取物對移植瘤生長的抑制作用；并通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期變化，蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)檢測Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平.結(jié)果顯示：4種提取物都對MG-63細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，最優(yōu)藥物質(zhì)量濃度為80 μg/mL；在此質(zhì)量濃度下4種提取物對裸鼠移植骨肉瘤均具有抑制作用，其中多糖類對MG-63細(xì)胞活性和移植瘤生長的抑制作用最強(qiáng)，明顯促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期；Bax表達(dá)量在48 h內(nèi)隨著白花蛇舌草多糖類提取物作用時間延長而增加，而Bcl-2表達(dá)量則降低.由上述結(jié)果可知，白花蛇舌草活性成分中多糖類的抗腫瘤活性最強(qiáng)，其作用機(jī)制可能是通過抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期來達(dá)到抑瘤效果.

關(guān)鍵詞：白花蛇舌草；骨肉瘤；凋亡

骨肉瘤是青少年中最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，腫瘤惡性程度高，預(yù)后差，給家庭和社會帶來極大負(fù)擔(dān).目前，手術(shù)是骨肉瘤最有效的治療方法，但肉瘤位置特殊、術(shù)后易轉(zhuǎn)移和手術(shù)費(fèi)用高等均是影響患者治療的因素，因此尋找其他經(jīng)濟(jì)、安全的保肢治療方案尤為重要.白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa，HD)屬茜草科耳草屬植物，具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿消腫、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)及抗癌的功效，是用于治療肺癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤等癌癥的中藥復(fù)方中常用的單味藥[1-2]，但其在治療骨肉瘤中的作用鮮有報道.研究發(fā)現(xiàn)，HD水提取物、乙酸乙酯萃取物、醇提取物都具有抗腫瘤作用，其有效成分有黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類等[3].本研究首先通過體外實(shí)驗(yàn)篩選HD有效成分中抑制骨肉瘤細(xì)胞株MG-63增殖最明顯的成分，然后通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察HD有效成分對移植瘤生長以及骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并初步探討其作用機(jī)制.

1材料與方法

1.1材料

人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株(南京科佰生物科技有限公司)，BALB/C裸鼠(體質(zhì)量(18±2) g，吳氏實(shí)驗(yàn)動物中心)，HD黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類提取物(福州大學(xué)中藥研究所饋贈)，胎牛血清(FBS,Hyclone，美國)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，美國)，RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒和UltraECL 底物化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Invitrogen，美國)，鼠抗人Bcl-2、Bax及內(nèi)參GAPDH一抗，羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(Abcam，英國)；Annexin-FITC-PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司).

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將MG-63細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%(體積分?jǐn)?shù)，不同)FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3MTT法

細(xì)胞生長至對數(shù)期后胰酶消化，培養(yǎng)基重懸，96孔板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約5×103).加入20 μL HD提取物(黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類)，終質(zhì)量濃度為10，20，40，80，160 μg/mL，生理鹽水作陰性對照，相同終質(zhì)量濃度順鉑作陽性對照，每組重復(fù)6孔.培養(yǎng)約24 h，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT(終質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清，每孔加入160 μL 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，待結(jié)晶紫完全溶解后用酶標(biāo)儀測定492 nm下吸光值(A)，計算細(xì)胞生存率，生存率=(A實(shí)驗(yàn)-A陰性對照)/(A陽性對照-A陰性對照)×100%.

1.4骨肉瘤裸鼠模型的建立

細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后調(diào)整密度至5×107mL-1.充分麻醉裸鼠后，無菌操作臺上在裸鼠右后肢脛骨上端行10 mm縱切口，剪開皮膚，暴露脛骨上端；用1 mL注射器緩慢鉆入脛骨結(jié)節(jié)和脛骨內(nèi)側(cè)髁之間的骨皮質(zhì)，穿透后拔出.用微量注射器向脛骨髓腔中注入0.2 mL準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約1×107)，邊注射邊回抽針頭，注射完后用5-0#縫線關(guān)閉切口.術(shù)后SPF級獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠中飼料并觀察成瘤情況.

1.5動物分組及給藥

荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組：黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類處理組[3]，采用隔日灌胃給藥，給藥劑量為50 mg/kg；對照組，隔日給予同等劑量生理鹽水灌胃.20 d后處死裸鼠，剝離移植瘤，稱質(zhì)量，取平均值.

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期

細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后調(diào)整密度為1×106mL-1，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，5% FBS的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；更換無血清的DMEM培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24 h；最后更換為5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，并加入終質(zhì)量濃度為80 μg/mL的多糖類提取物，分別培養(yǎng)24和48 h.收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后用預(yù)冷的70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇固定，4 ℃過夜；離心去除固定液，PBS洗滌1次，收集的細(xì)胞加入預(yù)先配好的碘化丙啶(PI)溶液，室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測.

1.7蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)

細(xì)胞加藥分別培養(yǎng)0，6，12，24，48 h后收集細(xì)胞并裂解，取樣品裂解液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的吐溫(TBST)溶液封閉1 h；洗膜后將封閉后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜與一抗4 ℃孵育過夜；洗膜后在室溫條件下與二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h；洗膜后加入底物化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、洗片、晾干.用凝膠圖像分析儀掃描照片，并采用灰度分析軟件ImageJ 1.48u計算各蛋白條帶的灰度值.

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)軟件為SPSS 13.0，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，兩樣本均數(shù)比較采用t-檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為差異顯著.

2結(jié)果

2.1HD提取物對MG-63細(xì)胞活性的影響

如圖1所示，HD的4種主要提取物(黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類)都對MG-63細(xì)胞的增殖具有抑制作用，隨著藥物質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞生存率越低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，但當(dāng)藥物終質(zhì)量濃度升高至160 μg/mL時，細(xì)胞生存率與80 μg/mL時相比差異不顯著(p>0.05).其中，多糖類對MG-63細(xì)胞的生長抑制作用最明顯，半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為42.5 μg/mL，在藥物終質(zhì)量濃度為20，40，80，160 μg/mL時，細(xì)胞生存率分別為64.5%，52.1%，34.7%和32.2%，都顯著低于黃酮類、三萜酸類和香豆素類(p<0.05)，但顯著高于陽性對照(p<0.05).

圖1　HD提取物對MG-63細(xì)胞活性的影響Fig.1The effects of HD extracts on activity of MG-63 cells

2.2HD提取物對移植瘤的影響

根據(jù)2.1小節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)藥物終質(zhì)量濃度80 μg/mL作為裸鼠給藥劑量.裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有裸鼠都成活，各藥物處理組移植瘤質(zhì)量(香豆素類(0.88±0.11) g、黃酮類(0.39±0.12) g、三萜酸類(0.75±0.13) g和多糖類(0.22±0.07) g)都顯著小于陰性對照組(1.72±0.47) g(p<0.05)，且多糖類處理骨肉瘤后的移植瘤質(zhì)量最小，顯著小于三萜酸類、黃酮類和香豆素類處理組(p<0.05)(圖2).

圖3　HD多糖類提取物對MG-63細(xì)胞凋亡及周期的影響Fig.3The effect of HD polysaccharides on apoptosis and cell cycle of MG-63 cells

(a)HD處理后的骨肉瘤移植瘤照片(重復(fù)3次)； (b)HD處理后的骨肉瘤移植瘤質(zhì)量. *表示與陰性對照比較差異顯著(p<0.05)； #表示與多糖類比較差異顯著(p<0.05).圖2　HD提取物對骨肉瘤瘤質(zhì)量抑制率的影響Fig.2The effects of HD extracts on weight inhibition rate of osteosarcoma

2.3HD多糖類提取物對MG-63細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測HD活性成分中抑瘤效果最強(qiáng)的多糖類提取物對MG-63細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.藥物處理24和48 h后細(xì)胞凋亡率分別為18.48%和26.96%，顯著高于陰性對照組(0 h)的0.02%(p<0.05)，提示HD多糖類提取物明顯促進(jìn)了MG-63細(xì)胞凋亡，且隨著處理時間延長，細(xì)胞凋亡率有所升高.另外，藥物處理24 h后G1期、S期和G2期MG-63細(xì)胞分別為42.16%，43.34%和12.44%；加藥48 h后G1期、S期和G2期MG-63細(xì)胞占分別為43.75%，42.58%和9.15%；陰性對照組G1期、S期和G2期MG-63細(xì)胞占分別為32.48%，58.39%和9.13%.該結(jié)果提示HD多糖類提取物具有阻滯細(xì)胞周期的作用，但隨著處理時間延長，細(xì)胞周期阻滯效果不明顯.

2.4HD多糖類提取物對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：促凋亡蛋白Bax表達(dá)量在48 h內(nèi)隨著HD多糖類提取物作用時間延長而增加；相反，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量在48 h內(nèi)隨著HD多糖類提取物作用時間延長而降低(圖4).上述結(jié)果提示HD多糖類提取物具有誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的作用.

*表示與0 h相比差異顯著(p<0.05).圖4　HD多糖類提取物對MG-63細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig.4The effect of HD polysaccharides on expression of Bax and Bcl-2 in MG-63 cells

3討論

目前公認(rèn)的骨肉瘤治療模式是“術(shù)前新輔助化療+腫瘤手術(shù)切除+術(shù)后輔助化療”；另外，介入治療、冷熱消融治療、中藥治療也是骨肉瘤的輔助治療手段；還有一些治療方法尚處于研究階段，如基因治療、免疫治療、干細(xì)胞治療和光動力治療等.其中，臨床報道證實(shí)中藥能夠?yàn)楣侨饬鲋委熖峁┯行У姆椒ǎS金昶等[4]使用自制骨瘤消膠囊聯(lián)合中藥湯劑治療22 例骨肉瘤患者就取得了較好的治療效果.

HD抗腫瘤的活性成分有黃酮類(槲皮素、山奈酚)、三萜酸類(熊果酸、齊墩果酸)、香豆素類和多糖類等化學(xué)成分，目前臨床上主要用HD多成分注射液[5]，而對其單一活性成分的抗腫瘤研究甚少.有研究表明HD可降低化療藥物引起的乳腺癌細(xì)胞毒性[6]，大量研究也發(fā)現(xiàn)HD可誘導(dǎo)前列腺癌[7]、宮頸癌[8]、肝癌[9]、腎癌[10]、結(jié)腸癌[11]、膠質(zhì)瘤[12]等細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，還有研究發(fā)現(xiàn)HD也可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖[13].

本研究發(fā)現(xiàn)，HD提取物中黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類都會抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖，最佳抑制質(zhì)量濃度均為80 μg/mL，其中多糖類抑制效果最好，細(xì)胞生存率僅為34.7%.另外，移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香豆素類、黃酮類、三萜酸類和多糖類處理的裸鼠移植瘤質(zhì)量都明顯小于陰性對照組(p<0.05)，且多糖類處理后的移植瘤質(zhì)量最小，明顯小于三萜酸類、黃酮類和香豆素類(p<0.05).黃酮類、三萜酸類、香豆素對MG-63細(xì)胞的抑制作用幾乎相當(dāng)，但三者對裸鼠移植瘤的抑制作用卻有較大差異，可能由于三者在裸鼠體內(nèi)吸收和代謝存在差異.

進(jìn)一步對抑瘤作用最強(qiáng)的多糖類提取物進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：HD多糖類提取物明顯促進(jìn)了MG-63細(xì)胞凋亡，且隨著藥物處理時間延長細(xì)胞凋亡率有所升高;同時也具有阻滯細(xì)胞周期的作用，但隨著藥物處理時間延長，細(xì)胞周期阻滯效果變得不明顯，可能藥物作用時間并不是影響細(xì)胞周期的主要因素.通過分析HD多糖類提取物對Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白Bax表達(dá)量在48 h內(nèi)隨著HD多糖類提取物作用時間延長而增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量則降低，說明HD多糖類提取物一方面激活Bax的表達(dá)，一方面抑制Bcl-2的表達(dá)，共同起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用.

綜上所述，HD提取物中黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類都具有抗腫瘤活性，其中多糖類的抗腫瘤活性最強(qiáng)，其作用機(jī)制可能是通過抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、激活Bax表達(dá)并抑制Bcl-2表達(dá)共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以及阻滯細(xì)胞周期等途徑發(fā)揮作用，最終達(dá)到抑制骨肉瘤的效果.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201510010

收稿日期：2015-10-16錄用日期：2016-01-18

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金(2015J01358)

*通信作者：zhangyiyuan_fj@126.com

中圖分類號:R 965.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0438-0479(2016)04-0501-05

Effect of Hedyotis diffusa Polysaccharides on Osteosarcoma

ZHANG Tao1，CHEN Dongdong2，WENG Yan2，F(xiàn)ENG Eryou2，ZHANG Yiyuan2*

(1.Department of Orthopedics Institute，F(xiàn)uzhou Second Hospital，2.Department of Orthopedics，F(xiàn)uzhou Second Hospital，F(xiàn)uzhou 350007，China)

Abstract:To investigate the effect of Hedyotis diffusa (HD) on osteosarcoma，the MTT assay was used to detect the effects of flavonoids，triterpene acids，coumarin and polysaccharides extracted from HD on MG-63 cell activity.Osteosarcoma xenograft model in nude mice was established to evaluate the effects of HD extracts on growth of osteosarcoma.Apoptosis and cell cycle of MG-63 cells were detected by flow cytometry，and Western blot was performed to assay the expression of Bax and Bcl-2.Results showed that these four types of HD extracts significantly inhibited the proliferation of MG-63 cells with the optimal drug concentration at 80 μg/mL，which exhibited a significant dose-dependent manner.The HD extracts also inhibited the growth of osteosarcoma under the optimal drug concentration.Wherein the HD extracts，polysaccharides showed the strongest inhibition effect both on the proliferation of MG-63 cell and the growth of osteosarcoma.Data showed that polysaccharides significantly promoted the cell apoptosis，arrested the cell cycle of MG-63 cells，up-regulated the expression level of Bax and down-regulated the expression level of Bcl-2 in 48 h treatment.Therefore，among the HD extracts，polysaccharides may have the strongest inhibition effect on osteosarcoma via the inhibition of cell proliferation，the promotion of cell apoptosis，and the arresting of MG-63 cell cycles.

Key words:Hedyotis diffusa;osteosarcoma;apoptosis

引文格式：張韜，陳冬冬，翁艷，等.白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用機(jī)制[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016,55(4)：501-505.

Citation：ZHANG T，CHEN D D，WENG Y,et al．Effect ofHedyotisdiffusapolysaccharides on osteosarcoma[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：501-505．(in Chinese)