李　爽，鄭毅男，韓佳彤，丁傳波，劉文叢

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130118)

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發(fā)酵處理對(duì)毛豆異黃酮苷元含量及其乙醇提取物抗氧化活性的影響

李爽，鄭毅男，韓佳彤，丁傳波，劉文叢

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130118)

[摘要]【目的】 測(cè)定毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中的大豆苷元、黃豆黃素與染料木素3種異黃酮苷元以及多酚類化合物的總含量，并分析其乙醇提取物的抗氧化活性?！痉椒ā?利用回流法酸水解樣品中的大豆異黃酮，通過高效液相色譜法測(cè)定大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的含量；利用福林酚法測(cè)定3種樣品中的多酚類物質(zhì)總含量，并通過測(cè)定清除DPPH自由基、ABTS自由基和還原力比較樣品乙醇提取物的抗氧化活性?！窘Y(jié)果】 毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆的大豆苷元含量分別為255.96，286.04和358.08 μg/g，黃豆黃素含量分別為57.96，65.51和59.73 μg/g，染料木素含量分別為12.88，26.40和4.62 μg/g。發(fā)酵處理毛豆中染料木素含量增加明顯，分別為毛豆和大豆染料木素含量的2.05和5.71倍。發(fā)酵處理毛豆、大豆、毛豆中的多酚類化合物總含量分別為 (3.31±0.138) mg/g、(1.148±0.028) mg/g和(2.69±0.011) mg/g，發(fā)酵處理毛豆的多酚類化合物含量約是大豆和毛豆的2.9和1.2倍?？寡趸钚员容^表明，發(fā)酵處理毛豆清除ABTS自由基與DPPH自由基的能力優(yōu)于大豆和毛豆。發(fā)酵處理毛豆、大豆和毛豆還原力大小依次表現(xiàn)為發(fā)酵處理毛豆>毛豆>大豆?！窘Y(jié)論】 經(jīng)過發(fā)酵處理后，毛豆中的3種異黃酮含量均有所增加，但以染料木素的增加最為明顯；發(fā)酵處理毛豆中多酚類化合物總含量升高，自由基清除活性增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞]毛豆；發(fā)酵處理；大豆異黃酮苷元；多酚；抗氧化活性

毛豆是豆科植物大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)在鼓莢后采收的嫩青大豆，作蔬菜用時(shí)又名菜用大豆。毛豆具有很好的食療作用，中國(guó)古代藥學(xué)著作《滇南本草》第二卷記載：“毛豆，味平。治脾胃虛弱，小兒疳積。能開胃健脾?！弊罱芯勘砻?，毛豆豆?jié){對(duì)2-型糖尿病有很好的降血糖、降血脂作用[1]。毛豆在風(fēng)味、質(zhì)地及用于煮食方面均優(yōu)于普通大豆[2]，在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)上毛豆較大豆更有不可小覷的優(yōu)勢(shì)，例如毛豆中的胰脂肪酶抑制水平較低，不易消化的低聚糖較少且含有更多的維生素，高植酸含量使毛豆更加柔軟且更易烹飪[3]；毛豆中游離氨基酸含量較大豆高出1倍，此外毛豆還含有Ca、Fe、Mg等礦物質(zhì)，油分中不飽和脂肪酸高達(dá)84.43%[4]。在經(jīng)濟(jì)效益上，毛豆具有較強(qiáng)的消費(fèi)優(yōu)勢(shì)，其市場(chǎng)需求日漸增加，且正從亞洲市場(chǎng)逐漸進(jìn)入歐美市場(chǎng)[4]。因此，毛豆這一項(xiàng)新興的大豆產(chǎn)業(yè)具有非常大的發(fā)展?jié)摿蛧?guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

發(fā)酵可以增加食品的有效營(yíng)養(yǎng)成分，因此發(fā)酵處理方法在食品的多樣化發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用。張曉玲等[5]發(fā)現(xiàn)，利用微生物發(fā)酵法提取大豆異黃酮苷元的效率較高。目前對(duì)發(fā)酵豆制品包括發(fā)酵豆乳的研究越來越多，表明豆制品加工及發(fā)展正逐步走向多樣化。發(fā)酵豆乳具有良好的降血壓、調(diào)節(jié)血脂等保健功效[6]。田三德等[7-8]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆乳可以調(diào)節(jié)動(dòng)物血脂，改善胃腸道消化功能。吳非等[9]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆制品較非發(fā)酵豆制品抗氧化活性高。乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)在人類消化系統(tǒng)中廣泛存在，用其發(fā)酵可以提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，提高食品保藏值和附加值[10]。徐寅等[11]對(duì)豆乳進(jìn)行多菌種發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)發(fā)酵豆乳的風(fēng)味有重要影響，可以使之獲得較好的感官評(píng)價(jià)，是發(fā)酵豆乳的優(yōu)選菌種。目前關(guān)于毛豆發(fā)酵的相關(guān)研究較少，毛豆制品的開發(fā)與利用度尚待提高。為此，本試驗(yàn)對(duì)毛豆進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵處理，并與大豆及未發(fā)酵處理的毛豆進(jìn)行比較，分析各樣品中大豆苷元、黃豆黃素及染料木素3種大豆異黃酮苷元及總多酚類化合物含量的變化，比較3種樣品乙醇提取物對(duì)ABTS和DPPH自由基的清除能力及還原力，以期為市場(chǎng)中毛豆類保健食品的多樣性開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料大豆，購(gòu)自吉林琿春農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；毛豆8月下旬采自琿春，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院鄭毅男教授鑒定為豆科(Leguminosae)大豆屬毛豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)

1.1.2儀器與試劑LC-20A型高效液相色譜儀，搭載有SPD-20A紫外檢測(cè)器，日本島津；超聲波清洗器，KQ-250DB，昆山超聲儀器有限公司；BP211D電子天平，德國(guó)Sartorious公司；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；SpectraMax Plus384連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀，美國(guó)分子儀器公司；電熱恒溫智能型水浴鍋，DK-98-ⅡA，天津泰斯特科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1D-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，BXM-30R，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

福林酚試劑，貨號(hào)PRLB09500，上海荔達(dá)生物科技有限公司；大豆苷元對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)：MUST-12042606)、黃豆黃素對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)：MUST-12021301)、染料木素對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)：MUST-12010801)，3種異黃酮苷元均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；乳酸菌凍干粉(乳酸桿菌與嗜熱鏈球菌混合凍干菌粉)，北京川秀科技有限公司；2,2′-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購(gòu)自Sigma公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，購(gòu)自西亞試劑公司；甲醇(色譜純)，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；乙醇(分析純)，北京化工廠生產(chǎn)；鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和碳酸鈉，均為北京化工廠產(chǎn)品；純水，杭州哇哈哈有限公司產(chǎn)品。 其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2樣品處理

1.2.1毛豆樣品的制備將毛豆煮熟后凍干，磨成粉末待用。

1.2.2發(fā)酵處理毛豆樣品的制備取上述毛豆粉末按1∶4比例加雙蒸水于高壓滅菌器中滅菌，后加入乳酸菌粉，控制溫度在42 ℃條件下發(fā)酵8 h，制得發(fā)酵毛豆乳。將發(fā)酵毛豆乳凍干，得發(fā)酵處理毛豆粉末，待用；

1.2.3大豆樣品的制備將大豆凍干處理，磨成粉末待用。

1.3毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中大豆苷元、黃豆黃素與染料木素含量的測(cè)定

1.3.1異黃酮苷元混合對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取大豆苷元1.38 mg、黃豆黃素0.97 mg、染料木素0.67 mg，置于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容，混勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾，即可制得質(zhì)量濃度為19.40，13.40和27.60 μg/mL的大豆苷元、黃豆黃素和染料木素異黃酮苷元混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取上述制備的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2，1，0.5，0.25，0.125 mL，計(jì)為混合對(duì)照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，分別用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容于2 mL離心管中，搖勻，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。用外標(biāo)法計(jì)算峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以異黃酮苷元含量為自變量(X)、峰面積為因變量(Y)求回歸方程，用于測(cè)定大豆、毛豆及發(fā)酵毛豆中的3種異黃酮苷元含量。

1.3.2毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆樣品溶液的配制稱取2 g毛豆粉末置于250 mL燒瓶中，加入70 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和8 mL濃鹽酸，85 ℃ 回流2 h，過濾后揮干。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇將揮干后的混合物定容于10 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得毛豆乙醇鹽酸水解提取物溶液。將發(fā)酵處理毛豆樣品和大豆樣品用同樣方式處理，得到發(fā)酵毛豆及大豆乙醇鹽酸水解提取物溶液。將以上3種樣品溶液用于HPLC測(cè)定。

1.3.3HPLC測(cè)定HPLC條件：色譜柱為大連依利特HypersilODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.3%磷酸溶液(V(甲醇)∶V(體積分?jǐn)?shù)0.3%磷酸)=48∶52)；柱溫25 ℃；流速0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.4大豆、毛豆及發(fā)酵處理毛豆中多酚類化合物總含量的測(cè)定

1.4.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取沒食子酸10.00 mg于100 mL容量瓶中，加70 mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶解后再定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸溶液。分別移取0，0.2，0.4，0.8，1.6和3.2 mL沒食子酸溶液于10 mL具塞試管中，每個(gè)試管加入1.5 mL福林酚試劑，混勻放置1 min，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaCO3溶液，混勻，用雙蒸水定容至10 mL，放置1 h后在波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定吸光度[12]。以沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以質(zhì)量濃度為自變量(X)、吸光度為因變量(Y)求回歸方程，用于測(cè)定大豆、毛豆及發(fā)酵處理毛豆中多酚類化合物的總含量。

1.4.2毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中多酚類化合物總含量的測(cè)定分別稱取毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆凍干粉末2.0 g，按料(g)液(mL)比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，室溫下于100 Hz、250 W微波作用條件下提取30 min，提取3次，合并提取液。減壓濃縮后用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容于50 mL容量瓶中。測(cè)定樣品在760 nm下的吸光度，計(jì)算多酚類化合物總含量，試驗(yàn)平行測(cè)定3次取平均值。多酚類化合物總含量的計(jì)算公式為：

W=(C×V×N)/(M×1 000)。

式中：W為多酚類化合物總含量(μg/mL)，C為沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)，V為提取液體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，M為取樣量(g)。

1.5毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇提取物的抗氧化活性測(cè)定

1.5.1毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇提取物的制備分別稱取上述3種樣品的凍干粉10 g，按料液比1∶10加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液后揮干，即得3種樣品的乙醇提取物。將3種樣品的乙醇提取物與陽性對(duì)照品2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT))配制成不同質(zhì)量濃度(0.1，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mg/mL)的溶液，備用。

1.5.2DPPH自由基清除活性的測(cè)定配制200 μmol/L 的DPPH無水乙醇溶液，利用96孔板測(cè)定其吸光度值。其中樣品測(cè)定孔：將80 μL DPPH溶液加入到80 μL不同質(zhì)量濃度的提取液中；樣品對(duì)照孔：將80 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液加入到80 μL不同質(zhì)量濃度的提取液中；空白孔：加入160 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇；空白對(duì)照孔：將80 μL DPPH加入到80 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中。混勻，室溫避光靜置30 min后，在517 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為：

DPPH自由基清除率=[A3-(A1-A2)]/A3×100%。

式中：A1為樣品在517 nm處的吸光度；A2為樣品對(duì)照在517 nm處的吸光度；A3為空白對(duì)照在517 nm處的吸光度。

1.5.3ABTS自由基清除活性的測(cè)定配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，取5 mL過硫酸鉀溶液加入到15 mL ABTS溶液中，室溫下置于黑暗避光處反應(yīng)16 h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。測(cè)定時(shí)，將ABTS自由基儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，使之在734 nm處的吸光度為0.70±0.05，備用。利用96孔板測(cè)定其吸光度值，其中樣品測(cè)定孔：將200 μL ABTS自由基儲(chǔ)備液與50 μL不同質(zhì)量濃度樣品及陽性對(duì)照品混合；空白孔：加入250 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇；空白對(duì)照孔：加入200 μL ABTS溶液與50 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，混合。室溫下避光反應(yīng)30 min后，在734 nm處測(cè)定其吸光度。ABTS自由基清除率的計(jì)算公式為：

ABTS自由基清除率=(AC-AS)/AC×100%。

式中：AC為空白對(duì)照在734 nm處的吸光度值；AS為樣品或陽性對(duì)照品在734 nm處的吸光度值。

試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作圖，利用SPSS 19.0中的Probit分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析其半數(shù)清除率。

1.5.4還原力的測(cè)定配制pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將200 μL磷酸鹽緩沖溶液、200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液與200 μL樣品或陽性對(duì)照品混合，在50 ℃下水浴20 min，迅速冷卻，后加入200 μL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，在2 000 r/min條件下離心10 min。取上清液100 μL，加入100 μL雙蒸水和20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵溶液。利用96孔板于700 nm處測(cè)定其吸光度。測(cè)得的吸光度值越高，說明其還原力越強(qiáng)。

2結(jié)果與分析

2.1毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中異黃酮苷元含量的測(cè)定

2.1.1混合對(duì)照品溶液中各成分含量的測(cè)定大豆苷元、黃豆黃素、染料木素混合對(duì)照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中各異黃酮苷元成分含量的測(cè)定結(jié)果見表1。

海綿城市是指城市如同海綿一樣，在蓄水方面可以體現(xiàn)出良好的彈性，該理念是在2012年低碳城市論壇上首次被提出。我國(guó)古代的坡搪系統(tǒng)、三角洲的?；~搪系統(tǒng)等體現(xiàn)了人類的生存智慧：將水作為財(cái)，就地蓄留、就地消化旱澇問題，“海綿”的哲學(xué)即是就地調(diào)節(jié)旱澇。開展海綿城市建設(shè)是解決目前我國(guó)城市水環(huán)境面臨的“逢雨必澇、雨停即旱”、雨水徑流污染、水資源短缺等問題的有效涂徑。

表 1　混合對(duì)照品中大豆苷元、黃豆黃素、染料木素含量的測(cè)定Table 1　Contents of daidzein,glycitein and genistein in control sample　 μg/g

經(jīng)分析，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積(Y)與其含量(X)的回歸方程分別為：

大豆苷元：Y=1.0×108X-7 285.7，R2=1.000 0 (n=5)；

黃豆黃素：Y=1.0×108X-8 053.8，R2=0.999 9 (n=5)；

染料木素：Y=2.0×108X-7 124.2，R2=1.000 0 (n=5)。

上述結(jié)果表明，大豆苷元、黃豆黃素與染料木素的質(zhì)量濃度分別在1.21～19.40，0.84～13.40，1.73～27.60 μg/mL時(shí)與峰面積呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。

2.1.2毛豆、發(fā)酵處理毛豆及大豆樣品中異黃酮苷元含量的測(cè)定異黃酮苷元混合對(duì)照品、發(fā)酵處理毛豆、毛豆及大豆樣品的HPLC分析結(jié)果如圖1所示。經(jīng)測(cè)算，毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中3種異黃酮苷元的含量如表2所示。由表2可知，發(fā)酵處理毛豆中染料木素含量明顯增加，其含量分別是毛豆和大豆的2.05和5.71倍。

2.2毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中多酚類化合物總含量的測(cè)定

沒食子酸質(zhì)量濃度(X)與760 nm下吸光度(Y)的回歸方程為：Y=0.077 6X-0.012 7，R2=0.998 7。在0～32 μg/mL內(nèi)，沒食子酸的質(zhì)量濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

測(cè)算結(jié)果表明：毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆中多酚類化合物總含量分別為(2.69±0.011) mg/g、(3.31±0.138) mg/g和(1.148±0.028) mg/g。可見發(fā)酵處理毛豆中的多酚類化合物總含量最大，分別為毛豆和大豆多酚類化合物總含量的1.2和2.9倍。

圖 1　異黃酮苷元對(duì)照品及發(fā)酵處理毛豆、毛豆、大豆異黃酮苷元的HPLC色譜分析 1.大豆苷元；2.黃豆黃素；3.染料木素Fig.1　HPLC chromatograms of isoflavone aglycone reference substance,fermented edamame,edamame and soybean 1.Daidzein;2.Glycitein;3.Genistein表 2　3種大豆樣品中異黃酮苷元的平均含量Table 2　Average content of soybean isoflavone in edamame μg/g

樣品Sample大豆苷元Daidzein黃豆黃素Glycitein染料木素Genistein發(fā)酵處理毛豆Fermentededamame286.0465.5126.40毛豆Edamame255.9657.9612.88大豆Soybean358.0859.734.62

2.3毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇提取物抗氧化活性的比較

2.3.1DPPH自由基清除能力由圖2可以看出，隨著各樣品質(zhì)量濃度的增加，樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用均有所增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，陽性對(duì)照(BHT)對(duì)DPPH自由基的清除率為81.91%，之后趨于穩(wěn)定，表明DPPH自由基基本被清除。

經(jīng)計(jì)算，發(fā)酵毛豆乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)為4.974 mg/mL，毛豆、大豆乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)分別為7.944 和12.533 mg/mL。因此，發(fā)酵毛豆乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于毛豆和大豆乙醇提取物。

圖 2　毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇 提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.2　Scavenging rate of DPPH radical by ethanol extracts from edamame,fermented edamame and soybean

2.3.2ABTS自由基清除能力由圖3可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用均有所增強(qiáng)。在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，陽性對(duì)照(BHT)對(duì)ABTS自由基的清除率為87.33%，之后趨于穩(wěn)定，表明ABTS自由基基本被清除。毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇提取物對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除效果。經(jīng)計(jì)算，發(fā)酵處理毛豆乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的半數(shù)清除率(IC50)為 0.455 mg/mL<0.5 mg/mL，而毛豆、大豆乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的半數(shù)清除率(IC50)分別為 1.033 和0.964 mg/mL。與毛豆和大豆的乙醇提取物相比，發(fā)酵處理毛豆乙醇提取物的ABTS自由基清除能力更強(qiáng)。

2.3.3乙醇提取物還原力的比較圖4表明，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，各樣品的還原力均有所增強(qiáng)。在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，陽性對(duì)照(BHT)、毛豆、發(fā)酵毛豆和大豆乙醇提取物在700 nm處的吸光度分別為0.299，0.009，0.110和0.060。在樣品質(zhì)量濃度為0.1～8.0 mg/mL時(shí)，毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇提取物的還原力與其質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系，即還原力隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。同時(shí)還可以看出，發(fā)酵處理毛豆乙醇提取物的還原力較毛豆與大豆乙醇提取物高。

圖 3　毛豆、發(fā)酵處理毛豆和大豆乙醇 提取物對(duì)ABTS自由基的清除活性Fig.3　Scavenging rate of ABTS radical by ethanol extracts from edamame,fermented edamame and soybean圖 4　毛豆、發(fā)酵毛豆和大豆乙醇提取物的還原力比較Fig.4　Reducing power of ethanol extracts from edamame, fermented edamame and soybean

3討論

大豆異黃酮(Soybean Isoflavones)是大豆生長(zhǎng)中形成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。張炳文等[13]發(fā)現(xiàn)，大豆食品經(jīng)過發(fā)酵處理后，游離型大豆異黃酮含量增高，糖苷型大豆異黃酮含量降低。Wei等[14]指出，大豆異黃酮組分中能夠產(chǎn)生生理活性的是游離苷元，而不是結(jié)合糖苷。大豆異黃酮的抗氧化活性大小與其構(gòu)效關(guān)系很大，其中染料木素為主要抗氧化作用組分，大豆苷元抗氧化作用不大[15]。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，羥基化程度和羥基位置是黃酮類化合物具有抗氧化活性的主要原因之一，染料木素在C-5、C-7和 C-4′位共有3個(gè)羥基，而大豆苷元只在C-7和C-4′有2個(gè)羥基，從羥基數(shù)目上看，染料木素較大豆苷元多1個(gè)羥基，其抗氧化效果優(yōu)于大豆苷元；從羥基結(jié)構(gòu)上看，由于異黃酮結(jié)構(gòu)中B環(huán)C-4′位羥基的存在，A環(huán)C-5上有羥基會(huì)使抗氧化活性增強(qiáng)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)異黃酮的抗氧化活性強(qiáng)弱起重要的作用[14]。而大豆苷元缺少C-5位羥基，所以大豆苷元的抗氧化活性更加弱于染料木素。關(guān)于這2種大豆異黃酮抗氧化活性的大小，榮玉芝等[16]通過密度泛函B3LYP理論方法，研究表明分子前線軌道能隙值較小的染料木素更容易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，與大豆苷元相比其更容易發(fā)生脫氫反應(yīng)生成酚氧自由基，因此其抗氧化活性更強(qiáng)。毛豆發(fā)酵后染料木素含量增多，這在一定程度上增強(qiáng)了其抗氧化活性。

膳食中富含一些植物化學(xué)物質(zhì)如植物多酚等，能夠清除自由基而保護(hù)機(jī)體。多酚類化合物(Polyphenol)是植物中一組化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱，是植物代謝過程中的次生產(chǎn)物，因含有多個(gè)酚羥基團(tuán)而得名。多酚中的單體物質(zhì)包含各種黃酮類化合物，其廣泛存在于蔬菜水果中，是人們?nèi)粘z入最多的抗氧化物質(zhì)[17]。肖洪等[18]的研究表明，合適菌種及菌種合理搭配發(fā)酵法可以增加桑葉茶中的多酚類物質(zhì)含量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵處理毛豆中的多酚類物質(zhì)有所增加。毛豆中所含的抗氧化成分中包含有維生素C。蔡夢(mèng)珊等[19]比較了毛豆、大豆中的維生素C含量，結(jié)果顯示每100 g毛豆中的維生素C含量為36.7 mg，而大豆中并不含有維生素C。同時(shí)米書梅等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，果蔬的抗氧化性與其含有的多酚類物質(zhì)的相關(guān)性較強(qiáng)，與維生素C的相關(guān)性較弱。說明多酚對(duì)果蔬抗氧化能力的影響強(qiáng)于維生素C，多酚類物質(zhì)對(duì)果蔬抗氧化能力的貢獻(xiàn)較大。

本試驗(yàn)測(cè)定了發(fā)酵處理毛豆、大豆及未發(fā)酵處理毛豆樣品乙醇提取物的抗氧化活性，表明發(fā)酵處理毛豆的ABTS自由基與DPPH自由基清除能力均優(yōu)于大豆和毛豆，發(fā)酵處理毛豆、大豆和毛豆三者還原力的大小順序?yàn)榘l(fā)酵處理毛豆>毛豆>大豆。這可能與毛豆發(fā)酵過程中染料木素及多酚類化合物的增加有關(guān)，但其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本研究采用酸水解回流提取結(jié)合HPLC法測(cè)定了毛豆、大豆及發(fā)酵處理毛豆的異黃酮苷元含量，結(jié)果表明發(fā)酵處理毛豆中的染料木素含量(26.40 μg/g)約為未發(fā)酵毛豆(12.88 μg/g)和大豆(4.62 μg/g)的2.05和5.71倍；多酚類物質(zhì)總含量的測(cè)定結(jié)果表明，發(fā)酵處理毛豆中的多酚類化合物總含量((3.31±0.138) mg/g)分別是未發(fā)酵處理毛豆((2.69±0.011) mg/g)和大豆((1.148±0.028) mg/g)的1.2和2.9倍。對(duì)發(fā)酵處理毛豆、大豆及未發(fā)酵處理毛豆乙醇提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力及還原力試驗(yàn)表明，發(fā)酵處理毛豆具有較強(qiáng)的抗氧化活性及較高的還原力。上述研究結(jié)果提示，發(fā)酵處理是新興大豆產(chǎn)業(yè)——毛豆類保健產(chǎn)品開發(fā)與利用的一種好途徑。

志謝：中國(guó)琿春華瑞參業(yè)生物工程有限公司為本研究提供了毛豆和大豆試驗(yàn)樣品，在此深表謝忱。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.028

[收稿日期]2011-11-21

[基金項(xiàng)目]吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YYZX201135)

[作者簡(jiǎn)介]李爽(1988-)，女，吉林松原人，在讀碩士，主要從事天然藥物研究。E-mail：shuangli_0407@163.com [通信作者]劉文叢(1968-),男,吉林長(zhǎng)春人，教授，碩士生導(dǎo)師,主要從事天然藥物研究。E-mail:jwlw6803@126.com

[中圖分類號(hào)]S565.109.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)07-0202-07

Effect of fermentation on isoflavone aglycone contents in edamame and antioxidant activity of ethanol extracts

LI Shuang,ZHENG Yinan,HAN Jiatong,DING Chuanbo,LIU Wencong

(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to determine the contents of daidzein,glycitein,genistein,and total polyphenols in edamame, fermented edamame and soybean and analyze the antioxidant activities of ethanol extracts.【Method】 Soybean isoflavones in samples were hydrolyzed by acid reflux,and daidzein,glycitein and genistein were quantified by high-performance liquid chromatography.The total polyphenols in edamame,fermented edamame and soybean were determined by Folin-Ciocalteu colorimetric.The antioxidant activities of ethanol extracts were compared by scavenging of DPPH and ABTS radicals and testing reducing power.【Result】 The contents of daidzein in edamame,fermented edamame and soybean were 255.96,286.04 and 358.08 μg/g,the contents of glycitein were 57.96,65.51 and 59.73 μg/g,and the contents of genistein were 12.88,26.40 and 4.62 μg/g,respectively.The content of genistein increased significantly after fermentation and was 2.05 and 5.71 times of those in edamame and soybean,respectively.The total contents of polyphenolic compounds in fermented edamame,soybean and edamame were (3.31±0.138) mg/g,(2.69±0.011) mg/g,and (1.148±0.028) mg/g.The content in fermented edamame was about 2.9 and 1.2 times of those in soybean and edamame.Ethanol extracts from fermented edamame had stronger antioxidant activity in scavenging of DPPH and ABTS radicals than those from edamame and soybeans.The reducing power was in a decreasing order of fermented edamame>edamame>soybean.【Conclusion】 After fermentation,the contents of three isoflavone aglycone in edamame increased,and genistein increased the most.The total content of phenolic compounds in fermented edamame was higher than edamame and radical scavenging activity was increased.

Key words:edamame;fermentation;soybean isoflavone aglycone;polyphenols;antioxidant activity

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