董園園，劉秀明，姚　娜，趙利旦，李海燕

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118)

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紅花miR397a基因表達(dá)及對(duì)靶基因LAC2的調(diào)控作用

董園園，劉秀明，姚娜，趙利旦，李海燕

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118)

[摘要]【目的】 研究紅花miR397a前體基因及成熟基因在紅花不同組織中的表達(dá)水平，并對(duì)miR397a基因序列、靶基因及基因功能進(jìn)行分析，為深入研究紅花抗逆機(jī)制提供參考?！痉椒ā?提取紅花籽粒、花瓣、莖、根、葉片等5個(gè)組織材料的總RNA，使用熒光定量PCR鑒定miR397a在不同組織中的表達(dá)水平；利用生物信息學(xué)方法分析紅花miR397a基因序列，用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法驗(yàn)證紅花miR397a調(diào)控的靶基因LAC2，并利用轉(zhuǎn)基因擬南芥表型研究miR397a基因的功能。【結(jié)果】 miR397a前體基因和成熟基因均能在紅花不同組織中表達(dá)，且均以葉片組織中的表達(dá)量最高，分別是籽粒組織的2.5與1.9倍，差異達(dá)極顯著水平；miR397a序列在不同物種間高度保守，序列中僅存在 1～2個(gè)堿基的錯(cuò)配或缺失；miR397a對(duì)LAC2基因有調(diào)控作用，miR397a的過表達(dá)可引起LAC2表達(dá)水平降低，紅花miR397a表達(dá)引起植物對(duì)NaCl的敏感性增加。【結(jié)論】 紅花miR397a在葉片組織中的表達(dá)量最高，基因序列保守，且紅花miR397a表達(dá)可增強(qiáng)植物對(duì)NaCl的敏感性。

[關(guān)鍵詞]紅花；miR397a；LAC2；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為18～24 nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA，來源于具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈microRNA前體基因內(nèi)部，經(jīng)RNA內(nèi)切酶Ⅱ加工后從前體基因上釋放并獲得成熟基因。microRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上與靶mRNA形成RISC復(fù)合物，通過誘導(dǎo)mRNA的降解或抑制蛋白翻譯發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[1]，從而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、開花時(shí)序、環(huán)境應(yīng)激、組織特異性分化等生理活動(dòng)[2]。miR397是一類高度保守的microRNA基因家族，在擬南芥及落葉松中均保守存在[3-4]，在水稻不同發(fā)育階段及不同組織中，miR397家族成員的基因表達(dá)水平差異明顯[5]。

漆酶(LAC)為藍(lán)銅氧化酶家族(Blue copper oxidase)成員，屬于氧化還原酶。最近在擬南芥花序研究中發(fā)現(xiàn)LAC為miR397的調(diào)控靶基因[4]。Zhang等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，水稻miR397可通過對(duì)靶基因LAC的調(diào)控影響水稻花序數(shù)量及穗粒大小。有研究還發(fā)現(xiàn)，LAC除影響植物花序發(fā)育外，在植物中還參與干旱及鹽等逆境環(huán)境的應(yīng)激調(diào)節(jié)，LAC的過表達(dá)可引起植物逆境耐受性提高[6-7]。

紅花(CarthamustinctoriusL.)又名草紅花，是中國(guó)及西亞地區(qū)廣泛種植的集經(jīng)濟(jì)價(jià)值與藥用價(jià)值為一體的植物，紅花栽培品種具有適度抗逆性，在生長(zhǎng)過程中能夠適應(yīng)輕度的干旱及鹽堿等非生物脅迫[8-9]。紅花microRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育、組織分化及環(huán)境適應(yīng)等過程中也參與并執(zhí)行重要的調(diào)控作用，但是迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見與紅花microRNA逆境調(diào)控相關(guān)的報(bào)道。本研究在紅花microRNA表達(dá)譜中鑒定了miR397a基因，分析其在紅花不同組織中的表達(dá)，對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將miR397a過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)行NaCl脅迫研究，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，進(jìn)而為解析紅花抗逆作用機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用的材料品種為新疆裕民紅花(CarthamustinctoriousL.)，由中國(guó)山東菏澤潤(rùn)康中醫(yī)學(xué)院提供。紅花種植在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室內(nèi)。培育基質(zhì)用黑土、蛭石按體積比3∶7混合均勻。培養(yǎng)條件為光照16 h 室溫26 ℃、暗培養(yǎng)8 h 室溫20 ℃，相對(duì)濕度80%。收集生長(zhǎng)期第6～8片復(fù)葉、盛花期花瓣、成熟期籽粒、根、莖5個(gè)組織樣本材料，液氮處理后儲(chǔ)存于―80 ℃冰箱備用。

RNA提取試劑、microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、microRNA熒光定量PCR試劑TaqMan small RNA assays、熒光定量PCR試劑(mRNA)、DNA Marker及核酸內(nèi)切酶、T載體，均購(gòu)自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cDNA)，購(gòu)自北京百泰克公司；DNA T4連接酶，購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Midi Kit Ⅰ，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；膠回收試劑盒DNA Gel Extraction，購(gòu)自AXYGEN公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pUC-T載體，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；W5溶液配制參見Yoo等[10]方法；P1301載體及pSPYNE(R)載體由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1紅花不同組織總RNA提取及表達(dá)分析將葉片、花瓣、去種皮后的籽粒、莖、根分別于液氮中充分研磨，取100 mg植物材料置于無RNA酶的 1.5 mL離心管內(nèi)，參照TRIzol試劑說明書進(jìn)行總RNA提取。將獲得的RNA使用DEPC水溶解后，使用NanoDrop 2000在260 nm下測(cè)定總RNA的質(zhì)量濃度，并使用含有EB的1%瓊脂糖凝膠電泳估測(cè)總RNA的完整性。參照百泰克RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，分別合成紅花葉片、籽粒、花瓣、莖、根組織的cDNA。microRNA的反轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa公司的說明書進(jìn)行。使用Real-time PCR方法分析紅花不同組織樣本中成熟miR397a及miR397a前體基因的表達(dá)水平。設(shè)定18S為內(nèi)參基因[11]，進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成參照miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)及NCBI上紅花small RNA短序列SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(GSM618276、GSM618277、GSM618278)獲得miR397a成熟基因序列及前體基因序列。合成兩端帶有BamHⅠ及HindⅢ的miR397a前體基因序列，用于植物表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物miR397aPF、miR397aPR、miR397aVF、BastaVR(表1)。其中，miR397aPF、miR397aPR用于miR397a前體基因序列的擴(kuò)增及檢測(cè)，miR397aVF、BastaVR用于植物表達(dá)載體的驗(yàn)證。以上引物序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，并委托蘇州金唯智生物公司合成。

表 1　研究涉及的引物序列Table 1　Sequences of primer used in this study

1.2.3紅花miR397a基因序列分析及靶基因預(yù)測(cè)根據(jù)NCBI中紅花SRA短序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GSM618276、GSM618277、GSM618278)信息獲知，紅花miR397a前體基因序列長(zhǎng)度為107 bp，成熟序列長(zhǎng)度為21 nt。整合miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的miR397a基因資源及序列信息，使用ClustalX 2軟件，分別對(duì)紅花miR397a與其他13個(gè)不同植物物種miR397a前體及成熟序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用在線預(yù)測(cè)平臺(tái)(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?fTnction=2)根據(jù)如下規(guī)則進(jìn)行紅花miR397a的靶基因預(yù)測(cè)：(1) microRNA與靶基因間的錯(cuò)配不得超過3個(gè)，G-T配對(duì)默認(rèn)為0.5個(gè)錯(cuò)配；(2) 在microRNA與靶基因復(fù)合體中不得有超過2處發(fā)生于相鄰位點(diǎn)的錯(cuò)配；(3) 在microRNA與靶基因復(fù)合體中，從microRNA的5′端起第2～12個(gè)位點(diǎn)中，連續(xù)2個(gè)相鄰位點(diǎn)不能發(fā)生錯(cuò)配，錯(cuò)配總數(shù)不能高于2.5個(gè)；(4) microRNA與靶基因復(fù)合體的最低自由能(MFE)不應(yīng)小于該microRNA與其最佳互補(bǔ)體結(jié)合時(shí)MFE的75%[12-14]。

1.2.4紅花miR397a小分子作用載體及表達(dá)載體的構(gòu)建參考Qiu等[15]和Huang等[16]人工構(gòu)建microRNA前體的方法，在miR397a前體基因序列5′端設(shè)計(jì)加入保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)BamHⅠ及Hind Ⅲ，使用基因序列合成的方法獲得miR397a前體基因。通過T載體連接后測(cè)序驗(yàn)證，使用BamHⅠ及HindⅢ雙酶切并膠回收小分子片段，利用DNA T4連接酶將該片段插入P1301植物表達(dá)載體內(nèi)，構(gòu)建了P1301-miR397a重組載體。

以合成的miR397a前體基因?yàn)槟０澹褂脦в蠿baⅠ及SacⅠ酶切位點(diǎn)的基因引物miR397aPF-2及miR397aPR-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存?；虍a(chǎn)物連接T載體并測(cè)序正確后，通過XbaⅠ及SacⅠ雙酶切并膠回收，小分子片段通過DNA T4連接酶連到小分子表達(dá)載體pSPYNE(R)內(nèi)，獲得重組pSPYNE(R)-precusor miR397a表達(dá)載體。

1.2.5紅花miR397a的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化在細(xì)胞板中，按Yoo等[10]的方法制備紅花原生質(zhì)體細(xì)胞后，每孔鋪上200 μL紅花原生質(zhì)體細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)約 4×104個(gè)。每孔加入質(zhì)量濃度為1 000 ng/μL的重組質(zhì)粒pSPYNE(R)-precusor miR397a。每孔加入220 μL 體積分?jǐn)?shù)4%的(PEG-4000)溶液，輕輕混勻后，室溫孵育15 min。再加入920 μL W5溶液稀釋，混勻后，150g離心90 s，去上清。使用880 μL W5溶液重新懸浮，150g離心90 s，去除殘留PEG。每孔使用100 μL W5溶液重新懸浮細(xì)胞，過夜培養(yǎng)。

1.2.6紅花miR397a的擬南芥轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)化有P1301-miR397a重組載體的農(nóng)桿菌4 000 r/min、20 ℃離心15 min，去掉上清液，590 nm條件下檢測(cè)懸浮液的OD值，最終OD值達(dá)到0.8～0.9即可。將適量的農(nóng)桿菌懸浮液放到500 mL的燒杯中，將擬南芥的莖部和葉片基部都浸入到農(nóng)桿菌懸浮液中，侵染7 min；將侵染后的營(yíng)養(yǎng)缽平放，用塑料薄膜保濕過夜。侵染2周后收集全部種子。使用體積分?jǐn)?shù)1%的草銨膦連續(xù)篩選T1、T2、T3代轉(zhuǎn)miR397a基因擬南芥植株，提取擬南芥葉片基因組， PCR擴(kuò)增后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化苗的鑒定。分別使用含0，100，150，200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基萌發(fā)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，分別統(tǒng)計(jì)7 d內(nèi)轉(zhuǎn)基因株系及野生型擬南芥(對(duì)照)種子的發(fā)芽率，評(píng)估轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)NaCl的耐受能力。

1.3數(shù)據(jù)處理及分析

不同組織miR397a表達(dá)水平及野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥株系發(fā)芽率的差異，均采用t-test判斷是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1紅花miR397a在不同組織中的表達(dá)分析

miR397a(A)和miR397a前體(B)在紅花不同組織中表達(dá)的qRT-PCR分析見圖1。

圖 1　miR397a(A)和miR397a前體(B)在紅花不同組織中表達(dá)的qRT-PCR分析 *，**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著水平(P<0.01)Fig.1　Expression of miR397a (A) and miR397a precursor (B) in different tissues of safflower * indicates significant difference (P<0.05),and ** indicates extremely significant difference (P<0.01)

由圖1可知，miR397a在葉片組織中的表達(dá)量較籽粒、花瓣、根、莖組織中高，且miR397a基因在葉片組織中的表達(dá)量是籽粒組織的2.5倍，差異表達(dá)具有極顯著性(P<0.01)(圖1-A)；miR397a前體基因在紅花不同組織中的表達(dá)分布趨勢(shì)與miR397a成熟基因一致，也是在葉片組織中表達(dá)量最高，是籽粒組織的1.9倍，差異也達(dá)顯著性水平(P<0.05)(圖1-B)。

2.2紅花miR397a基因序列的生物信息學(xué)分析

由圖2可知，紅花miR397a前體基因與擬南芥、水稻、楊樹、葡萄、大麥的miR397a前體基因親緣關(guān)系最近，歸為一類；與蘋果、油菜、芹葉擬南芥親緣關(guān)系較近；與玉米、亞麻、短柄草miR397a前體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與大豆、無油樟親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，最后才聚到一起。紅花miR397a成熟基因與擬南芥、芹葉擬南芥、大豆、短柄草、葡萄、油菜、水稻、楊樹miR397a的相似度達(dá)90%以上，且該基因在上述植物物種中高度保守，序列中僅存在1～2個(gè)堿基的錯(cuò)配或缺失(圖3)。

圖 2不同植物物種中miR397a序列前體的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.2Phylogenetic tree of miR397a precursor from different plant species

圖 3　不同植物物種中成熟miR397a序列的比對(duì) * 一致性序列Fig.3　Sequence alignment of miR397a sequences from different plant species * Consensus sequence

2.3紅花miR397a的靶基因預(yù)測(cè)

用紅花miR397a序列及SRA數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRX101827)，進(jìn)行microRNA對(duì)應(yīng)調(diào)控的靶基因信息預(yù)測(cè)，結(jié)果共預(yù)測(cè)到7個(gè)靶基因(表2和表3)，其中靶基因unigene88135的基因功能注釋為漆酶基因LAC2。

表 2　紅花miR397a的靶基因預(yù)測(cè)Table 2　Target prediction of miR397a

表 3　紅花miR397a對(duì)靶基因的調(diào)控預(yù)測(cè)Table 3　Prediction of target regulation by miR397a

2.4紅花miR397a對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

為研究miR397a對(duì)靶基因的調(diào)控作用，將帶有miR397a前體基因的表達(dá)載體P35S-precursor通過PEG-4000介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化紅花原生質(zhì)體細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR397a基因及紅花葉片原生質(zhì)體中unigene88135基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化miR397a前體表達(dá)載體的原生質(zhì)體內(nèi)，miR397a表達(dá)水平顯著升高，t檢驗(yàn)顯示該差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.03)。同時(shí)檢測(cè)unigene88135的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化miR397a前體表達(dá)載體后，unigene88135的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.02)(圖4)，說明miR397a在轉(zhuǎn)錄過程中對(duì)unigene88135具有轉(zhuǎn)錄后抑制的調(diào)控作用。

圖 4　紅花miR397a的表達(dá)(A)及對(duì)靶基因的調(diào)控(B)分析Fig.4　Expression of miR397a (A) and target gene regulation (B)

2.5轉(zhuǎn)miR397a基因擬南芥的鑒定

對(duì)重組載體P1301-miR397a進(jìn)行BamHⅠ及Hind Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果(圖5-A)顯示，酶切產(chǎn)物的核酸片段長(zhǎng)度大小為107 bp，與預(yù)期結(jié)果大小一致，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將含有重組質(zhì)粒P1301-miR397a的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，利用Bar基因篩選標(biāo)記及基因組PCR鑒定方法，經(jīng)過T1、T2代擬南芥篩選鑒定，獲得遺傳穩(wěn)定的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，并以T3代擬南芥基因組為模板，獲得了含miR397a基因的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小為763 bp(圖5-B)，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，顯示已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)miR397a基因的擬南芥。

圖 5轉(zhuǎn)miR397a基因擬南芥的鑒定

A．重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后產(chǎn)物；M.DNA DL 2000 Marker;1.質(zhì)粒；2.酶切產(chǎn)物;

B.轉(zhuǎn)miR397a的T3代擬南芥基因組；M.DNA DL 2000 Marker;N.陰性對(duì)照;P.陽性對(duì)照,1～5.不同轉(zhuǎn)基因植株的基因擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.5PCR results of T3 transgenicArabidopsis

A.Products of recombinant plasmid digested byBamHⅠ andHind Ⅲ;M.DNA DL 2000 Marker;1.Plasmid;2.Restriction enzyme digestion product；B.PCR validation of transgenicArabidopsis;M.DNA DL 2000 Marker;N.Negative control;P.Positive control,1-5.PCR products of transgenicArabidopsis

2.6紅花miR397a的功能分析

通過轉(zhuǎn)miR397a擬南芥種子的萌發(fā)試驗(yàn)，判斷過表達(dá)miR397a擬南芥的發(fā)芽率。由T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在NaCl脅迫下的發(fā)芽率可知，萌發(fā)試驗(yàn)7 d后，野生型擬南芥及轉(zhuǎn)miR397a基因擬南芥在無NaCl條件下發(fā)芽率接近，二者間無顯著差異(圖6-A)。100及150 mmol/L NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率與野生型擬南芥(對(duì)照)相比發(fā)芽率呈降低趨勢(shì)，但差異未達(dá)顯著性水平(圖6-B，6-C)。200 mmol/L NaCl濃度下，野生型擬南芥發(fā)芽率平均為69.5%，轉(zhuǎn)基因株系L1、L2發(fā)芽率平均為59%及56%，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)(圖6-D)。上述結(jié)果表明，miR397a過表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥種子在萌發(fā)過程中的NaCl敏感性。

3討論

紅花作為古老的中藥植物及油料作物，喜溫耐旱，花瓣中蘊(yùn)含豐富的羥基黃色素A、羥基黃色素B和蘆丁醇等黃酮類活性成分，具有活血化瘀、抑制血小板凝集、消炎等藥用價(jià)值[17-19]。植物microRNA研究有利于在轉(zhuǎn)錄后水平深入挖掘基因表達(dá)調(diào)控及抗逆分子機(jī)制，但紅花microRNA的已知信息資源目前并不豐富，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)尚未收錄紅花相關(guān)信息，且紅花microRNA的鑒定與功能研究才剛剛展開。

圖 6　不同NaCl質(zhì)量濃度下轉(zhuǎn)miR397a擬南芥的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)Fig.6　Germination rates of Arabidopsis under NaCl

本研究通過SRA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的miR397a基因信息，利用熒光定量PCR方法鑒定了紅花不同組織中miR397a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相較于花瓣、根、籽粒、莖等組織，miR397a在葉片組織中高表達(dá)，說明該基因表達(dá)可能與葉片組織的特異功能調(diào)控有關(guān)。對(duì)該基因的序列分析表明，紅花miR397a與擬南芥、芹葉擬南芥、大豆、短柄草、葡萄、油菜、水稻、楊樹的miR397a相似度達(dá)90%，同源性最高，為高度保守的基因序列。而miR397a前體與其他物種也具有高度同源性，相似度均在57%以上，表明該基因在進(jìn)化歷程中高度保守，這與Ninova等[20]關(guān)于“microRNA在進(jìn)化中高度保守”的研究結(jié)論一致。

microRNA作為一類非編碼小RNA，廣泛參與了真核生物的細(xì)胞分裂、組織發(fā)育、逆境響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[21]，microRNA功能的行使往往通過對(duì)靶基因的降解或抑制蛋白翻譯實(shí)現(xiàn)[22]。Jung等[23]報(bào)道，miR172通過調(diào)控靶基因TOE3實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥花序發(fā)育的調(diào)控。Vazquez等[21]報(bào)道，miR163可通過調(diào)節(jié)SMAT基因表達(dá)來影響擬南芥對(duì)外界病原體的防御作用。在擬南芥和水稻上的研究表明，LAC為miR397的靶向調(diào)控基因[23]。Lu等[24]在楊樹miR397a基因鑒定及靶基因研究中發(fā)現(xiàn)，ptr-miR397a過表達(dá)可調(diào)控漆酶基因表達(dá)水平下降，甚至使漆酶蛋白活性下降40%，使楊樹木質(zhì)素含量發(fā)生改變。紅花miR397a的靶基因預(yù)測(cè)使用了紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)miR397a可能調(diào)控的7個(gè)靶基因，揭示microRNA對(duì)靶基因的調(diào)控存在多個(gè)對(duì)應(yīng)關(guān)系。漆酶LAC2基因?yàn)閙iR397a的候選靶基因之一，在植物中與氧化還原反應(yīng)及鹽調(diào)控有關(guān)[6-7]，推斷miR397a可能參與紅花的氧化還原反應(yīng)過程，還可能參與紅花的耐鹽脅迫過程。本研究結(jié)果證實(shí)，紅花miR397a過表達(dá)導(dǎo)致LAC2基因表達(dá)水平降低；通過轉(zhuǎn)miR397a擬南芥株系的表型發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)NaCl的敏感性提高，表現(xiàn)為NaCl耐受性降低，明確紅花miR397a參與鹽脅迫耐受過程的調(diào)控。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.025

[收稿日期]2014-12-10

[基金項(xiàng)目]國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目“油體生物反應(yīng)器研制及產(chǎn)品開發(fā)”(2011AA100606)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“干旱條件下Gma-miR169對(duì)大豆蒸騰作用的調(diào)控機(jī)制研究”(31101091)

[作者簡(jiǎn)介]董園園(1985-)，女，吉林長(zhǎng)春人，講師，博士，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：yydong@aliyun.com [通信作者]李海燕(1972-)，女，吉林舒蘭人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物基因工程研究。E-mail：hyli99@163.com

[中圖分類號(hào)]Q789

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)07-0173-08

Expression of safflower miR397a gene and its role inLAC2 regulation

DONG Yuanyuan,LIU Xiuming,YAO Na,ZHAO Lidan,LI Haiyan

(MinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study analyzed the expression levels of precursor of miR397a and mature miR397a gene in different safflower tissues,identified the sequence of miR397a, predicted its target genes and explored its function.【Method】 Total RNA was extracted from 5 issues including seed,petal,leaf,stem and root of safflower and qRT-PCR was employed to analyze the gene expression levels.Sequence analysis and target genes prediction were conducted by bioinformatics methods.Protoplast transformation method was employed to validate target gene regulated by safflower miR397a.At last,transgenic Arabidopsis was used to discuss function of miR397a gene.【Result】 The expressions of miR397a precursor and mature miR397a were higher in safflower leaf than in other tissues.Their expressions in leaf were 2.5 and 1.9 times higher than in seed with extremely significant difference.The miR397a was highly conservative in different plants with only one or two bases mismatching or missing.Gene miR397a played role in LAC2 regulation.Over expression of miR397a could decrease LAC2 expression level and miR397a expression could increase plant sensibility to NaCl.【Conclusion】 Conserved miR397a expresses the highest in leaf,and it could increase plant sensibility to NaCl.

Key words:Carthamus tinctorius L.;miR397a;LAC2;post-transcriptional regulation

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.050.html