肖春萍，楊利民，韓　梅，程　林，馬鋒敏，郭雙雙

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，吉林 長春 130118)

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人參主要病原菌生防真菌的篩選及鑒定

肖春萍，楊利民，韓梅，程林，馬鋒敏，郭雙雙

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，吉林 長春 130118)

[摘要]【目的】 篩選對人參主要病原菌具高效、廣譜抑菌作用的生防真菌，豐富人參生防菌菌種資源?！痉椒ā?采用稀釋平板法，從吉林省2處采樣地的人參健株根際土壤中分離真菌；采用平板對峙培養(yǎng)法，通過初篩和復(fù)篩，篩選對人參鏈格孢菌(Alternaria panax)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、毀滅柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)、人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)具有高效廣譜抑菌活性的生防真菌；利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS分子分析技術(shù)對分離到的生防真菌進(jìn)行鑒定。【結(jié)果】 從人參健株根際土壤中共分離得到400株真菌，其中有15株生防真菌對人參7種主要病原菌具有廣譜抑菌作用，特別是對立枯絲核菌有強(qiáng)烈的抑制作用(抑菌率均大于50%)，且FSR-106的抑菌作用最強(qiáng)(抑菌率87.41%，下同)；FSR-121對人參鏈格孢菌的抑菌作用最強(qiáng)(60.00%)；FSR-74對腐皮鐮孢菌的抑菌率高達(dá)67.48%；FSR-46對毀滅柱孢菌和灰葡萄孢菌的抑菌率最大(66.67%和68.97%)；FSR-97對惡疫霉菌及人參核盤菌的抑制作用最強(qiáng)(73.33%和66.67%)。通過形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析鑒定發(fā)現(xiàn)，15株生防真菌中有8株木霉屬(Trichoderma)、3株青霉屬(Penicillium)、1株曲霉屬(Aspergillus)、1株附球菌屬(Epicoccum)、1株毛殼菌屬(Chaetomium)和1株輪層炭殼屬(Daldinia)，其中FSR-38為黑附球菌(Epicoccum nigrum)，F(xiàn)SR-10、FSR-43和FSR-106為深綠木霉(T.atroviride)，F(xiàn)SR-46為長枝木霉(T.longibrachiatum)，F(xiàn)SR-55為鉤狀木霉(T.hamatum)，F(xiàn)SR-72為桔綠木霉(T.citrinoviride)，F(xiàn)SR-74為球毛殼菌(Chaetomium globosum)，F(xiàn)SR-97為多孢木霉(Trichoderma polysporum)，F(xiàn)SR-91為蔡氏輪層炭殼菌(Daldinia childiae)，F(xiàn)SR-25、FSR-67和FSR-121為青霉屬(Penicillium sp.)?！窘Y(jié)論】 從人參健株根際土壤中可快速有效地篩選獲得大量廣譜性生防真菌；本研究所得的15株生防真菌對7種人參主要病害防治具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]人參病原菌；木霉屬；rDNA-ITS序列分析；生防真菌

人參(PanaxginsengC.A.Mey)為五加科多 年生草本植物，是傳統(tǒng)名貴中藥材，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。吉林省東北部是我國人參的主產(chǎn)區(qū)，人參種植業(yè)已成為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)之一[1]。長期種植和品種選育難度大導(dǎo)致人參種質(zhì)退化、土傳病害嚴(yán)重，根部病害發(fā)生率為20%～70%[2]。人參病害有 20～40種[3]，其中根腐病、銹腐病、黑斑病、灰霉病、立枯病、菌核病及疫病是人參的7種主要病害，對人參品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生了極大的影響。因此，土傳病害 防控成為制約人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題之一。

在人參病害防治上，化學(xué)農(nóng)藥防治因其高效、操作方便、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點(diǎn)而被長期廣泛應(yīng)用[4]，然而，化學(xué)農(nóng)藥防治不當(dāng)不僅會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，還會(huì)降低人參藥材的安全性和商品價(jià)值[5-6]。國家《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》明確指出，提倡使用生防制劑防治植物病害，因此生防微生物防治已成為植物病蟲害綜合治理的重要手段[7-9]。土壤真菌是土壤微生物的主要成員，土壤中的生防真菌可通過競爭、重寄生和代謝產(chǎn)物抗生作用等防治植物病害[10]，已報(bào)道的生防真菌包括木霉屬[11]、青霉屬[12]及毛殼菌屬[13]真菌。國內(nèi)外研究者利用生防微生物防治人參病害，得到了多株對人參病原菌有拮抗作用的有益菌[14-16]，但有關(guān)生防真菌的分離鑒定研究較少[17-18]，且大多數(shù)生防真菌僅作用于1種或同時(shí)作用于2～3種人參病原菌，不能滿足實(shí)際生物防治的需要。鑒于此，本試驗(yàn)以吉林撫松地區(qū)人參健株根際土壤為研究對象，分離篩選對人參7種病害主要病原菌具有高效廣譜抑菌效果的真菌菌株，并通過形態(tài)特征觀察以及rDNA-ITS 序列分析對菌株進(jìn)行鑒定，旨在豐富人參生防真菌菌種資源，為進(jìn)一步開發(fā)廣譜型人參生防菌劑和生物農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究區(qū)概況采樣地Ⅰ位于吉林省撫松縣榆樹小西南叉(42°32′18.4″ N， 127°08′34.7″ E，海拔537 m)，采樣地Ⅱ位于撫松松江河4 km處(42°08′42.3″ N， 127°32′29.2″ E，海拔718 m)，2樣地均屬于中溫帶濕潤寒冷氣候，冬季漫長、寒冷、積雪深厚；夏季短促，較熱；年平均氣溫為4 ℃，極端最低氣溫-44.1 ℃，極端最高氣溫34.8 ℃；年平均降水量為800 mm，植被類型為針闊混交林，供試土壤均為暗棕色森林土。

1.1.2取樣2012年5月、7月及9月于吉林省撫松縣采樣地Ⅰ采集伐林翻耕后待栽人參土壤及直播1，2和3年生健康人參植株根際土；在采樣地Ⅱ采集2年生倒栽1年的人參健株根際土、3年生倒栽1年的人參健株根際土、2003年及2007年撂荒參后土壤。以“S”型取樣法分別選取5個(gè)樣點(diǎn)，去除表面枯枝落葉等雜物后采集土壤樣品，按人參根際分布采樣深度0～20 cm均勻采集，共采集土壤樣品120份。各樣地中不同樣點(diǎn)采集的鮮土充分混合均勻低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后過2 mm篩，于4 ℃保存，用于生防真菌的分離篩選。

1.1.3供試標(biāo)靶人參病原菌菌株供試人參鏈格孢菌(Alternariapanax)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、毀滅柱孢菌(Cylindrocarpondestructans)、惡疫霉菌(Phytophthoracactorum)、人參核盤菌(Sclerotiniaschinseng)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，4 ℃斜面低溫保藏。

1.1.4培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基(CZA培養(yǎng)基),其中用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行土壤真菌的篩選及分離，用PDA培養(yǎng)基和CZA培養(yǎng)基進(jìn)行生防真菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2方法

1.2.1人參根際土壤中真菌的分離、計(jì)數(shù)采用傳統(tǒng)的稀釋平板法[14]進(jìn)行人參根際土壤真菌的分離、計(jì)數(shù)。稱取10 g人參根際土壤置于90 mL裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，振蕩2 min，取1 mL振蕩液于9 mL滅菌生理鹽水中，按梯度依次稀釋至10-2，10-3，10-4g/mL。吸取100 μL振蕩液涂布于PDA平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，挑取菌落形態(tài)、大小及顏色等不一的單菌落于PDA培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，以涂布無菌水作為空白對照。

1.2.2人參根際土壤中真菌的純化采用單孢分離純化法[19]進(jìn)行人參根際土壤真菌的純化。將分離純化獲得的真菌菌塊置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃繼代培養(yǎng)3次后轉(zhuǎn)接于PDA試管培養(yǎng)基中，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3人參生防真菌的初篩采用2點(diǎn)杯碟平板對峙法及生長速率法，對分離獲得的400株真菌進(jìn)行菌體抑菌活性初篩。將1.1.3節(jié)7種人參常見病原菌作為靶標(biāo)菌，分別挑取少量病原菌和真菌菌塊于PDA平板上25 ℃活化4 d。在活化后的病原菌及真菌菌落邊緣打取菌餅(直徑=5 mm)接入同一PDA平板兩側(cè)，2菌餅相距3 cm，以只接種人參病原菌菌餅的培養(yǎng)皿為空白對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)7 d后觀察是否產(chǎn)生拮抗帶。

1.2.4人參生防真菌的復(fù)篩采用3點(diǎn)杯碟平板對峙法及生長速率法，依1.2.3節(jié)方法得到菌餅后，在PDA平板中央接入一個(gè)直徑5 mm的病原菌菌餅，在距病原菌2.5 cm處的3個(gè)方位各接入同一待測生防真菌菌餅，另1個(gè)方位為空白，以僅接種人參病原菌的平板為空白對照，3次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)7 d后測量拮抗半徑并計(jì)算抑菌率。

抑菌率= (對照病原菌菌落擴(kuò)展半徑-生防真菌對峙培養(yǎng)的病原菌菌落擴(kuò)展半徑)/對照病原菌菌落擴(kuò)展半徑×100%。

1.2.5人參生防真菌的鑒定(1)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定。按照《真菌鑒定手冊》[20]和《中國真菌志》將生防真菌鑒定到屬。具體操作為：將純化得到的人參生防真菌菌株接種到PDA或CZA培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)觀察菌落的質(zhì)地、顏色、在培養(yǎng)基上的生長速度以及產(chǎn)生的色素等形態(tài)特征。同時(shí)挑取少量不同生長時(shí)期的人參生防真菌菌絲，置于潔凈載玻片上，加蓋玻片制得臨時(shí)性玻片標(biāo)本，采用基恩士超景深三維立體顯微鏡(VHX-600)觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子的大小和形態(tài)。

(2)rDNA-ITS序列鑒定。利用真菌rDNA ITS(Internally transcribed spacer)區(qū)段既具保守性，又在科屬種水平上有特異性序列的特性，對人參生防真菌的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及序列分析，將生防真菌鑒定到種。具體操作為：采用TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa Code：DV811A)進(jìn)行人參生防真菌基因組的提取。利用真菌rDNA的ITS通用引物ITS 4和 ITS 5[21]，進(jìn)行rDNA-ITS-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，ddH2O 7.8 μL，DNA 模板 1 μL，ITS 4 0.6 μL，ITS 5 0.6 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序，測序結(jié)果登錄GenBank，利用Blast(hppt:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，獲得相似度較高菌株的rDNA-ITS序列作為參比菌株。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差(Duncan’s新復(fù)極差法)分析，進(jìn)行同一生防菌株對不同人參病原菌抑菌活性以及不同生防真菌對同一人參病原菌抑菌活性的差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1人參根際土壤中真菌的分離純化

在相同的培養(yǎng)條件下，根據(jù)真菌的個(gè)體形態(tài)及培養(yǎng)特征，本研究從吉林省撫松縣8株人參健株根際土壤樣品中分離、純化獲得400株真菌，并依次編號為FSR-1、FSR-2、FSR-3，…，F(xiàn)SR-400。其中5月份分離得到真菌125株，7月份分離得到真菌140株，9月份分離得到真菌135株，這表明人參根際土壤中存在大量的微生物資源；5月、7月及9月分離獲得真菌數(shù)目相當(dāng)，說明不同季節(jié)人參健株根際土壤中可培養(yǎng)真菌數(shù)量變化不明顯，各季節(jié)均適宜進(jìn)行人參根際土壤樣品中微生物研究。

2.2人參根際土壤中生防真菌的初篩

對分離得到的400株真菌進(jìn)行抑菌活性初篩，得到50株對人參不同病原菌具抑菌活性的菌株(表1)，生防菌株檢出率為12.5%。以拮抗帶寬度大于0.5 cm且具廣譜抑菌活性為標(biāo)準(zhǔn)[19]，綜合分析認(rèn)為，F(xiàn)SR-10、FSR-22、FSR-25、FSR-38、FSR-43、FSR-46、FSR-55、FSR-67、FSR-72、FSR-74、FSR-91、FSR-94、FSR-97、FSR-106和FSR-121等15株真菌對7種不同人參病原菌的抑菌活性較強(qiáng)，且具有一定的廣譜性。

表 1　人參根際土壤中生防真菌的初篩結(jié)果Table 1　Preliminary screening of biocontrol fungi in rhizosphere soil of Panax ginseng

表 1(續(xù))　Continued table 1

注：+.拮抗帶寬度<0.5 cm；++.拮抗帶寬度0.5～1 cm；+++.拮抗帶寬度>1 cm；-.無抑菌活性。

Note：+.Antagonism belt width less than 0.5 cm;++.Antagonism belt width 0.5-1 cm;+++.Antagonism belt width greater than 1 cm;-.No antibacterial activity.

2.3人參根際土壤中生防真菌的復(fù)篩

采用3點(diǎn)杯碟平板對峙法及生長速率法，對初篩出的15株具有廣譜抑菌作用的生防真菌進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果見表2。

表 2　生防菌株對人參病原菌的抑菌作用Table 2　Antibacterial activity of biocontrol fungi against 7 pathogens of Panax ginseng　%

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一菌株對不同病原菌的抑菌率差異顯著(P<0.05)；同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示不同菌株對同一病原菌的抑菌率差異顯著(P<0.05)。

Note:Lowercase letters indicate significant difference(P<0.05) for same fungus against different pathogens onP=0.05 in each row. Uppercase indicate significant difference(P<0.05) for different biocontrol fungi against same pathogens in each line.

由表2可知，F(xiàn)SR-10對立枯絲核菌、毀滅柱孢菌、惡疫霉菌、人參核盤菌和灰葡萄孢菌的抑菌作用較強(qiáng)(抑菌率50.00%～60.00%，下同)，對人參鏈格孢菌的抑菌率最低，但仍可達(dá)35.42%；FSR-22對立枯絲核菌和腐皮鐮孢菌的抑菌率分別高達(dá) 65.18%,63.70%；FSR-25對立枯絲核菌、腐皮鐮孢菌和灰葡萄孢菌的抑菌率也高達(dá)63.33%～68.26%；FSR-38對立枯絲核菌、人參核盤菌和灰葡萄孢菌的抑菌作用較強(qiáng)(57.58%～65.08%)，對其他4種人參病原菌的抑菌率較低(37.04%～54.17%)；FSR-43對立枯絲核菌的抑菌作用最強(qiáng)(75.68%)，對惡疫霉菌的抑菌作用最弱(29.63%)；FSR-46對立枯絲核菌的抑菌作用最強(qiáng)(73.33%)，同時(shí)對其他6種人參病原菌的抑菌率均可達(dá)50%左右；FSR-55對灰葡萄孢菌的抑菌率為63.33%，對人參鏈格孢菌、立枯絲核菌及腐皮鐮孢菌的抑菌率也可達(dá)50%以上；FSR-67對灰葡萄孢菌的抑菌率為61.48%；FSR-72對立枯絲核菌、惡疫霉菌、人參核盤菌和灰葡萄孢菌的抑菌率均可達(dá)50%以上；FSR-74對腐皮鐮孢菌抑菌作用最強(qiáng)(67.48%)，同時(shí)對其他6種人參病原菌的抑菌率也可達(dá)46%以上；FSR-91對立枯絲核菌的抑菌率為74.81%，對毀滅柱孢菌、腐皮鐮孢菌及人參核盤菌的抑菌率為57.41%～70.00%；FSR-94對立枯絲核菌、人參核盤菌和灰葡萄孢菌的抑菌率約為60%；FSR-97對惡疫霉菌的抑菌率為 73.33%，同時(shí)對其他6種人參病原菌的抑菌率也達(dá)47.62%～68.15%；FSR-106對立枯絲核菌的抑菌率為 87.41%；FSR-121對立枯絲核菌抑菌作用最強(qiáng)(71.43%)，對毀滅柱孢菌抑菌率最小(36.84%)。

15株生防真菌中，對人參鏈格孢菌的抑菌率達(dá)50%以上的菌株共6株，且FSR-121的抑菌率最大(60.00%)；15株生防真菌均對立枯絲核菌產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用，抑菌率達(dá)50%以上，且FSR-106的抑菌作用最強(qiáng)(87.41%)，均顯著高于其他菌株(P<0.05)；對毀滅柱孢菌抑菌率達(dá)50%以上的菌株共5株，且FSR-46、FSR-91和FSR-97對其抑制作用較強(qiáng)，但三者之間差異不顯著(P>0.05)；對腐皮鐮孢菌的抑菌率達(dá)50%以上的菌株共8株，其中FSR-74和FSR-91的抑菌作用較強(qiáng)，抑菌率分別為67.48%和70.00%；對惡疫霉菌抑菌率達(dá)50%以上的菌株共6株，其中FSR-97的抑菌率最大(73.33%)，均顯著高于其他菌株(P<0.05)；對人參核盤菌抑菌率達(dá)50%以上的菌株共12株，F(xiàn)SR-97的抑菌作用最強(qiáng)(66.67%)，且與FSR-46差異顯著(P<0.05)；對灰葡萄孢菌抑菌率達(dá)50%以上的菌株共13株，F(xiàn)SR-46的抑菌作用最強(qiáng)(68.97%)。

綜上可知，篩選出的15株真菌對人參7種常見病原菌均具有高效廣譜的防治作用，特別是對人參易發(fā)病如立枯病、灰霉病、根腐病和菌核病具有較高的抑菌活性。

2.4人參根際土壤生防真菌的鑒定

2.4.1形態(tài)特征FSR-10：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長快，背面無色，老時(shí)呈暗黃色(圖1)，有芳香氣味。其菌絲分枝對生，分生孢子梗略向頂彎曲。瓶梗較長，對生或輪生方式著生于孢子梗上；分生孢子暗綠色，近球形，直徑為3～3.4 μm，表面光滑(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-10初步鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

FSR-22：菌落在CZA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d時(shí)直徑為32 mm，質(zhì)地絮狀，平坦，顏色為灰褐色，菌落背面黃褐色(圖1)。其分生孢子梗產(chǎn)生于基質(zhì)，壁光滑；頂囊近球形，直徑6～13 μm；分生孢子球形或近球形，直徑為2.7～4.8 μm，表面粗糙，褐色(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》和齊祖同[23]描述，將FSR-22鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)真菌。

FSR-25：菌落在CZA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d時(shí)直徑為60 mm，質(zhì)地柔軟，藍(lán)綠色，邊緣白色，菌絲呈環(huán)紋狀生長(圖1)。其分生孢子梗細(xì)長，有橫隔，分生孢子梗1至2回分枝，大小(7～16) μm×(3～4) μm；分生孢子萌發(fā)初期產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)，分生孢子球形或橢球形，直徑為3～4 μm(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》第三十五卷[24]描述，將FSR-25鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)真菌。

FSR-38：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長較慢，培養(yǎng)初期為粉白色，后期伴有橙黃色滲出物，分泌褐色物質(zhì)，成熟后形成黑色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含孢子，菌絲質(zhì)地柔軟，菌絲呈輪紋狀生長，孢子沿菌絲生長(圖1)。其分生孢子梗暗色，短而粗，有橫隔；分生孢子球形或半球形，暗色，有橫隔，單生于分生孢子梗上，直徑為19～25 μm(圖2)。根據(jù)孢子梗及孢子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并結(jié)合菌落形態(tài)特征，將FSR-38鑒定為附球菌屬(Epicoccumsp.)真菌。

FSR-43：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長快，背面無色，老時(shí)呈暗黃色(圖1)，有芳香氣味。其菌絲分枝對生，分生孢子梗略向頂彎曲，瓶梗較長，對生或輪生方式著生于孢子梗上；分生孢子暗綠色，近球形，直徑為3～3.4 μm，表面光滑(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-43鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

FSR-46：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長快，初期為白色、致密、圓形，向四周擴(kuò)展，生長一段時(shí)間后從菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色，菌落有明顯的輪紋，周圍有白色菌絲的生長帶，最后整個(gè)菌落全部變成黃綠色(圖1)。其產(chǎn)孢菌絲主枝較長，瓶梗細(xì)葫蘆形，不規(guī)則單生或輪生方式著生于孢子梗上；分生孢子灰綠色，倒卵形或橢圓形，約為 4.5 μm，表面光滑(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-46鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

圖 115株人參生防真菌的培養(yǎng)特征

Fig.1Cultural characteristics of 15 biocontrol fungi strains ofPanaxginseng

FSR-55：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長較慢，初期菌絲為無色，向四周擴(kuò)展，生長一段時(shí)間后產(chǎn)生綠色孢子，菌絲白色(圖1)。其分生孢子梗主枝粗壯，具不規(guī)則分枝，短而粗壯，著生于主枝基部；分生孢子綠色，橢圓形，長度為2.6～4.0 μm，表面較光滑(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-55鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

圖 215株人參生防真菌分生孢子結(jié)構(gòu)的顯微特征(×500)

Fig.2Microscopic characteristics of conidia structure of 15 biocontrol fungi strains ofPanaxginseng(×500)

FSR-67：菌落在CZA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d時(shí)直徑為71 mm，藍(lán)綠色，質(zhì)地柔軟，菌落圓形，菌絲呈環(huán)紋狀生長(圖1)。其分生孢子梗細(xì)長，有橫隔，1至2回分枝，著生于氣生菌絲上，大小(7～16) μm×(3～4) μm；分生孢子萌發(fā)初期產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)，分生孢子球形或橢球形，直徑為3～4 μm(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》第三十五卷[24]描述，將FSR-67鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)真菌。

FSR-72：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長快，新鮮菌株背面呈黃綠色。菌落在產(chǎn)孢區(qū)產(chǎn)生平展的產(chǎn)孢簇，綠色(圖1)。其分生孢子梗不規(guī)則排列，多單生；分生孢子綠色，橢球形，直徑為2.0～3.3 μm(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-72鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

FSR-74：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長較慢，菌落深褐或棕褐色，背面棕褐色，常具橄褐色滲出物，菌落邊緣常呈不整齊的波裂狀(圖1)。其子囊果表生，以褐色假根固著于基質(zhì)表面，在反射光下為橄綠色至橄褐色，倒卵形至近球形，直徑160～240 μm，高220～300 μm，頂生毛大量而密集，曲折狀、波浪狀或稍呈螺旋狀卷曲，褐色，具隔，基部隔膜較明顯，不分枝，表面具密集疣點(diǎn)，基部寬2.5～4 μm；側(cè)生毛曲折狀，分隔明顯；子囊棍棒狀，長(27～36) μm×(11～15) μm，內(nèi)有 8 個(gè)子囊孢子，子囊壁容易消解；子囊孢子檸檬形，兩側(cè)扁，兩端各具一細(xì)尖，成熟時(shí)褐色，大小(8.5～11) μm×(7～8.5) μm，具單個(gè)頂生芽孔(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》和白金鎧[25]《中國真菌志》第十五卷描述，將FSR-74鑒定為毛殼菌屬(Chaetomiumkunzesp.)真菌。

FSR-91：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長較慢，背面淡黃色，培養(yǎng)初期菌絲白色，培養(yǎng)后期菌絲黑褐色(圖1)。其菌絲局部特化，產(chǎn)生特化的厚壁菌絲(圖2)。根據(jù)上述形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》描述，將FSR-91鑒定為輪層炭殼屬(Daldiniasp.)真菌。

FSR-94：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長快，背面從無色過渡到棕黃色，伴有淡的泥土芳香氣味(圖1)。其分生孢子梗瓶梗近球形且略向上彎曲；分生孢子近球形，灰綠色，直徑為2.6～3 μm，表面光滑(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-94鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

FSR-97：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長較快，菌落白色至黃白色，背面從無色過渡到黃色(圖1)。其分生孢子梗常聚集成簇狀，分枝密集，較粗，瓶梗短粗較擁擠；孢子簇形成緊密的簇狀，白色到黃綠色；分生孢子淡綠色，壁光滑，橢圓形或近球形，直徑為2.3～3.6 μm(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-97鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

FSR-106：菌落在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)時(shí)生長快，背面無色，老時(shí)呈暗黃色，有芳香氣味(圖1)。其菌絲分枝對生，分生孢子梗略向頂彎曲，瓶梗較長，對生或輪生方式著生于孢子梗上；分生孢子暗綠色，近球形，直徑為3～3.4 μm，表面光滑(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》及張廣志等[22]在木霉菌檢索表中的描述，將FSR-106鑒定為木霉屬(Trichodermasp.)真菌。

FSR-121：菌落在CZA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d時(shí)直徑為64 mm，菌落圓形，黃綠色，質(zhì)地柔軟，菌絲呈環(huán)紋狀生長(圖1)。其分生孢子梗細(xì)長，有橫隔，分生孢子梗1至2回分枝，長(7～16) μm×(3～4) μm；分生孢子萌發(fā)初期產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)，分生孢子球形或橢球形，直徑為3～4 μm(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征并結(jié)合《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》第三十五卷[24]描述，將FSR-121鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)真菌。

2.4.2分子鑒定利用真菌ITS區(qū)域的通用引物ITS 4和ITS 5，對15株人參生防真菌的核糖體ITS區(qū)進(jìn)行序列測定。經(jīng)過測序拼接，15株生防真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為577～663 bp，菌株序列提交到NCBI “GenBank”中注冊(注冊號：KJ572247～KJ572261)并對相似屬菌株ITS序列的同源性進(jìn)行比對,結(jié)果(表3)表明，15株生防真菌的序列與相似種序列同源性為99%～100%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果可知，F(xiàn)SR-10、FSR-43和FSR-106為深綠木霉(Trichodermaatroviride)；FSR-22為焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)；FSR-25、FSR-67和FSR-121為青霉屬真菌(Penicilliumsp.)。FSR-38為黑附球菌(Epicoccumnigrum)；FSR-46為長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)；FSR-55為鉤狀木霉(Trichodermahamatum)；FSR-72為桔綠木霉(Trichodermacitrinoviride)；FSR-74為球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)；FSR-91為蔡氏輪層炭殼菌(Daldiniachildiae)；FSR-94為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)；FSR-97為多孢木霉(Trichodermapolysporum)。

3討論

土傳病害能在極大程度上影響人參的產(chǎn)量和品質(zhì)，我國每年由于土傳病害所造成的人參產(chǎn)量損失可達(dá)20%～50%，嚴(yán)重削弱了我國人參產(chǎn)品在國際市場上的競爭力[26]。因此，深入研究人參土壤中有益微生物與病原微生物的拮抗作用，對維持土壤中病原微生物和有益微生物的平衡，以及安全有效防治人參土傳病害具有重要意義。本研究從人參健株根際土壤共分離獲得400株真菌，采用平板對峙法篩選得到了15株對人參7種主要病原菌具有高效廣譜抑菌活性的生防菌株?？傮w來說，F(xiàn)SR-46、FSR-74和FSR-97等菌株有良好的廣譜抑菌活性，對人參7種病原菌的抑菌率均能達(dá)46.67%以上；個(gè)別生防菌株對腐皮鐮孢菌、惡疫霉菌及立枯絲核菌的抑制率甚至可達(dá)到70%～90%。表明它們在人參土傳病害防治中具有較好的應(yīng)用潛力，這為生防菌劑的開發(fā)提供了依據(jù)。

表 3　15株人參生防真菌ITS序列的同源性比較Table 3　Homology of 15 biocontrol fungi strains of Panax ginseng based on ITS sequences

目前，利用拮抗微生物防治人參土傳病害已取得一定成果。任守讓等[27]從人參土壤中篩選得到2株綠色木霉(T.viride)，對人參銹腐病菌(毀滅柱孢菌)的生長具有強(qiáng)烈的抑制作用。邢云章等[28]指出綠色木霉可有效控制人參根腐病的發(fā)生。趙阿娜等[29]發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉Th3080(T.atroviride)對人參疫病菌、銹腐病菌和立枯病菌均有較高的抑菌率。這些研究多是針對1～3種人參病害，且獲得具有廣譜抑菌活性的新菌株較少。據(jù)報(bào)道，木霉屬(Trichodermasp.)真菌已被廣泛應(yīng)用于植物病害防治中。已有報(bào)道的除哈茨木霉和綠色木霉外，還有長枝木霉(T.longibrachiatum)[30]、康寧木霉(T.koningii)[31]和深綠木霉(T.atroviride)[32]，而其他木霉屬真菌對人參病害的作用尚未見報(bào)道。此外，青霉屬[13]、附球菌屬[33]及毛殼菌屬[34]真菌也被應(yīng)用于防治植物病害。本研究分離篩選獲得的黑附球菌FSR-38，深綠木霉FSR-10、FSR-43和FSR-106，長枝木霉FSR-46，鉤狀木霉FSR-55，桔綠木霉FSR-72，多孢木霉FSR-97，球毛殼菌FSR-74，蔡氏輪層炭殼菌FSR-91及3株青霉屬真菌FSR-25、FSR-67和FSR-121等13株生防真菌，在現(xiàn)今人參病害生防研究領(lǐng)域中均屬未見報(bào)道菌株。這些菌株具有較大的潛在開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，極大地豐富了人參土傳病害的生防菌株資源。與細(xì)菌及放線菌相比，真菌的培養(yǎng)方式多樣，營養(yǎng)要求簡單，培養(yǎng)基來源廣泛，價(jià)格低廉，產(chǎn)孢能力強(qiáng)，孢子存活時(shí)間長[35]，更有利于生防真菌的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

植物真菌的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，且有些真菌不易甚至不能形成有性繁殖結(jié)構(gòu)[36]，這給真菌的分類鑒定帶來了諸多不便，甚至可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。本研究表明，根據(jù)15株生防真菌的培養(yǎng)性狀及顯微特征(孢子梗和孢子的特點(diǎn))，僅能將其初步鑒定到屬。隨著分子生物學(xué)發(fā)展和真菌學(xué)自身發(fā)展的客觀需求，分子生物學(xué)技術(shù)在真菌學(xué)研究中得到了廣泛而深入的應(yīng)用[19,37]，通過核糖體DNA(rDNA)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)序列分析，對生防真菌進(jìn)行屬種鑒定，是對傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的補(bǔ)充[21]。本研究進(jìn)一步通過rDNA-ITS分子手段將FSR-10、FSR-38、FSR-43、FSR-46、FSR-55、FSR-72、FSR-74、FSR-91、FSR-94、FSR-97及FSR-106鑒定至種；FSR-22、FSR-25、FSR-67和FSR-121的形態(tài)學(xué)特征與參比菌株相近，鑒于曲霉屬及青霉屬真菌分類復(fù)雜，其具體歸屬有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

另外，木霉屬生防真菌與人參病原菌共培養(yǎng)時(shí)，能在人參病原菌上生長并抑制病原菌菌落擴(kuò)展；青霉屬、曲霉屬、附球菌屬及毛殼菌屬的生防真菌與人參病原菌對峙培養(yǎng)時(shí)，能形成明顯的拮抗帶，推測與不同種屬生防菌的主要作用機(jī)制不同有關(guān)。因此，有關(guān)生防真菌的防病機(jī)制，抑菌活性物質(zhì)的具體組成及生防菌株的田間防效仍有待于深入研究。

4結(jié)論

本研究篩選鑒定出15株對人參7種主要病原菌具一定拮抗效果的生防真菌：8株木霉菌，3株青霉屬真菌，1株曲霉菌，1株黑附球菌，1株球毛殼菌和1株炭殼菌。另外，以人參健株根際土壤為試驗(yàn)材料，可快速有效地篩選獲得大量廣譜性生防真菌，可避免生防菌株篩選的盲目性，提高篩選效率。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.026

[收稿日期]2014-12-25

[基金項(xiàng)目]國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI03B01-02);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270371)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(20125068)

[作者簡介]肖春萍(1985-)，女，山西陽泉人，博士，主要從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：btxnw@163.com [通信作者]楊利民(1963-)，男，吉林長春人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。 E-mail：ylmh777@126.com

[中圖分類號]S432.4+4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0181-12

Screening and identification of biocontrol fungi against main pathogens ofPanaxginseng

XIAO Chunping,YANG Limin,HAN Mei,CHENG Lin,MA Fengmin,GUO Shuangshuang

(CollegeofChineseMedicinalMaterial,Co-constructingKeyLaboratorybyProvinceandtheMinistryofScienceandTechnologyofEcologicalRestorationandEcosystemMmanagement,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study screened effective and broad-spectrum biocontrol fungi against main pathogens of Panax ginseng to enrich biocontrol microorganism resources.【Method】 Soil fungi were isolated from rhizosphere soil of healthy Panax ginseng by dilution plate method.Biocontrol strains,with highly antibacterial activity against 7 ginseng pathogens including Alternaria panax,Rhizoctonia solani,Fusarium solani,Cylindrocarpon destructans,Phytophthora cactorum,Sclerotinia schinseng and Botrytis cinerea were screened using pairing culture method.Biocontrol fungi were also identified based on morphology and rDNA-ITS sequence.【Result】 A total of 400 fungi were isolated from P.giseng soil,among which,15 had broad spectrum antimicrobial effect on 7 P.ginseng pathogens.Especially,Rhizoctonia solani were strongly inhibited by all of them with the inhibition rate of >50%,and FSR-106 was the strongest with the inhibition rate of 87.41%.FSR-121 was the strongest against Alternaria panax with the inhibition rate of 60.00%,and FSR-74 was the strongest against Fusarium solani with the inhibition rate of 67.48%.Inhibition rates of FSR-46 against Cylindrocarpon destructans (66.67%) and Botrytis cinerea (68.97%) were the highest.FSR-97 was the strongest against Phytophthora cactorum and Sclerotinia schinseng with inhibition rates of 73.33% and 66.67%,respectively.Morphological and rDNA-ITS sequence analysis showed that the 15 biocontrol fungi could be divided into 6 genus,i.e.8 belonged to Trichoderma,3 belonged to Penicillium,one belonged to Aspergillus,one belonged to Epicoccum,one belonged to Chaetomium and one belonged to Daldinia.FSR-38 was identified as Epicoccum nigrum,FSR-10,FSR-43 and FSR-106 were T.atroviride,FSR-46 was T.longibrachiatum,FSR-55 was T.hamatum,FSR-72 was T.citrinoviride,FSR-74 was Chaetomium globosum,FSR-97 was Trichoderma polysporum,FSR-91 was Daldinia childiae,while FSR-25,FSR-67and FSR-121 were Penicillium sp..【Conclusion】 The screening method based on rhizosphere soil of healthy gineng is a rapid and efficient way to seek for strong potential biocontrol strains.The 15 biocontrol fungi isolated in this study have good potential for the control of P.ginseng pathogens.

Key words:pathogens of Panax ginseng;Trichoderma;rDNA-ITS sequence analysis;biocontrol fungi

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