王振江　楊濤蓮　王緒霖

(天津中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)博士研究生，天津　300193)

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實(shí) 驗(yàn) 研 究

調(diào)脂保肝湯對(duì)非酒精性脂肪肝模型大鼠肝功能、血脂及血糖代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究

王振江楊濤蓮1王緒霖2

(天津中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)博士研究生，天津300193)

【摘要】目的觀察中藥調(diào)脂保肝湯對(duì)非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型大鼠肝功能、血脂及血糖代謝的影響，探討其治療NAFLD的作用機(jī)制。方法將44只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組12只和模型組32只，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予高脂飼料喂養(yǎng)。以隨機(jī)選取2只大鼠達(dá)到預(yù)期NAFLD病理組織學(xué)時(shí)間為準(zhǔn)，造模8周。造模成功后，模型組大鼠再隨機(jī)分為高劑量組、低劑量組及對(duì)照組，每組10只。高劑量組予相當(dāng)于生藥0.15 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃，低劑量組予相當(dāng)于生藥0.075 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃，對(duì)照組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。8周后計(jì)算4組大鼠的肝指數(shù)，觀察4組大鼠肝功能指標(biāo)[谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)]、血脂指標(biāo)[甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)]及空腹血糖(FPG)水平。結(jié)果對(duì)照組大鼠肝指數(shù)明顯高于空白組(P<0.05)，高、低劑量組大鼠較對(duì)照組均可降低肝指數(shù)(P<0.05)，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組大鼠ALT、AST及γ-GT水平均高于空白組(P<0.05)，高、低劑量組大鼠較對(duì)照組均可降低ALT及AST水平(P<0.05)，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組大鼠較對(duì)照組可降低γ-GT水平(P<0.05)，而低劑量組γ-GT水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組大鼠TC、TG及FPG水平均高于空白組(P<0.05)，高、低劑量組較對(duì)照組均可降低TC、TG及FPG水平(P<0.05)，高劑量組較低劑量組降低效果更明顯(P<0.05)。結(jié)論調(diào)脂保肝湯對(duì)NAFLD療效確切，其作用機(jī)制可能與減少肝細(xì)胞脂肪沉積、改善肝功能及糾正血糖、血脂代謝紊亂有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】脂肪肝；中藥療法；調(diào)脂保肝湯；血清學(xué)；病理學(xué)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激性肝臟損傷綜合征，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性與脂肪貯積為病理學(xué)特征，且無過量飲酒史(折合酒精量每周男性<140 g，女性<70 g)[1]。NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏對(duì)本病特異有效的治療藥物，但中藥具有多靶點(diǎn)、多層次、多途徑、整體性調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，逐漸受到臨床的重視[2]。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究調(diào)脂保肝湯對(duì)NAFLD模型大鼠肝功能、血脂及血糖代謝的影響，探討其治療NAFLD的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠44只，雄性，體質(zhì)量(188±10) g，無特定病原體(SPF)級(jí)，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：0014091)，飼養(yǎng)于室溫18～24 ℃、明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物調(diào)脂保肝湯藥物組成：金錢草30 g，生牡蠣20 g，夏枯草15 g，虎杖15 g，海藻15 g，決明子20 g，何首烏20 g，丹參20 g。由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中藥藥劑科提供。中藥加水約為藥物質(zhì)量的8倍左右，在水中浸泡1 h，每次煎煮 30 min，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中揮發(fā)性的藥物成分，煎煮完畢后，將3次藥液混合，過濾去除藥渣，藥液濃縮(分別濃縮為相當(dāng)于生藥0.15、0.075 g/mL藥液)、滅菌，密封4 ℃冰箱保存，藥液有效期為1周，灌藥時(shí)間為8周，每周制取1次。

1.3主要試劑及儀器膽固醇，納瑞增(天津)生物科技有限公司；日立7600型全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；湘儀TDZ5-WS型低速離心機(jī)，湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AL104UCT型電子分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；超薄冰凍切片機(jī)，德國(guó)Leica公司； B60-32FB3-F01型顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組與造模大鼠適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)7 d后，利用EXCEL軟件隨機(jī)數(shù)法將大鼠隨機(jī)分為空白組12只和模型組32只?？瞻捉M予自由飲水和進(jìn)食普通飼料；模型組予自由飲水和進(jìn)食高脂飼料(84%基礎(chǔ)飼料，4%蛋黃粉，10%豬油，2%膽固醇)，每周稱體質(zhì)量1次，以最后隨機(jī)選取2只大鼠達(dá)到預(yù)期NAFLD病理組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[3]時(shí)間為準(zhǔn)，預(yù)計(jì)造模8周。

1.4.2給藥造模8周后，在模型組籠中隨機(jī)選擇2只大鼠，肝組織做病理組織學(xué)觀察，達(dá)到中、重度NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，造模成功。模型組利用EXCEL軟件隨機(jī)數(shù)法分為高劑量組10只，低劑量組10只，對(duì)照組10只。高劑量組予相當(dāng)于生藥0.15 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃(劑量相當(dāng)于成人用量的20倍)，低劑量組予相當(dāng)于生藥0.075 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃(劑量相當(dāng)于成人用量的10倍)，對(duì)照組予0.9%氯化鈉注射液灌胃，均按1 mL/100 g灌胃，每日早晨灌胃1次，持續(xù)8周。

1.4.3標(biāo)本采集灌胃8周后，隔夜禁食，先稱體質(zhì)量，以10%水合氯醛0.33 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，解剖大鼠，采用釆血真空管取腹主動(dòng)脈血樣6～10 mL，于4 ℃下靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，分別裝在標(biāo)記號(hào)碼的EP管。用無菌鑷子和剪刀將大鼠整個(gè)肝臟完整分離，電子天平稱取肝濕質(zhì)量，取新鮮肝臟最大葉小塊肝組織，立刻浸泡于10%中性甲醛固定液中固定，制作成石蠟切片，整個(gè)過程在冰盤上操作。

1.5指標(biāo)檢測(cè)觀察4組大鼠腹腔內(nèi)大體標(biāo)本情況，計(jì)算大鼠的肝指數(shù)[(肝濕質(zhì)量/大鼠質(zhì)量)×100%)]，采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)4組大鼠血清進(jìn)行肝功能指標(biāo)[谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)]、血脂指標(biāo)[甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)]及空腹血糖(FPG)水平檢測(cè)。固定好的肝組織交由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1脫落情況灌胃第1周由于操作手法不熟練，高劑量組和低劑量組各有1只大鼠因藥液?jiǎn)芊嗡劳觯溆囗樌瓿蓪?shí)驗(yàn)。

2.2大體標(biāo)本觀察剖開大鼠腹腔，肉眼可見，空白組大鼠腹腔脂肪組織少見，肝臟大小正常，呈暗紅色，肝臟包膜無緊張感，切面無油膩感；對(duì)照組大鼠腹腔肥大，脂肪組織豐富，肝臟體積明顯增大，色澤呈黃色或泛白色，肝臟包膜緊張，切面油膩，呈典型脂肪肝外觀；高劑量組及低劑量組較對(duì)照組腹腔脂肪組織有不同程度減少，肝臟體積減小，色澤呈暗紅色或偏黃色，一部分大鼠肝臟切面有油膩感，高劑量組肝臟外觀與空白組比較接近。

2.34組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察空白組(見封3，圖1、2)：肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞及肝血竇沿中央靜脈呈放射狀整齊排列；肝細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞大小一致，核圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)較稀疏，核膜清楚，偶見肝細(xì)胞增生；匯管區(qū)無擴(kuò)大，未見纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組(見封3，圖3、4)：肝組織結(jié)構(gòu)不清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)尚存；肝細(xì)胞彌漫水樣變性，部分氣球樣變；肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見肝細(xì)胞多灶狀壞死，重度彌漫性脂肪變性(占肝細(xì)胞50%～75%)，并見肝細(xì)胞再生及增生；部分肝界板破壞，可見碎屑樣壞死；匯管區(qū)擴(kuò)大，纖維組織增生，長(zhǎng)入肝小葉內(nèi)，并見纖維間隔形成，伴中等慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組(見封3，圖5、6)：肝組織結(jié)構(gòu)尚清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)存在；肝細(xì)胞輕、中度水樣變性；肝實(shí)質(zhì)內(nèi)偶見肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死，肝細(xì)胞散在輕、中度脂肪變性(占肝細(xì)胞5%～30%)，并見肝細(xì)胞再生；局灶性肝界板可見輕度碎屑樣壞死；部分匯管區(qū)輕度擴(kuò)大，纖維組織輕度增生，偶見少量慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量組(見封3，圖7、8)：肝組織結(jié)構(gòu)欠清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)尚存；肝細(xì)胞中度水樣變性，小灶性氣球樣變性；肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死，肝細(xì)胞中度脂肪變性(占肝細(xì)胞30%～50%)，并見肝細(xì)胞再生及增生；局灶性肝界板可見碎屑樣壞死；匯管區(qū)擴(kuò)大，纖維組織增生，長(zhǎng)入肝小葉內(nèi)，部分伴少量慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.44組大鼠肝指數(shù)比較見表1。

表1　4組大鼠肝指數(shù)比較　±s

與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.05

由表1可見，對(duì)照組肝指數(shù)與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組高于空白組；高、低劑量組肝指數(shù)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均低于對(duì)照組，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.54組大鼠ALT、AST及γ-GT水平比較見表2。

組 別nALTASTγ-GT高劑量組949.41±11.17△150.29±23.44△0.72±0.42△低劑量組960.41±10.89△170.39±28.02△0.90±0.47對(duì)照組1088.23±20.90*225.49±38.36*1.20±0.40*空白組1247.93±15.76149.08±31.140.75±0.45

與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.05

由表2可見，對(duì)照組ALT、AST及γ-GT水平與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組均高于空白組；高、低劑量組ALT及AST水平與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均低于對(duì)照組，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組γ-GT水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而低劑量組γ-GT水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.64組大鼠TC、TG及FPG水平比較見表3。

由表3可見，對(duì)照組TC、TG及FPG與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組高于空白組；高、低劑量組TC、TG及FPG與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均低于對(duì)照組，且高、低劑量組組間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組均低于低劑量組。

組 別nTCTGFPG高劑量組91.51±0.14△#0.40±0.13△#13.02±1.83△#低劑量組91.69±0.12△0.57±0.13△14.75±0.97△對(duì)照組101.87±0.22*0.74±0.17*16.80±1.86*空白組121.50±0.150.40±0.1712.20±2.07

與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05

3討論

近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，NAFLD發(fā)病率呈逐漸增加且有低齡化趨勢(shì)，我國(guó)上海、廣州等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率在15%左右，NAFLD已成為21世紀(jì)全球公共健康問題之一[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病具體機(jī)制尚不十分明確，基本都處于假說階段，1998年Day發(fā)表的“二次打擊”學(xué)說目前占主要地位[5]。NAFLD患者通常無明顯臨床癥狀，部分可有乏力、消化不良、肝區(qū)隱痛、肝脾大等非特異性癥狀及體征，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)則可見肝功能異常、血脂及血糖水平升高等[6]。NAFLD的現(xiàn)代臨床上常應(yīng)用胰島素增敏劑、抗氧化劑、肝解毒劑、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保肝降酶等治療藥物[2]，但治療方法缺乏特異性，療效不盡令人滿意，不良反應(yīng)較多，停藥易復(fù)發(fā)。

根據(jù)NAFLD臨床表現(xiàn)，其應(yīng)歸屬于中醫(yī)學(xué)肝癖、脅痛、積聚等范疇，主要病因多為飲食不節(jié)、勞逸失度、情志失調(diào)、久病體虛、稟賦不足等[7]。調(diào)脂保肝湯是以國(guó)醫(yī)大師阮士怡教授臨證思想為指導(dǎo)的組方，阮教授經(jīng)過多年臨床實(shí)踐總結(jié)，認(rèn)為本病當(dāng)屬虛實(shí)夾雜之證，虛為脾虛、腎虛，實(shí)為痰、瘀互結(jié)，并提出滌痰散結(jié)、化瘀補(bǔ)腎的治療大法，臨床取得較好療效[8]。調(diào)脂保肝湯方中以金錢草、生牡蠣為君，利濕散瘀，軟堅(jiān)散結(jié)；夏枯草、海藻、丹參為臣，助君藥加強(qiáng)活血化痰、軟堅(jiān)散結(jié)功效，又能清瀉肝熱；決明子、虎杖、何首烏為佐使藥，既助祛濕化痰，又可利水通便，使?jié)嵝坝谐雎罚瑫r(shí)何首烏養(yǎng)陰血、補(bǔ)肝腎，使清利而不傷陰，活血而不耗血。諸藥配伍，共奏祛痰化瘀、清熱利濕、軟堅(jiān)散結(jié)之功效。全方用藥痰瘀同治，使邪毒從二便而解，則氣機(jī)暢，痰濕化，瘀血祛，腑氣通，從而恢復(fù)臟腑的正常功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參能降低血清和肝組織中TC、TG、游離脂肪酸(FFA)及丙二醛(MDA)含量，降低血清ALT、AST活性，增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，增加脂質(zhì)代謝，抗脂質(zhì)過氧化，抵抗肝細(xì)胞脂肪變性[9]；夏枯草對(duì)自由基有一定的清除能力，可以防止肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成量[10]；決明子能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高血清以及肝臟組織內(nèi)SOD抗氧化活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞[11]；虎杖可以改善胰島素抵抗(IR)，增加對(duì)胰島素敏感性，減少脂肪動(dòng)員，減輕肝細(xì)胞氧超載，從而降低血脂，改善肝功能[12]；何首烏醇提取物可提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)/TC比值，明顯降低TC、TG及FFA、游離膽固醇及膽固醇酯的含量，有保護(hù)肝臟和抗肝臟纖維化的作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，調(diào)脂保肝湯可以有效減少NAFLD模型大鼠腹腔內(nèi)脂肪堆積，降低肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)，減少脂肪在肝臟的沉積，改善肝組織病理學(xué)改變，減輕肝細(xì)胞的脂肪性變。同時(shí)，調(diào)脂保肝湯可顯著改善肝功能，降低NAFLD大鼠血清ALT、AST及γ-GT水平，但療效沒有表現(xiàn)出明顯劑量相關(guān)性；糾正血脂、血糖代謝紊亂，降低血TC、TG及FPG水平，且具有一定劑量相關(guān)性趨勢(shì)，劑量越高效果越明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥調(diào)脂保肝湯對(duì)NAFLD具有療效確切，其作用機(jī)制可能與減少肝細(xì)胞脂肪沉積、改善肝功能及糾正血糖、血脂代謝紊亂有關(guān)。

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(本文編輯：石康)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.02.022

作者簡(jiǎn)介：王振江(1986—)，男，醫(yī)師，博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病防治研究。

【中圖分類號(hào)】R285.5；R289.61

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-2619(2016)02-0231-05

(收稿日期：2014-04-25)

Experimental study of Tiaozhi-baogan decoction on liver function and metabolism of glucose and lipid in rats with non-alcoholic fatty liver disease

WANGZhenjiang*,YANGTaolian,WANGXulin.

*2012-GradeDoctorCandidateofTianjinTraditionalChineseMedicineUniversity,Tianjin300193

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of Tiaozhi-baogan decoction on liver function and metabolism of glucose and lipid in rats with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its mechanism of action. Methods 44 Wistar rats were randomly divided into blank group (n=12) and model group (n=32). Rats in blank group were fed with general diet, and rats in model group were fed with high-fat diet for 8 weeks. After successful modeling, rats in model group were randomly divided into high dose , low dose and control group, 10 rats in each group. High dose group were received concentrate liquid of Chinese herbal medicine(crude drug 0.15 g/mL) by gavage, low dose group were received concentrate liquid of Chinese herbal medicine(crude drug 0.075 g/mL) by gavage and control group were received 0.9% sodium chloride injection by gavage. The liver index was calculated in four groups after 8 weeks. The liver functions including alanine transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and gamma glutamyl transferase (γ-GT), the blood lipid parameters including triglyceride (TG) and total cholesterol (TC), and fasting blood-glucose (FPG) were observed in four groups. Results The liver index in control group was obviously higher than that in blank group (P<0.05). The liver indexes in high and low dose group were decreased as compared with those in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between high and low dose group (P>0.05). The levels of ALT, AST and γ-GT in control group were higher than those in blank group (P<0.05), and those in high and low dose group was lower than those in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between high and low dose group (P>0.05). The level of γ-GT in high dose group was lower than that in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between low dose group and control group (P>0.05). The levels of TC, TG and FPG were higher than those in blank group (P<0.05), and those in high and low dose group were decreased as compared with those in control group (P<0.05), the decrease in high dose group was more obvious than that in low dose group (P<0.05). Conclusion Tiaozhi-baogan decoction has exact effect on NAFLD, its mechanism may be related with the decrease of fat deposition in liver cell, the improvement of liver function, and rectify the derangement in blood glucose and lipid.

【Key words】Fatty liver; Traditional Chinese medicine therapy; Tiaozhi-baogan decoction; Serology; Pathology

1天津中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)博士研究生，天津300193

2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科，天津300052