周勝強，羅東，黃素芬，易健，劉柏炎*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007）

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Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型的鑒定及繁育方法

周勝強1，羅東1，黃素芬1，易健2，劉柏炎1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007）

【摘要】目的 探討小凹蛋白-1（caveolin-1）基因敲除小鼠的鑒定方法與最優(yōu)繁育方式，為深入研究caveolin-1在腦缺血損傷修復中的作用提供理想的動物模型。方法 將引進的caveolin-1基因敲除小鼠飼養(yǎng)于SPF級實驗室，煮沸裂解法提取鼠尾組織基因組DNA，根據(jù)美國杰克遜實驗室（Jackson Laboratory）提供的引物序列進行PCR反應(yīng)檢測其基因型，采用caveolin-1+/-雜合子互交、雜合子與caveolin-1-/-純合子雜交（正交及反交）、純合子互交4種不同的交配方式，觀察親代小鼠的受孕率、子代小鼠的外形特征及純合率。結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物分子量大小約200 bp和661 bp，與預(yù)期的目的基因片段分子量大小一致，成功鑒定了caveolin-1基因敲除小鼠的不同基因型；不同交配方式的繁殖結(jié)果基本符合孟德爾遺傳規(guī)律，且雌性、雄性caveolin-1-/-純合鼠具有一定的繁殖能力，三種不同基因型小鼠的外形特征無明顯差異。結(jié)論 煮沸裂解法提取基因組DNA、PCR法能夠快速可靠鑒定caveolin-1基因敲除小鼠的基因型；caveolin-1雜合子小鼠互交與純合子互交相結(jié)合的繁育方法可能是短期內(nèi)獲得足量純合子子鼠與同源野生子鼠的較好方式。

【關(guān)鍵詞】小凹蛋白-1；基因敲除；小鼠；鑒定；繁育方法

基因敲除小鼠是建立在胚胎干細胞技術(shù)與基因同源重組或TALEN、CRISPR/cas9等技術(shù)上的一種定向改變生物活體遺傳信息的轉(zhuǎn)基因動物，是研究疾病的發(fā)病機制、分子基礎(chǔ)及尋找合適藥物靶標的重要工具［1-2］。目前，通過對基因敲除小鼠的研究，許多與人類疾病相關(guān)新基因的功能得到了闡明，且與以往腺病毒或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因過表達系統(tǒng)和SiRNA干擾等基因沉默研究手段相比具有顯著的優(yōu)越性［3］。

小凹蛋白-1（caveolin-1）是細胞質(zhì)膜微囊（caveolae）的標志性蛋白［4］。近年caveolin-1的研究主要集中在膽固醇轉(zhuǎn)運、腫瘤發(fā)生與浸襲轉(zhuǎn)移方面［5-6］，在神經(jīng)生物學研究中尚處于起始階段。研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1在哺乳動物腦內(nèi)多個部位均有表達，參與了腦的正常發(fā)育成熟及海馬可塑性的調(diào)控［7-8］，能影響成年小鼠腦內(nèi)室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）及海馬齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的增殖與分化［9-10］。國外研究報道caveolin-1基因敲除加重了腦缺血損傷［11］，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷能上調(diào)大鼠腦內(nèi)caveolin-1蛋白的表達［12］，但其機制尚不完全清楚。

由于轉(zhuǎn)基因小鼠具有能夠從動物整體水平上模擬相關(guān)基因在體內(nèi)的功能等諸多優(yōu)勢，為了更好地研究caveolin-1蛋白在腦缺血損傷修復中的作用及機制，我們2011年從美國杰克遜實驗室（Jackson Laboratory）成功引進了SPF級caveolin-1基因敲除雜合子小鼠，在湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心動物房內(nèi)飼養(yǎng)，并成功進行了鑒定與不同繁育方法比較?，F(xiàn)將該小鼠的基因型鑒定、繁育過程報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Caveolin-1基因敲除小鼠親代購自美國Jackson Laboratory（Maine，USA），批號：2909619，SPF級，庫存號：007083，品系名：B6.Cg-Cav1tm1Mls/J，遺傳背景：C57BL/6，基因型：雜合子 caveolin-1+/-。小鼠的月齡2～3月，體重（25±5）g。

1.1.2 主要儀器及試劑

PCR擴增儀（美國 Bio-Rad公司，型號：T100 thermal cycler），化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：XRS+Imager），臺式高速冷凍離心機（德國Hermle公司，型號：Z32HK），核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號：BG-SUHWIDI），超純水機（上海摩勒科學儀器有限公司，型號：摩爾超純水機動物型5009-11-582）；基因組DNA提取溶液（A液：25 mM NaOH+2 mM EDTA；B液：40 mM Tris-HCl），DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）（美國Thermo Scientific公司，批號：00220411），100 bp DNA ladder（北京Solarbio科技有限公司，批號：20141103），Biowest Regular Agarose G-10（廣州翔博生物科技有限公司，批號：111910）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)

Caveolin-1基因敲除小鼠飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心獨立通氣籠盒（individually ventilated cages，IVC）系統(tǒng)中，環(huán)境溫度控制在（24 ±0.5）℃，相對濕度50%～60%，自由飲食進水，晝夜光照節(jié)律。采用斯萊康大小鼠繁殖飼料及滅菌墊料，二者均為SPF級，墊料每周更換2次，飲水為超純水，每日補充飼料及飲水。飼養(yǎng)籠具及飲水瓶每次更換清洗后均使用84消毒液浸泡，自來水沖洗后高壓滅菌處理。

1.2.2 繁育方法

先將caveolin-1基因敲除雜合子雄性與雌性小鼠按1∶1搭配，繁殖多代子鼠后，再將不同基因型性成熟（8周齡左右）雌雄小鼠按以下四種方式1∶1合籠配種：caveolin-1+/-♂與caveolin-1+/-♀，caveolin-1+/-♂與 caveolin-1-/-♀，caveolin-1-/-♂與caveolin-1+/-♀，caveolin-1-/-♂與caveolin-1-/-♀，每組配對8對，均交配兩個月。

1.3 基因型鑒定

（1）鼠尾基因組DNA的提?。翰捎弥蠓辛呀夥ǎ?3］提取鼠尾組織基因組DNA：剪取小鼠尾尖0.3～0.5 cm，置于0.2 mL PCR管中，置冰上剪碎，加入A液100 μL浸沒組織，PCR儀95℃加熱2 h，冷卻后加入B液100 μL，吹打混勻，12 000 r/ min，4℃離心5 min，取上清基因組DNA，4℃冰箱備用。

（2）PCR擴增：引物序列由Jackson Laboratory提供，Wildtypeforward：5′-GCACACCAAGGAGATTGACC-3′，Common：5′-CTTGGCTGTCACCACACAC-3′，Mutant reverse：5′-CTCCAGACTGCCTTGGGAAAA-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成，為干粉狀，稀釋100倍后等體積混合后備用。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×DreamTaq Green PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 2 μL，引物混合物1 μL，ddH2O 7 μL。采用PCR儀進行擴增，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃3 min，變性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃45 s，循環(huán)40次，72℃5 min終止反應(yīng)。

（3）瓊脂糖凝膠電泳：取PCR擴增產(chǎn)物6 μL，在2%瓊脂糖凝膠中以150 V由負極向正極電泳30 min，于化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中拍照觀察。

（4）基因型結(jié)果判定：Common和mutant reverse引物擴增產(chǎn)物長度為200 bp左右，為KO小鼠；wild type forward和 common引物擴增產(chǎn)物長度為661 bp，為WT小鼠；兩條電泳條帶均存在的為HET小鼠。1.4 不同繁殖方式繁育結(jié)果觀察

交配后密切觀察小鼠的受孕情況，計算其受孕率；從娩出后第1～28天每周定期觀察其外形特征，離乳后剪尾檢測其基因型，計算純合率。

2 結(jié)果

2.1 部分小鼠基因型鑒定結(jié)果

部分小鼠鼠尾基因組DNA擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果（圖1）：N為陰性對照未見電泳條帶，僅200 bp左右位置可見條帶為caveolin-1基因敲除純合子，僅661 bp位置可見條帶為野生型，200 bp左右和661 bp位置兩條條帶均可見為caveolin-1基因敲除雜合子。

注：M：Marker（100 bp DNA ladder）；N：陰性對照；KO：純合子；HET：雜合子；WT：野生型。圖1 部分小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Note：M：Marker（100 bp DNA ladder）N：Negative control KO：Homozygote.HET：Heterozygote.WT：Wild type.Fig.1 Results of genotype identification of some mice by PCR

2.2 不同繁殖方法繁育結(jié)果

Caveolin-1基因敲除雜合子互交、雜合子與純合子正交、反交以及純合子互交，四種不同配種繁殖方式所產(chǎn)子代小鼠的基因型分布基本符合孟德爾遺傳定律（表1），其純合率分別為23.52%、47.36%、52.54%、100.00%。雜合子互交雌鼠受孕率為100.00%，雜合子與純合子正交、反交雌鼠受孕率均為87.50%，純合子互交雌鼠受孕率為75.00%，雜合子互交種群與其余三種繁殖方式的雌鼠受孕率比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 Caveolin-1基因敲除小鼠不同繁殖方法繁育結(jié)果（n=8）Tab.1 Breeding results of different propagation method in the caveolin-1 gene knockout mice

2.3 三種不同基因型小鼠外形特征

Caveolin-1基因敲除雜合子小鼠互交所生子代新生幼鼠呈肉紅色，赤裸無毛，兩眼緊閉，兩耳粘貼在皮膚上，尾短，四肢不發(fā)達，活動能力有限（圖2A）。7日齡、14日齡、21日齡及28日齡不同基因型小鼠（經(jīng)基因型鑒定存在caveolin-1+/-雜合子、caveolin-1-/-純合子、caveolin-1+/+野生型三種不同基因型）在外觀形態(tài)上未見明顯差異（圖2B、C、D、E）。

注：A：1日齡子鼠；B：7日齡子鼠；C：14日齡子鼠；D：21日齡子鼠；E：28日齡子鼠。圖2 三種不同基因型不同日齡子鼠外形特征Note：A：1-day-old mouse.B：7-day-old mouse.C：14-day-old mouse.D：21-day-old mouse.E：28-day-old mouse.Fig.2 Appearance of three different genotypes of mice at different ages

3 討論

Caveolae是 20世紀 50年代由日本科學家Yamada發(fā)現(xiàn)并命名的細胞膜上燒瓶狀凹陷，大小約50～100 nm，在血管內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞等細胞上表達豐富，在細胞的囊泡轉(zhuǎn)運、膽固醇體內(nèi)平衡以及細胞信號轉(zhuǎn)導等生物學過程調(diào)控發(fā)揮著重要作用［4，14-15］。Caveolin-1是caveolae的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)與功能蛋白，肽鏈中間由疏水性的氨基酸形成一個發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)將其錨定在細胞膜上，而親水性的C端和N端均朝向胞質(zhì)，在其N端包含了由20個氨基酸殘基組成的腳手架區(qū)域（caveolin-1 scaffolding domain，CSD），caveolin-1通過其CSD能夠寡聚細胞內(nèi)各種信號分子的催化亞基（如Src家族激酶、絲/蘇氨酸激酶、G蛋白、蛋白激酶A、蛋白激酶C、生長因子受體以及一氧化氮合成酶等），對其活性狀態(tài)起直接調(diào)節(jié)作用，從而參與了細胞增殖分化、炎癥反應(yīng)等多種病理、生理過程［16］。

基因型鑒定是進行基因敲除小鼠繁育保種的重要環(huán)節(jié)之一，其方法主要包括傳統(tǒng)的Southern bolt法和PCR法［17］。本研究采用煮沸裂解法提取鼠尾組織基因組DNA，參照Jackson Laboratory提供的引物序列，通過普通PCR擴增凝膠電泳成功鑒定出caveolin-1敲除鼠的基因型，與用DNA提取試劑盒提取基因組DNA、Southern bolt法鑒定比較，整個過程耗時較短、費用較低，說明該方法可以作為檢測caveolin-1敲除小鼠基因型的一種快速可靠方法。

基因敲除小鼠由于被敲除的基因功能各不相同，使得敲除小鼠的某些功能喪失，可能造成生長發(fā)育或生殖功能障礙，故在飼養(yǎng)繁殖及保種方面與普通實驗小鼠相比有不同的要求［18］。研究結(jié)果表明三種不同基因型小鼠在外觀形態(tài)上未見明顯差異，與國外學者Trushina等［6］報道的結(jié)果一致；Caveolin-1基因敲除雜合子小鼠的繁殖能力未受影響，根據(jù)孟德爾遺傳定律，采用雜合子互交，子代小鼠可能出現(xiàn)純合子（caveolin-1-/-）、雜合子（caveolin-1+/-）和野生型（caveolin-1+/+）三種基因型，其比例接近1∶2∶1，獲得的caveolin-1-/-純合子小鼠可用于實驗研究，caveolin-1+/+野生型小鼠可用作陰性對照，caveolin-1+/-雜合子小鼠可用來保種，因此，該繁育方法能同時兼顧了實驗與保種需求，但純合子獲得率僅50%左右，若短期內(nèi)需要使用大量純合子用于實驗則無法提供；純合子的繁殖能力雖有所下降，但尚未完全喪失，具有一定的繁殖能力，而純合子互交所產(chǎn)子代純合率為100%，無雜合子與野生型子鼠，故短期內(nèi)若需提高純合子數(shù)量以及使用同源野生鼠用作實驗，采用雜合子互交與純合子互交相結(jié)合的繁育方法可能是一種較好的選擇。通過一段時間的飼養(yǎng)鑒定、繁殖，目前已獲得了一定數(shù)量的caveolin-1基因敲除小鼠，這為深入研究caveolin-1在腦缺血損傷修復中的作用及藥物靶標的篩選提供了前期基礎(chǔ)。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0228-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.002

［基金項目］國家自然科學基金（NO.81273989）；湖南省教育廳創(chuàng)新平臺項目（NO.12K089）。

［作者簡介］周勝強（1988-），男，博士研究生，從事中醫(yī)藥防治腦血管疾病及神經(jīng)干細胞研究。Email：549160941@qq.com

［通訊作者］劉柏炎（1970-），男，教授，博士生導師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治腦血管疾病及神經(jīng)干細胞研究。Email：liubaiyan@126.comning the breeding methods of intercrossing of caveolin-1 heterozygous mice and intercrossing of caveolin-1 homozygous mice may be a good way to obtain enough homozygous mice and homologous wild type mice in a short period.

Corresponding author：LIU Bai-yan.E-mail：liubaiyan@126.com

［收稿日期］2015-12-11

Genotype identification and breeding method of caveolin-1 gene knockout mice

ZHOU Sheng-qiang1，LUO Dong1，HUANG Su-feng1，YI Jian2，LIU Bai-yan1*
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007）

【Abstract】Objective To investigate the identification and optimal breeding method of caveolin-1 knockout mice，and provide an ideal animal model for further study of the role of caveolin-1 in cerebral ischemic injury and repair.Methods The introduced caveolin-1 gene knockout mice were reared in the SPF laboratory and genomic DNA was extracted from mouse tail tissue by the method of boiling lysis.According to the primer sequences provided by the Jackson Laboratory of America for polymerase chain reaction（PCR）to detect the genotypes，with the four different ways of mating：caveolin-1+/-heterozygote intercrossing，heterozygous and homozygous caveolin-1-/-hybrid（orthogonal and pay）as well as homozygous intercrossing.The pregnancy rate，shape characteristics of the filial generation mice and homozygous rate of the parental mice were observed.Results Agarose gel electrophoresis results indicated that the size of molecular weight of the PCR products was about 200 bp and 661 bp，which were consistent with the expected target gene fragment，and identified caveolin-1 gene knockout mice of different genotypes successfully.The results of different mating patterns are basically in agreement with Mendel rule，and the female and male aveolin-1-/-homozygous mice had a certain ability to reproduce，three different genotypes of mice had no significant differences between the shape features.Conclusions PCR can fast and reliably identify the genotypes of caveolin-1 knockout mice using genomic DNA through the method of boiling lysis.Combi-

【Key words】Caveolin-1；Gene knockout；Mice；Identification；Breeding methods