張翠萍，汪鵬，李慶，徐修才，胡超杰，鄭南

( 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 中心實(shí)驗(yàn)室，b 腎臟內(nèi)科，合肥230001)

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·論著·

多發(fā)性骨髓瘤免疫表型特征及其臨床意義

張翠萍a，汪鵬b，李慶a，徐修才a，胡超杰a，鄭南a

( 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 中心實(shí)驗(yàn)室，b 腎臟內(nèi)科，合肥230001)

[摘要]目的探討流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤(MM)的免疫表型特征及其臨床意義。方法應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MP-FCM)，采用CD138/CD45/SSC設(shè)門，檢測(cè)40例MM患者和20例正常獻(xiàn)髓者骨髓細(xì)胞免疫表型。結(jié)果MM患者抗原異常表達(dá)率由高到低分別為CD45dim+/-(95%)、CD81dim+/-(80%)、CD56+(70%)、CD27dim+/-(50%)、CD200++(48%)、CD33+(40%)、CD28++(35%)、CD117+(18%)、CD19+(5%)和CD20+(3%)。CD56+、CD200dim+、CD28dim+在正常漿細(xì)胞的表達(dá)率分別為10%、10%和5%。結(jié)論應(yīng)用MP-FCM檢測(cè)MM細(xì)胞免疫表型,可準(zhǔn)確地鑒別良惡性漿細(xì)胞，有助于MM的診斷、預(yù)后判斷及靶向治療。

[關(guān)鍵詞]多發(fā)性骨髓瘤；免疫表型分型; 漿細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是骨髓內(nèi)單一漿細(xì)胞株異常增生，并伴單克隆免疫球蛋白增多和溶骨性病變?yōu)樘卣鞯囊环N惡性腫瘤。多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多樣。由于骨髓病變呈灶性分布，漿細(xì)胞達(dá)不到診斷標(biāo)準(zhǔn)，或?yàn)椴环置谛?，且部分骨髓瘤?xì)胞和反應(yīng)性增多的漿細(xì)胞與正常漿細(xì)胞在形態(tài)上難以區(qū)別，因此診斷較為困難。近年來(lái)，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MP-FCM)在MM診斷、治療和療效觀察等方面的價(jià)值日益突出。國(guó)內(nèi)一般通過四色免疫熒光MP-FCM測(cè)定MM患者骨髓細(xì)胞的免疫表型，本實(shí)驗(yàn)室采用八色流式細(xì)胞術(shù)分析其免疫表型特點(diǎn)，為臨床明確診斷和預(yù)后判斷提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1病例資料收集安徽省立醫(yī)院2013-2015年住院的40例初診MM患者，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第2版診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中男27例，女13例；年齡32～77歲，中位年齡60.5歲；免疫球蛋白類型IgG型22例，IgA型11例，IgD型2例，輕鏈型5例；按照Durie-Salmon分期診斷標(biāo)準(zhǔn)I期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期29例。20例健康對(duì)照組均為志愿獻(xiàn)髓者，男12例，女8例，年齡21～48歲，中位年齡34歲。

1.2主要儀器和主要試劑流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickinson公司的FACS Canto Ⅱ型。熒光標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體包括CD138、CD38、CD19、CD56、CD81、CD22、CD20、CD27、CD117、CD28、CD33、CD34、CD200、CD45，以及各自對(duì)應(yīng)的同型陰性對(duì)照試劑，紅細(xì)胞裂解液，破膜劑均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司，抗Kappa-FITC /Lambda -PE組合抗體(克隆號(hào)FR481)購(gòu)自丹麥DAKO公司。

1.3檢測(cè)方法EDTA抗凝的新鮮骨髓液送檢后于4 h內(nèi)按八色免疫熒光直接標(biāo)記方法，分別進(jìn)行細(xì)胞膜表面和胞漿內(nèi)染色。染色前用PBS洗2次，去除親細(xì)胞抗體。處理后的標(biāo)本在2 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，用BD FACS Diva軟件獲取500 000個(gè)細(xì)胞，對(duì)數(shù)取樣。正確的設(shè)門策略是分析漿細(xì)胞表型的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用CD138/CD45/SSC聯(lián)合設(shè)門，圈出CD45+或CD45dim+/-CD138+細(xì)胞群(P2)，分析該群細(xì)胞(P2)的抗原表達(dá)情況,見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果以熒光強(qiáng)度<102為陰性(-)，102～103范圍內(nèi)為弱陽(yáng)性(dim+)，103～ 104范圍內(nèi)為陽(yáng)性(+)，大于104為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。抗原表達(dá)>20%確定為抗原陽(yáng)性。

2結(jié)果

2.1骨髓中漿細(xì)胞比例MM患者骨髓標(biāo)本采用CD138/CD45/SSC設(shè)門后，可見CD45dim+/-CD138+區(qū)域有一群異常細(xì)胞，該群細(xì)胞占全部有核細(xì)胞的比例在3.5%～88.9%(中位值為17.55%)。同時(shí)送檢的骨髓涂片中原幼稚漿細(xì)胞的比例在1.5%～77.5%(中位值為16.5%)。20例正常對(duì)照骨髓，CD45+/ CD138+區(qū)域有微量細(xì)胞群，該細(xì)胞占全部有核細(xì)胞的比例在0.01%～0.42%(中位值為0.18%)。

2.2MM患者異常漿細(xì)胞免疫表型利用MP-FCM同時(shí)檢測(cè)胞膜抗原CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD81、CD200、CD27、CD28、CD117、CD20、CD33，以及胞膜和胞漿免疫球蛋白輕鏈(kappa/Lambda)的表達(dá)情況，可見多項(xiàng)抗原表達(dá)異常。MM中抗原異常表達(dá)率由高到低分別為CD45dim+/-(95%)、CD81dim+/-(80%)、CD56+(70%)、CD27dim+/-(50%)、CD200++(48%)、CD33+(40%)、CD28++(35%)、CD117+(18%)、CD19+(5%)和CD20+(3%)；限制性表達(dá)胞漿輕鏈，其中Kappa輕鏈型占55%，Lambda輕鏈型占45%。所有異常漿細(xì)胞均高表達(dá)CD138++和CD38+，均不表達(dá)胞膜Kappa和胞膜Lambda。見表1。

2.3健康對(duì)照組漿細(xì)胞免疫表型健康對(duì)照組漿細(xì)胞均表達(dá)CD38++、CD138+、CD19+、CD81+、CD27++和CD45+，不表達(dá)CD117、CD33、CD20、胞膜Kappa和胞膜Lambda；多克隆性表達(dá)胞漿輕鏈Kappa和Lambda。20例正常骨髓中有2例(10%)表達(dá)CD56+，2例(10%)弱表達(dá)CD200dim+，1例(5%)弱表達(dá)CD28dim+。見表1。

表1　正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞免疫表型特點(diǎn)

3討論

近年來(lái)，隨著對(duì)MM認(rèn)識(shí)的深入，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞免疫表型特征成為MM診斷和預(yù)后判斷的重要依據(jù)[2]。流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓瘤細(xì)胞免疫表型時(shí)，合理的設(shè)門策略是提高敏感性和可重復(fù)性的關(guān)鍵。根據(jù)2008年歐洲骨髓瘤工作組(EMN)[3]的推薦，為了準(zhǔn)確定量和富集骨髓瘤細(xì)胞，至少要有一個(gè)管抗體組合，將CD38、CD138、CD45包括在內(nèi)；初始設(shè)門應(yīng)該包括CD38++和CD138+共表達(dá)。本研究采用CD138/CD45/SSC聯(lián)合設(shè)門，每管均包括CD138和CD45兩種抗體，其中有一管包括CD38、CD138和CD45三種抗體，與EMN的要求一致，分析時(shí)首先使用CD38/CD138表達(dá)而不是CD138/CD45設(shè)門，可確保不遺漏CD45+漿細(xì)胞；同時(shí)選擇多項(xiàng)細(xì)胞膜表面和胞漿抗原來(lái)區(qū)別正常與異常漿細(xì)胞。與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究比較，本研究具有設(shè)門方案更精確，檢測(cè)抗原譜更廣，參數(shù)更多的特點(diǎn)。

本研究對(duì)MM患者和正常骨髓進(jìn)行了胞漿Kappa及Lambda的檢測(cè)，采用EMN推薦的檢測(cè)組合(cykappa/Lambda/CD19/CD38/CD138/CD45)，可以同時(shí)分析CD38++CD138+CD19-和CD38++CD138+CD19+兩類細(xì)胞的輕鏈克隆性，提高了檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果顯示，MM患者異常漿細(xì)胞的胞漿免疫球蛋白輕鏈均存在單克隆限制性表達(dá)，而正常漿細(xì)胞均呈多克隆表達(dá)。異常漿細(xì)胞典型的免疫表型為CD38++、CD138+、CD19-、CD56+、CD117+、CD45dim+/-、CD20+[3]。雖然絕大部分正常漿細(xì)胞表型是CD19+CD56-CD45+，然而可以檢測(cè)到少量正常漿細(xì)胞免疫表型與異常漿細(xì)胞相似。國(guó)外學(xué)者[4-6]報(bào)道正常骨髓中有20%～40%的正常漿細(xì)胞不表達(dá)CD19，10%～47%的正常漿細(xì)胞表達(dá)CD56。在正常獻(xiàn)髓者骨髓中可以檢測(cè)到漿細(xì)胞CD45弱表達(dá)(dim)[5]，CD45的表達(dá)隨著漿細(xì)胞分化過程逐漸下降[7-8]。少量正常漿細(xì)胞CD19-CD56+CD45dim+的表達(dá)可能導(dǎo)致異常漿細(xì)胞百分比的錯(cuò)誤計(jì)算[6]。Tembhare等[9]報(bào)道CD19、CD56和CD45抗原鑒別正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞特異性低，特異性分別為50%、74%、59%；CD20雖然有高的特異性(91%)，但是敏感度只有34%；CD81聯(lián)合以上抗原檢測(cè)特異性和敏感度均可以達(dá)到100%。

本研究結(jié)果表明，40例MM患者全部表達(dá)CD38++、 CD138+，有38例(95%)CD45弱陽(yáng)性表達(dá)或陰性，有28例(70%)CD56陽(yáng)性表達(dá)，2例(5%)CD19陽(yáng)性表達(dá)；20例正常組骨髓全部表達(dá)CD19+和CD45+，有2例(10%)表達(dá)CD56+。CD81在正常漿細(xì)胞上全部表達(dá)，但是在異常漿細(xì)胞上弱表達(dá)或陰性，是區(qū)別正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞的有效診斷指標(biāo)[10]。本研究顯示40例MM病例有16例CD81弱陽(yáng)性表達(dá)或陰性，較Tembhare等[9]報(bào)道的比值偏低，而健康對(duì)照組無(wú)一例CD81弱陽(yáng)性表達(dá)或陰性。CD81是鑒別良惡性漿細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，并且可能與MM發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，可以作為骨髓瘤的一種新的惡性預(yù)后指標(biāo)[11]。CD200也是鑒別良惡性漿細(xì)胞的有效診斷指標(biāo)之一，在正常漿細(xì)胞上弱表達(dá)，而在異常漿細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)。本研究顯示MM組有19例(48%)強(qiáng)表達(dá)CD200++，比Aref等[12]報(bào)道的比例低，而健康對(duì)照組有2例(10%)弱表達(dá)CD200dim+。CD200異常表達(dá)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，是預(yù)后不好的因素[13-14]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于CD81和CD200在MM患者中檢測(cè)和應(yīng)用的報(bào)道。本研究將CD81和CD200作為MM病例常規(guī)檢查指標(biāo)，提高了診斷率和準(zhǔn)確度。多項(xiàng)研究[15-21]表明，基本的檢測(cè)組合包括CD19和CD56可以覆蓋至少90%的MM患者，聯(lián)合CD20、CD117、CD28和CD27抗原可以增加到95%以上的患者。本組40例MM患者骨髓中惡性漿細(xì)胞診斷效率達(dá)到100%。

多項(xiàng)研究表明，CD19+、CD56+、CD117+、CD20+、CD27dim+/-、CD28++、CD33+等抗原表達(dá)異常與MM患者的預(yù)后密切相關(guān)，是預(yù)后不好的因素[3,22-24]。有研究報(bào)道CD117抗原表達(dá)與酪氨酸激酶的活化有相關(guān)性，如果患者CD117抗原表達(dá)陽(yáng)性率高，可以提示臨床采用酪氨酸激酶抑制劑治療[25]。CD20陽(yáng)性MM患者是否對(duì)利妥昔單抗有效，目前報(bào)道不一致。有研究[26]報(bào)道，療效與患者CD20陽(yáng)性細(xì)胞的比例有關(guān)。

總之，利用MP-FCM同時(shí)檢測(cè)胞膜CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD81、CD200、CD27、CD28、CD117、CD20和CD33多項(xiàng)抗原，及胞膜和胞漿免疫球蛋白輕鏈(kappa/Lambda)的表達(dá)情況,可以區(qū)分良惡性漿細(xì)胞，在MM的診斷與鑒別診斷，預(yù)后判斷，靶向治療等方面有著重要的價(jià)值。

(本文圖1見封三)

參考文獻(xiàn)

[1]張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].2版.北京: 科學(xué)出版社，1998：373-380.

[2]Carulli G,Ottaviano V,Cannizzo E,et al.Multiparameter immunophenotyping by flow cytometry as a diagnostic tool in multiple myeloma and monoclonal gammopathy of undeterimined significance[J].Clin Ter,2012,163(5): 387-392.

[3]Rawstron AC,Orfao A,Beksac M,et al.Report of the european myeloma network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and relateddisorders[J].Haematologica,2008,93(3): 431-438.

[4]Paiva B,Almeida J,Perez-Andres M,et al.Utility of flow cytometry immunophenotyping in multiple myeloma and other clonal plasma cell-related disorders[J].Cytometry B Clin Cytom,2010,78(4):239-252.

[5]Cannizzo E,Bellio E,Sohani AR,et al.Multiparameter immunophenotyping by flow cytometry in multiple myeloma:The diagnostic utility of defining ranges of normal antigenic expression in comparison to histology[J].Cytometry B Clin Cytom,2010,78(4):231-238.

[6]Peceliunas V,Janiulioniene A,Matuzeviciene R,et al.Six color flow cytometry detects plasma cells expressing aberrant immunophenotype in bone marrow of healthy donors[J].Cytometry B Clin Cytom,2011,80(5):318-323.

[7]Hermiston ML,Xu Z,Weiss A.CD45: A critical regulator of signaling thresholds in immune cells[J].Annu Rev Immunol,2003,21(1):107-137.

[8]Jensen GS,Mant MJ,Belch AJ,et al.Selective expression of CD45 isoforms defines CALLA+monoclonal B-lineage cells in peripheral blood from myeloma patients as late stage B cells[J].Blood,1991,78(3):711-719.

[9]Tembhare PR,Yuan CM,Venzon D,et al.Flow cytometric differentiation of abnormal and normal plasma cells in the bone marrow in patients with multiple myeloma and its precursor disease[J].Leuk Res,2014,38(3):371-376.

[10] Tohami T,Drucker L,Shapiro H,et al.Overexpression of tetraspanins affects multiple myeloma cell survival and invasive potential[J].FASEB J,2007,21(3):691-699.

[11] Paiva B,Gutierrez NC,Chen X,et al.Clinical significance of CD81 expression by clonal plasma cells in high-risk smoldering and symptomatic multiple myeloma patients[J].Leukemia,2012,26(8):1862-1869.

[12] Aref S,Azmy E,EI-Gilany AH.Upregulation of CD200 is associated with regulatory T cell expansion and disease progression in multiple myeloma[J/OL].Hematol Oncol,2015.doi: 10.1002/hon.2206.

[13] Muccio VE,Saraci E,Gilestro M,et al.Multiple myeloma: new surface antigens for the characterization of plasma cells in the era of novel agents[J].Cytometry B Clin Cytom,2015.doi: 10.1002/cyto.b.21279.

[14] Vela-Ojeda J,Garcia-Ruiz Esparza MA,Padilla-Gonzalez Y,et al.CD200 protein,bad prognostic in patients with multiple myeloma[J].Rev Med Inst Mex Sequro Soc,2015,53(4): 438-443.

[15] Perez-Andres M,Almeida J,MartinAyuso M,et al.Clonal plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance,multiple myeloma and plasma cell leukemia show different expression profiles of molecules involved in the interaction with the immunological bone marrow microenvironment[J].Leukemia,2005,19(3):449-455.

[16] Dahl IM,Rasmussen T,Kauric G,et al.Differential expression of CD56 and CD44 in the evolution of extramedullary myeloma[J].Br J Haematol,2002,116(2):273-277.

[17] San Miguel JF,Gutierrez NC,Mateo G,et al.Conventional diagnostics in multiple myeloma[J].Eur J Cancer,2006,42(11):1510-1519.

[18] Mateo G,Castellanos M,Rasillo A,et al.Genetic abnormalities and patterns of antigenic expression in multiple myeloma[J].Clin Cancer Res,2005,11(10):3661-3667.

[19] Mateo Manzanera G,San Miguel Izquierdo JF,Orfao de Matos A.Immunophenotyping of plasma cells in multiple myeloma[J].Methods Mol Med,2005,113(1):5-24.

[20] Moreau P,Robillard N,Jeqo G,et al.Lack of CD27 in myeloma delineates different presentation and outcome[J].Br J Haematol,2006,132(2): 168-170.

[21] Rawstron AC,Davies FE,Das Gupta R,et al.Flow cytometric disease moitoring in multiple myeloma: the relationship between normal and neoplastic plasma cells predicts outcome after transplantation[J].Blood,2002,100(9): 3095-3100.

[22] Pozdnyakova O,Morqan EA,Li B,et al.Patterns of expressionof CD56 and CD117 on neoplastic plasma cells and association with genetically distinct subtypes of plasma cell myeloma[J].Leuk Lymphoma,2012,53(10): 1905-1910.

[23] Moreau P,Robillard N,Avet-Loiseau H,et al.Patients with CD45 negative multiple myeloma receiving high-dose therapy have a shorter survival than those with CD45 positive multiple myeloma[J].Haemotoloqica,2004,89(5): 547-551.

[24] Robillard N,Wuilleme S,Lode L,et al.CD33 is expressed on plasma cells of a significant number of myeloma patients,and may represent a therapeutic target[J].Leukemia,2006,19(11): 2021-2022.

[25] 孫瑩，方美云，劉越堅(jiān).多發(fā)性骨髓瘤免疫表型特征及其意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010,18(2): 381-384.

[26] Moreau P,Voillat L,Benboukher L,et al.Rituximab in CD20 positive multiple myeloma[J].Leukemia,2007,21(4):835-836.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81472018)；安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(1408085MH145)

作者簡(jiǎn)介：張翠萍，主管技師，Email:794609084@qq.com

中圖分類號(hào):R733.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.03.002

(收稿日期：2015-10-08)

Immunophenotype and its clinical significant of multiple myeloma

ZhangCuiping*,WangPeng,LiQing,XuXiucai,HuChaojie,ZhengNan

(*CentralLaboratoryofMedicalResearchCenter,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniverstiy,Hefei230001,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the immunophenotype and its clinical significant of Multiple Myeloma(MM). MethodsThe immunophenotype of 40 patients with MM and 20 normal volunteers were detected by multiparameter flow cytometry(MP-FCM). ResultsThe abnormality expression of antigens sequence of patients with MM was CD45dim+/-(95%),CD81dim+/-(80%),CD56+(70%),CD27dim+/-(50%),CD200++(48%),CD33+(40%),CD28++(35%),CD117+(18%),CD19+(5%),CD20+(3%) in order. However the positive rations of CD56+, CD200dim+and CD28dim+were 10%, 10%and 5%, respectively. ConclusionMP-FCM inspections can accurately discriminate the benign and malignant plasma cell,and provide evidence for prognosis evaluation and targeted therapy.

[Key words]Multiple myeloma ; Immunophenotyping; Plasma Cells ; Flow cytometry