陳偉

(天津市第五中心醫(yī)院 皮膚科，天津 300450)

青鵬軟膏治療大鼠實(shí)驗(yàn)性濕疹皮炎的作用機(jī)理

陳偉Δ

(天津市第五中心醫(yī)院 皮膚科，天津 300450)

目的 分析青鵬軟膏對(duì)濕疹皮炎大鼠治療的作用機(jī)理。方法 將濕疹皮炎造模成功的14只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和研究組，對(duì)照組不給予任何處理，研究組給予青鵬軟膏治療，另選取7只大鼠為正常組，采取免疫組織化學(xué)法檢測(cè)皮膚組織中高遷移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)及白細(xì)胞介素(interleukin-17，IL-17)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 對(duì)照組BUN顯著高于正常組，研究組BUN顯著低于對(duì)照組，而高于正常組(P<0.05)。研究組和對(duì)照組大鼠IL-17、HMGB1、TLR4在皮膚組織中的表達(dá)水平均較正常組明顯升高，而研究組大鼠3項(xiàng)指標(biāo)水平較對(duì)照組大鼠明顯下降，上述對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 青鵬軟膏抑制濕疹皮炎大鼠HMGB1、TLR4、IL-17表達(dá)，并改善癥狀。

濕疹皮炎；青鵬軟膏；IL-17；HMGB1；TLR4

濕疹皮炎是一種常見(jiàn)的由多種內(nèi)外因素引起的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病。其特點(diǎn)為自覺(jué)劇烈瘙癢，皮損多形性，對(duì)稱(chēng)分布，有滲出傾向，慢性病程，易反復(fù)發(fā)作[1-2]。目前，關(guān)于濕疹皮炎的臨床研究較多，但其發(fā)病機(jī)制并未完全研究透徹，但有研究分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子高遷移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB)在濕疹皮炎致病中起著至關(guān)重要的作用，而Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)受體細(xì)胞及白細(xì)胞介素(interleukin-17，IL-17)表達(dá)與其有著緊密的協(xié)同作用[3-4]。本研究分析青鵬軟膏對(duì)濕疹皮炎大鼠皮膚組織中IL-17、HMGB1、TLR4表達(dá)的影響及作用，選取3組大鼠進(jìn)行了對(duì)比研究，意在探究青鵬軟膏治療濕疹皮炎的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取14只雄性Wistar大鼠為濕疹皮炎模型，體質(zhì)量18～24 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和研究組，另同時(shí)選取7只大鼠為正常組，所有選取大鼠均引種自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系繁殖飼養(yǎng)，均于試驗(yàn)前飼養(yǎng)1 w適應(yīng)后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，自由飲食、飲水，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)及終止實(shí)驗(yàn)時(shí)間：12周齡初～16周齡末。

1.1.2 主要試劑：免疫組化檢測(cè)試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)、兔抗大鼠TLR4多克隆抗體、兔抗大鼠HMGB1多克隆抗體、兔抗大鼠IL-17多克隆抗體(所有抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)、青鵬軟膏(西藏奇正藏藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字421400Z50,20g/支)。

1.1.3 主要儀器：TU-1801紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；KHB，ST-360型酶標(biāo)儀(上?？茖W(xué)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；TL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法：除正常組外其他2組大鼠均于第1天于后背剪毛約2 cm×3 cm,并涂5%二硝基氯苯(DNCB)30 μL于皮膚首次致敏，7d后在大鼠右耳內(nèi)側(cè)涂0.2%的DNCB 50 μL激發(fā)，以后每隔3 d激發(fā)1次，連續(xù)5次。于第4、5次激發(fā)后24、36、72 h觀(guān)察大鼠右耳較左耳殼明顯紅腫，并出現(xiàn)滲出和結(jié)痂，表明造模成功。模型建立后，對(duì)照組和正常組大鼠均給予常規(guī)飼養(yǎng)，不給予其他處理，而研究組大鼠于試驗(yàn)起點(diǎn)時(shí)于大鼠濕疹患處涂抹青鵬軟膏，每天2次，一共28 d。

1.2.2 標(biāo)本采集方法：3組大鼠均于28 d時(shí)，行眼眶取血2 mL，常規(guī)分離(2000 r/min,離心10 min)血清后處死；將處死后大鼠雙側(cè)皮膚皮質(zhì)組織取樣，并分別行4%多聚甲醛、2%戊二醇固定；同時(shí)，切取部分組織冷凍，于-72 ℃環(huán)境下冷藏備用。

1.2.3 檢測(cè)方法：①尿素氮(BUN)檢測(cè)：對(duì)3組大鼠BUN水平用AU-400全血自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)；②免疫組化檢測(cè)：免疫組織化學(xué)法對(duì)取樣皮膚組織中的IL-17、HMGB1及TLR4蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)：行常規(guī)切片→脫蠟水化→HE染色→抗原修復(fù)→稀釋后IL-17多克隆抗體、HMGB1多克隆抗體及TLR4多克隆抗體處理(一抗與二抗的稀釋比例均為1:200)→4 ℃過(guò)夜；陰性對(duì)照用PBS代替一抗。免疫組化結(jié)果利用Leica 全自動(dòng)顯微鏡(model DMLA，Leica Inc.，德國(guó))統(tǒng)一在400×(10×40)采集圖像，并利用Image-Pro Plus 圖像分析軟件(Version 4.1, Media Cybernetics)進(jìn)行灰度分析，以反映響應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 BUN水平對(duì)比 對(duì)照組為(9.62±0.81)μmol/L，與正常組(6.92±0.94)μmol/L比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.76，P<0.05)。研究組(8.34±0.80)μmol/L與對(duì)照組和正常組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.97，t=3.04，P<0.05)。

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。與正常組比較，對(duì)照組皮膚組織中IL-17、HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究組皮膚組織中上述指標(biāo)較正常組高，但顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 IL-17、HMGB1和TLR4在研究組和對(duì)照組皮膚組織中的免疫組化結(jié)果(×400)Fig.1 The immunohistochemical results of IL-17, HMGB1 and TLR4 in skins of two groups of rats(×400)

組別 IL-17(ng/mL)HMGB1(μg/L)TLR4(ng/L)正常組1.07±0.051.00±0.041.01±0.08對(duì)照組1.51±0.11*1.33±0.07*1.37±0.11*研究組1.29±0.09*#1.17±0.05*#1.19±0.09*#

*P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；#P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group

3 討論

濕疹皮炎病理改變具有多樣性及非均一性，濕疹為多數(shù)粟粒大紅色丘疹、丘皰疹或水皰，伴有明顯點(diǎn)狀或小片狀糜爛，滲液，結(jié)痂。損害境界不清。合并感染時(shí)可出現(xiàn)膿皰、膿性滲出及痂屑等[5-6]。濕疹皮炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制與遺傳、免疫、環(huán)境、生理等多種因素有關(guān)，且此類(lèi)疾病發(fā)病初期比較隱匿或急驟，發(fā)作兇險(xiǎn)且治療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象，這些均給臨床治療帶來(lái)了困難[7-8]。濕疹皮炎發(fā)病機(jī)理目前尚無(wú)肯定的、可重復(fù)驗(yàn)證的、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床結(jié)果一致的結(jié)論[9-10]。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，一些外來(lái)抗原(如逆病毒)和內(nèi)源性抗原作用于免疫調(diào)節(jié)功能異常的患者，使B淋巴細(xì)胞高度活躍增殖，產(chǎn)生大量自體抗體，并與相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉積于皮膚小球是濕疹皮炎的主要發(fā)病機(jī)制[11-12]。DNA與皮膚小球基底膜結(jié)合，并與循環(huán)中抗DNA抗體原位形成免疫復(fù)合物亦可參與濕疹皮炎的發(fā)生。一些補(bǔ)體成分的缺陷以紅細(xì)胞和吞噬細(xì)胞上FC或C3b受體密度減低，對(duì)免疫復(fù)合物的清除能力下降，可增加免疫復(fù)合物在組織中的沉積，加重組織損害[13-14]。補(bǔ)體激活，趨化因子形成，白細(xì)胞聚集，再釋出一系列炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，導(dǎo)致小血管炎癥及皮膚小球損害。與此同時(shí)，皮膚組織也有明顯白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，這與細(xì)胞間粘附因子(ICAM)及MHC抗原有關(guān)[15-16]。由于濕疹皮炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，因此其皮膚病理改變也呈多樣化及多變化，每一患者的皮膚組織及小血管均可能出現(xiàn)不同的改變。濕疹皮炎主要組織學(xué)改變?cè)谄つw組織，但是皮膚小血管的改變同樣也決定患者的預(yù)后。皮膚組織病理的損傷，在很大程度上取決于抗體沉積的數(shù)量和所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。持續(xù)的抗體沉積，不斷引發(fā)炎癥，最終導(dǎo)致不可逆的損害。其皮膚病理改變的特征為：“鐵絲圈”病損：由于內(nèi)皮沉積物而使基膜增厚，電鏡和免疫熒光檢查有大量的內(nèi)皮下沉積物，是濕疹皮炎皮膚損害的重要特征；蘇木素小體：一般認(rèn)為是抗核體在原位造成細(xì)胞損傷所致，由核染色聚集而成；壞死性血管炎：微動(dòng)脈和毛細(xì)血管呈纖維素壞死；電鏡下可見(jiàn)電子致密物沉積、核碎裂、病毒樣顆粒和包涵物；免疫熒光檢查：有彌漫性顆粒狀沉積物，以IgG、C3為主[17-18]。

傳統(tǒng)治療濕疹皮炎的臨床方案為糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺，雖然在一定程度上使得患者得到治愈，但其有效率不穩(wěn)定，且長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺會(huì)出現(xiàn)感染、高血糖、高血壓、消化道潰瘍以及肝毒性、性腺損壞等不良反應(yīng)[5-6]。目前如何提高臨床治療效果以及抑制復(fù)發(fā)和不良反應(yīng)的出現(xiàn)、減少用藥量等已經(jīng)成為近年來(lái)濕疹皮炎臨床治療的研究熱點(diǎn)[19]。本研究結(jié)果顯示，濕疹皮炎會(huì)直接導(dǎo)致大鼠體內(nèi)血液中BUN的含量上升(P<0.05)，這說(shuō)明該病癥會(huì)直接對(duì)大鼠皮膚功能造成損害，而給予青鵬軟膏處理后，發(fā)現(xiàn)研究組大鼠BUN水平較對(duì)照組下降(P<0.05)，這說(shuō)明青鵬軟膏在一定程度上有助于改善大鼠皮膚功能的作用；濕疹皮炎大鼠模型皮膚組織中IL-17、HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平均較正常組明顯提升(P<0.05)，這說(shuō)明3者在皮膚致炎中可能起到一定的致炎作用，且3者之間呈現(xiàn)為協(xié)同作用，而這一研究結(jié)果得到了陳寧等的證實(shí)[9-10]；另外，研究組大鼠在給予青鵬軟膏處理后，發(fā)現(xiàn)該組大鼠皮膚組織中三指標(biāo)蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組大鼠明顯下降(P<0.05)，這說(shuō)青鵬軟膏在一定程度上具備治療濕疹皮炎的效果，其能抑制上述三項(xiàng)指標(biāo)的蛋白表達(dá)，進(jìn)而起到緩解炎癥的作用。

綜上所述，青鵬軟膏能抑制IL-17、HMGB1、TLR4在皮膚組織中的表達(dá)，一定程度上能夠防止?jié)裾钇ぱ?，這對(duì)于治療因濕疹皮炎引發(fā)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡有一定的臨床價(jià)值。

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(編校：王儼儼)

Mechanism of Qingpeng ointment in the treatment of experimental eczema dermatitis in rat

CHEN WeiΔ

(Department of Dermatology, Tianjin Fifth Central Hospital, Tianjin 300450, China)

ObjectiveTo study the effect of Qingpeng ointment on LI-17, HMGB1 and TLR4 expression levels in the rat with eczema dermatitis.MethodsFourteen rats established eczema dermatitis model were randomly divided into study group and control group, control group were not given any treatment, study group

Qingpeng ointment, another 7 rats were selected as normal group.The expression levels of high mobility group protein (HMGB), Toll like receptor 4 (TLR4) and interleukin-17 (IL-17) in skin were detected by immunohistochemistry.ResultsThe BUN in control group was higher than the normal group, the BUN in study group was lower than the control group but higher than normal group(P<0.05).The expression levels of IL-17,HMGB1 and TLR4 in skin of study group and control group were higher than normal group,respectively,while the above indicators in study group were lower than control group (P<0.05).ConclusionQingpeng ointment could inhibit the expression levels of HMGB1, TLR4 and IL-17 in the rat with eczema and dermatitis, and improve the symptoms.

eczema dermatitis; Qingpeng ointment; IL-17; HMGB1; TLR4

陳偉，通信作者，女，副主任醫(yī)師，研究方向：變態(tài)反應(yīng)性疾病，E-mail: chenweixs111@163.com。

R758.23

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.14