田慧敏++文靜++任芳

摘要：利用子實體形態(tài)特征和rDNA-ITS測序分析相結(jié)合的方法，對采自內(nèi)蒙古赤峰市賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)的1份色釘菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O.K. Mill]進(jìn)行了鑒定，對其rDNA-ITS區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，片段約為730 bp，并對其外形特征及顯微特征進(jìn)行了詳細(xì)描述。

關(guān)鍵詞：色釘菇；ITS測序；形態(tài)學(xué)；菌種鑒定

中圖分類號： S646.901文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0261-03

色釘菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O.K. Mill.]，別稱血紅鉚釘菇，俗稱紅蘑、松蘑等，屬擔(dān)子菌門牛肝菌目（Boletales）鉚釘菇科（Gomphidiaceae）色釘菇屬（Chroogomphus），首次由Jacob 于1774年描述為Agaricus rutilus，后Miller于1964年劃入色釘菇屬Chroogomphus[1]。該菌與松屬的植物共生，最早發(fā)現(xiàn)于歐洲和北美，主要識別特點是菌蓋近圓錐形，后平展中部凸起，邊緣內(nèi)卷，淺棠梨色至咖啡褐色、磚紅色、紅褐色，濕時黏，干有光澤。菌褶延生，稀，青黃色漸變紫褐色，不等長，菌柄與菌蓋色相近且基部帶黃色，上部有易消失的紅褐色菌環(huán)，囊狀體呈長棒狀[2]。

研究表明，色釘菇含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、多糖、萜類、內(nèi)酯、香豆素、酚類、甾類等營養(yǎng)物質(zhì)，具有廣泛的藥用活性[3]，其多糖具有明顯的抗腫瘤活性，尤其對肝癌的治療具有輔助作用[4-7]，在我國該菌廣泛分布，是名貴的野生食用真菌和藥用菌，深受人們的喜愛，但是其子實體受環(huán)境和地域的影響，顏色、大小會有一定的變化，而且該種與多種鉚釘菇科真菌外形相似，如粘鉚釘菇（Gomphidius glutinosus）、紅鉚釘菇（G. roseus）、亞紅鉚釘菇（G. subroseus）等，采食時容易混淆，市場上的干品經(jīng)常會混有其他品種，因此僅靠形態(tài)識別會產(chǎn)生誤差。國內(nèi)外許多菌物學(xué)家利用ITS測序技術(shù)對其進(jìn)行了鑒定并研究了演化地位[8-10]。本研究利用形態(tài)學(xué)和 rDNA-ITS 序列測序法相結(jié)合的方法對色釘菇（Chroogomphus rutilus）進(jìn)行了分類鑒定并做了詳細(xì)的描述。

1材料與方法

1.1供試標(biāo)本

供試標(biāo)本子實體于2013年8月17日采自內(nèi)蒙古赤峰市賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)慶云山（43°12′ ～44°28′N，118°11′ ～120°05′E），樟子松地上散生。標(biāo)本晾干后，編號（CFSZ10397、10390）、分類、鑒定，超低溫冷凍后存放于赤峰學(xué)院菌物標(biāo)本室（CFSZ）。

1.2形態(tài)鑒定

宏觀觀察使用體視顯微鏡，顏色的判斷主要依據(jù)采集時拍攝的彩色照片，大小用游標(biāo)卡尺測量新鮮子實體2～5個，菌蓋、菌柄大小、顏色、形狀、附屬物等，菌褶顏色，變化，著生方式，菌肉顏色、味道、氣味等項。顯微觀察通常4%～5%KOH作浮載劑。孢子、菌絲、囊狀體、擔(dān)子等的淀粉質(zhì)反應(yīng)是將材料置于Melzer氏試劑中來判斷。

1.3ITS鑒定

1.3.1基因組DNA的提取及檢測子實體干品菌蓋部分（含菌褶）用液氮研磨，使用北京鼎國生物公司的真菌DNA提取試劑盒對提取的DNA進(jìn)行純化后，先用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增ITS-PCR的擴(kuò)增體系為：PCR mix 25 μL，20 mol/L ITS1/ITS4引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在德國eppendorf公司的5331型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序為：94 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共34個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。ITS引物為ITS1和ITS4通用引物[11]。

1.3.3測序PCR產(chǎn)物經(jīng)Takara膠回收試劑盒回收純化后，委托上海生工生物科技有限公司完成。

1.3.4ITS序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析將已測得的ITS序列和從GenBank上獲得的相似度90%以上的鉚釘菇屬和粘鉚釘菇屬18個ITS序列，用MEGA 6.06軟件進(jìn)行多重對位排比，并采用最大相似法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹的每個分支的統(tǒng)計學(xué)顯著性分析以Bootstrap方法進(jìn)行檢驗，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)樣品10397子實體菌蓋的顏色、形狀、大小以及孢子、擔(dān)子、囊狀體等顯微形態(tài)特征初步鑒定為色釘菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O.K. Mill.]。

子實體中等大小，菌蓋直徑2.5～9.0 cm，初期鐘形或近圓錐形，后平展中部凸起，邊緣內(nèi)卷，有時平展，紫紅色、葡萄酒紅色、磚紅色，表面很黏，光滑，表皮下淡紫紅色；菌肉白色帶紅色，干后淡紫紅色，近菌柄基部帶黃色，無明顯氣味，菌褶延生，稀，幼時青黃色、銹色，后漸變?yōu)樽虾稚?、灰紫色或灰褐色，?長菌褶間有1片不等長的短菌褶，小菌褶至菌蓋邊緣長出。菌柄長3～7.5 cm，粗1.0～2.5 cm，圓柱形且向下漸細(xì)，上部有黏液，色同菌蓋，近基部黃色，表面不光滑，似有纖維狀絨毛。實心，上部往往有紫褐色纖毛狀菌環(huán)。孢子印橄欖色至黑褐色。

孢子大小為（12.2～20.6）μm×（4.5～7.2）μm，長橢圓形或梭形，淡棕色或黃棕色，中間有青黃色內(nèi)含物，有小尖，有的具2～3個小油滴，淀粉質(zhì)。擔(dān)子大小為（50～70）μm×（8～10.2）μm，棒狀，頂端漸膨大，無色，4個小梗。褶側(cè)囊體大小為（110.6～187.2）μm×（13.2～18.8）μm，無色，圓柱狀或棒狀，基部漸細(xì)，薄壁。菌褶菌絲短柱狀，無色直立，有隔膜，大小為（43.2～76.8）μm×（10.8～19.2）μm，未見鎖狀聯(lián)合，Melzers試劑變藍(lán)。菌蓋表皮由排列緊密的菌絲組成，菌絲圓柱狀，直立，頂端稍膨大，無色，薄壁，有隔膜，大小約（50～110.4）μm×（6.0～9.6）μm，菌柄表皮由雜亂的菌絲組成，菌絲圓柱狀，無色，直徑7.2～14.4 μm（圖1）。

色釘菇（C .rutilu）與黏鉚釘菇（Gomphidius glutinosus）、紅鉚釘菇（G.roseus）、亞紅鉚釘菇（G.subroseus）均生長于我國華北地區(qū)，外形相似，但是G. glutinosus為灰紫色，暗褐色，具黑色斑點，C .rutilus菌蓋偏紅色，與紅鉚釘菇（G. roseus）、亞紅鉚釘菇（G. subroseus）相比，C. rutilus菌蓋偏紫色，有時具有黃色色調(diào)，而G. roseus和G. subroseus常常是粉紅色或正紅色[12-13]，而且菌蓋邊緣往往有菌幕殘留，4種真菌都常見于松林中，在我國華北地區(qū)均有分布，可作為食用菌，但采集食用前去除黏液和菌蓋表皮為宜[14]。

2.2PCR擴(kuò)增及ITS序列比對結(jié)果

對供試樣品基因組DNA的18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA和 ITS2進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示ITS序列長約730 bp。將該菌ITS序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast檢索比對，共得到了18個與供試樣品具有較高相似率的序列物種（表1）。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

對ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，19個種聚為4大類，即美味牛肝菌（Boletus edulis）、Rhizopogon salebrosus、鉚釘菇屬（Gomphidius）和鉚擬釘菇屬（Chroogomphus），鉚釘菇屬（Gomphidius）和鉚擬釘菇屬（Chroogomphus）分別處于不同的分枝，樣品10 397與C. rutilus聚為一類，處鉚擬釘菇屬（Chroogomphus）分枝上，支持率為95%（圖2）。與C. orientirutilus親緣關(guān)系較近，而與Gomphidius glutinosus、G. roseus、G. subroseus親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3討論

ITS測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，色釘菇（C. rutilus）與東方色釘菇（C. orientirutilus）、紫色釘菇（C. purpurascens）、變色色釘菇（C. vinicolor）和易混色釘菇（C. confusus）親緣關(guān)系較近，而與Gomphidius glutinosus、G. roseus、G. subroseus親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但是C. orientirutilus菌蓋亮紅色、血紅色，且囊狀體具有塊狀結(jié)晶[15]，而C. rutilus菌蓋紫紅、咖啡紅色，囊狀體壁光滑；C. purpurascens菌蓋紫色或深紫色，菌柄橘黃色，而C. rutilus菌蓋偏紅色，具有紫色色調(diào)，菌柄色同菌蓋，僅基部亮黃色；變色色釘菇（C. vinicolor）菌蓋表面不黏，有時具細(xì)

小絨毛，且囊狀體壁厚，最寬處可達(dá)5～7.5 μm[2，16-17]，而C. rutilus菌蓋濕時很黏，光滑，囊狀體壁很??；易混色釘菇（C. confusus）菌蓋較小，為1～4cm，黃棕色、橘色具有紅色色調(diào)，且囊狀體具，結(jié)晶。而且東方色釘菇（C. orientirutilus）、變色色釘菇（C. vinicolor）、易混色釘菇（C. confusus）生長于在我國西南部，只有紫色釘菇（C. purpurascens）生于我國東北部，色釘菇（C. rutilus）全國都有分布。鉚釘菇屬（Gomphidius）和色釘菇屬（Chroogomphus）同屬于鉚釘菇科（Gomphidiaceae），親緣關(guān)系較近，外形特征極其相似，很難區(qū)分，二者主要的區(qū)別是釘菇屬（Chroogomphus）菌肉往往黃色或橙色，菌絲組織在Melzers試劑中變藍(lán)，而鉚釘菇屬（Gomphidius）主要的區(qū)別特征是菌褶幼時有菌幕，菌蓋邊緣往往有菌幕殘留物，有時會脫落，組織非淀粉質(zhì)[1，2，10]，有時這些特征不太明顯，給鑒定帶來一定困難。ITS以其簡便易操作、變異度豐富等特點，在真菌種及相似種的鑒定中起著很重要的作用，但由于該區(qū)片段有限，攜帶信息較少，在鑒定過程中存在一定的誤區(qū)，將二者相結(jié)合，可使鑒定更加準(zhǔn)確、全面。

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