薛智權(quán)，唐中偉，李浩，周然，梁建萍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷，030801； 2.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原，030024)

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山西黃芪根際固氮菌的分離與應(yīng)用

薛智權(quán)1，唐中偉1，李浩1，周然2，梁建萍1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷，030801； 2.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原，030024)

摘要：[目的]對(duì)黃芪道地產(chǎn)區(qū)山西渾源的黃芪根際固氮細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，并應(yīng)用于黃芪栽培中以觀察其固氮能力，旨在篩選并獲得能夠促進(jìn)黃芪生長(zhǎng)的固氮菌，為降低黃芪生產(chǎn)成本提供依據(jù)。[方法]采用Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基初篩獲得了120個(gè)自生固氮菌株；進(jìn)一步用固氮培養(yǎng)基對(duì)初篩所得菌株進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)固氮能力、菌落生長(zhǎng)速度等特征，獲得了2株具有較強(qiáng)固氮能力的菌株t16和t21；通過細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和 16S rRNA 序列分析對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。另外還用全N差值法檢測(cè)了t16和t21浸泡黃芪種子后的固氮活性。[結(jié)果]t16和t21分別屬于Rhizobium sp.和Sinorhizobium sp.。經(jīng)兩株菌發(fā)酵液浸泡后，培養(yǎng)30 d分別能夠增加黃芪幼苗含氮量14.23%～18.67%和13.10%～18.77%。其中含菌量為106個(gè)·mL-1的t16發(fā)酵液和含菌量為108個(gè)·mL-1的t21發(fā)酵液效果最好，折算每公頃30 d的固氮量達(dá)2.25 kg。[結(jié)論]山西黃芪根際固氮菌具有較大的開發(fā)利用潛力。

關(guān)鍵詞：固氮菌； 黃芪； 根際； 分離； 鑒定

近年來，全球種植業(yè)過分依賴和大量施用化肥造成的肥料浪費(fèi)、土壤和地下水污染以及生態(tài)失衡已經(jīng)引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。減少化肥的使用、提高氮肥利用率是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中急需解決的重要問題。充分發(fā)揮固氮細(xì)菌的生物固氮作用是減少氮肥使用量最有效的途徑，生物固氮資源的研究、開發(fā)和利用在我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位。生物固氮是自然界中僅次于光合作用的復(fù)雜生物反應(yīng)系統(tǒng)，為全球的植物提供了大約75%的氮素[1, 2]?？諝庾鳛樽畲蟮牡獛?kù)，其含量的80%為氮?dú)?。然而氮?dú)夥肿佑蓛蓚€(gè)氮原子以N≡N三鍵相連接，非常牢固，很難打斷，因此不能被一般植物直接利用。許多豆科植物，例如花生、大豆、苜蓿等，可以通過與根瘤菌協(xié)作，將空氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘睉B(tài)氮，再被植物利用。在這種協(xié)作模式下，每個(gè)根瘤就是一座微型氮肥生產(chǎn)單位，將分子氮轉(zhuǎn)變成氨氮，再輸送給植株利用。根瘤中的固氮菌給植株生產(chǎn)的氮肥不會(huì)有環(huán)境污染，直接供給植株，免去了長(zhǎng)途運(yùn)輸和施用環(huán)節(jié)，避免了氮的損失。相比較而言，人工施用化學(xué)氮肥的流失率往往大于50%。生物固氮在提高土壤肥力、增強(qiáng)植物抗病能力等方面也發(fā)揮著極其重要的作用[3]。

固氮細(xì)菌可分為自生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌三類[4]。自生固氮菌本身具有完整的固氮能力，分布很廣，但是種類較少，如圓褐固氮菌和拜葉林克氏固氮菌。聯(lián)合固氮存在于植物根系周圍，依靠根系分泌物生存、繁衍，并發(fā)揮固氮作用。雀稗固氮菌[5]和產(chǎn)脂固氮螺菌即屬于此類。共生固氮菌廣泛分布于土壤中，在豆科植物根系延伸時(shí)，通過根部細(xì)胞裂縫進(jìn)入表皮內(nèi)形成根瘤，通過與植物的共同作用將空氣中的分子氮轉(zhuǎn)化為氨氮并被植物利用。目前農(nóng)業(yè)方面主要應(yīng)用聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌，自生固氮菌由于其固氮效率低，且固氮方式特殊，不適合在農(nóng)業(yè)方面廣泛應(yīng)用。

黃芪(Astragalus membranaceusBunge)是豆科黃芪屬多年生草本植物，又名綿芪。在我國(guó)產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，黃芪有2 000多年的藥用歷史，有補(bǔ)氣、消腫、抗炎、生肌等功效[6]。由于臨床需求量大，長(zhǎng)期大量采挖，導(dǎo)致近年來野生黃芪的數(shù)量急劇減少，有趨于絕滅的危險(xiǎn)。山西渾源縣是黃芪的道地產(chǎn)地，所產(chǎn)黃芪中甲甙、多糖等活性成分的含量均居國(guó)內(nèi)之首，并于2011年獲批國(guó)家地理標(biāo)志證明商標(biāo)“正北芪”。根據(jù)渾源道地黃芪的正宗藥用性和原產(chǎn)地有用成份這一地理標(biāo)識(shí)產(chǎn)物，本項(xiàng)目以其原生地土壤根瘤菌為研究基礎(chǔ)，對(duì)道地黃芪的固氮根瘤菌進(jìn)行分離，篩選和鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)條件和生理生化以及生物信息學(xué)方面進(jìn)行研究，旨在為利用生物固氮在黃芪生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)節(jié)肥減耗、加強(qiáng)黃芪種植業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試土壤

分離固氮菌的土壤來自山西大同渾源縣麗珠集團(tuán)黃芪基地。采樣深度為10～20cm，采樣時(shí)間為2013年8月中旬。土壤樣品采樣時(shí)保留部分黃芪根系，從田間取得的新鮮土壤樣品放入塑料樣品采集袋中，封口，室溫保存。

1.1.2培養(yǎng)基

本文所用的培養(yǎng)基參考相關(guān)文獻(xiàn)配制：分離培養(yǎng)基為Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基[7]；恢復(fù)培養(yǎng)基為固氮培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基；富集培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基；鑒別培養(yǎng)基采用了淀粉培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基和石蕊牛奶培養(yǎng)基[8]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1固氮菌的分離與初篩

稱取新鮮土樣10g，放入盛有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，搖床振蕩30min制成菌懸液，取上清液在試管中作梯度稀釋。選取3個(gè)稀釋度(10-3、10-4、10-5)的菌懸液0.1mL涂布于Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5d，統(tǒng)計(jì)固氮菌的菌落數(shù)量。觀察菌落的形態(tài)特征，并統(tǒng)計(jì)不同來源樣品中固氮菌的種類。選取生長(zhǎng)速度快、菌落單一且形態(tài)完整的菌株，用無(wú)菌槍頭挑取不同種類的單菌落各5個(gè)，接種到新鮮的LB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4d后，革蘭氏染色，觀察其菌體形態(tài)特征[8, 9]。連續(xù)劃線純化5次以上，篩選的菌株在-80 ℃保存?zhèn)溆?甘油∶菌液=2∶3)。

1.2.2固氮菌株的鑒定

(1)菌體形態(tài)學(xué)鑒定

將高效固氮菌株t16和t21菌體分別接種到Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)5d，觀察菌落形態(tài)特征。以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為對(duì)照涂片，進(jìn)行革蘭氏染色并觀察菌體形態(tài)。

(2)菌株生理生化特征的測(cè)定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]對(duì)篩選得到的高效固氮菌株t16和t21進(jìn)行生理生化鑒定，所測(cè)定的項(xiàng)目包括淀粉水解實(shí)驗(yàn)、VP試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和耐鹽試驗(yàn)等。

(3)菌株的分類鑒定

本實(shí)驗(yàn)以菌株t16和t21的總DNA作模板擴(kuò)增16SrDNA[10]。所用引物為P1 5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’和P6 5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，分別對(duì)應(yīng)于根瘤模式菌株16SrRNA的第8～37堿基位置和第1 479～1 506堿基位置[11]。 25μL的反應(yīng)體系： 10×buffer2.5μL，dNTP2μL，DNA模板 2μL，引物P1 1μL，P6 1μL，Taq酶0.125μL(5U·μL-1)，ddH2O16.5μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min，進(jìn)入熱循環(huán)：94 ℃變性1min，60 ℃退火1min，72 ℃延伸2min，共34個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸 10min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。然后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序工作在英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。通過BLAST對(duì)得到的16SrRNA序列在GenBank里面進(jìn)行比對(duì)，以確定其種屬。

1.2.3固氮活性測(cè)試

供試黃芪種子由山西渾源縣黃芪種植基地提供。采用全N差值法測(cè)定菌株的固氮能力。將篩選得到的新菌株t16和t21接種到100mLYMA液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖瓶培養(yǎng)后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用去離子水稀釋，獲得含菌量為106個(gè)·mL-1、107個(gè)·mL-1、108個(gè)·mL-1的菌劑。將洗凈滅菌的蛭石(粒徑為2mm)放入直徑8cm、高10cm塑料盆中，作為無(wú)氮培養(yǎng)場(chǎng)地。試驗(yàn)分3個(gè)處理和1個(gè)對(duì)照共4組，每組5個(gè)樣品盆，重復(fù)3次，隨機(jī)排列。各處理組的黃芪種子用上述3個(gè)濃度的菌液浸泡3h，對(duì)照用去離子水浸泡3h。然后將種子播種到裝有蛭石的塑料盆中，并把上述菌劑各30mL倒入到相應(yīng)的盆中，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每天澆水30mL，培養(yǎng)30d收獲黃芪苗，每組隨機(jī)采樣10株幼苗全株，計(jì)量平均苗高和葉片數(shù)，洗凈后置于烤箱內(nèi)烘干，測(cè)定黃芪苗的含氮量[12]。

2結(jié)果與分析

2.1黃芪根際固氮菌的分離及鑒定

2.1.1細(xì)菌培養(yǎng)特性及理化性質(zhì)

從黃芪道地種植基地收集的土壤樣品中分離獲得能在Ashby培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株120株。根據(jù)生長(zhǎng)速度和菌斑大小，確定其固氮活性，最后篩選出兩株固氮活性最高的菌株t16和t21。在YMA固體培養(yǎng)基上，菌株t16的菌落呈圓形，白色，半透明，濕潤(rùn)。菌株t21生長(zhǎng)較快，菌落形態(tài)呈圓形，無(wú)色透明，菌落成粘稠狀易流動(dòng)(圖1)。革蘭氏染色顯示菌株t16為革蘭氏陰性桿菌，孔雀綠染色呈陰性，提示新菌株t16細(xì)胞內(nèi)不含有芽胞(圖2)。菌株t21為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢，有PHB顆粒(圖3)。對(duì)它們分別作了生理生化鑒定，結(jié)果見表1。

圖1　菌株t16和t21的菌落形態(tài)Fig.1　The colony morphology of strains t16 and t21　　注：A：t16；B：t21。在YMA平板上，t16菌落呈圓形，白色，半透明，濕潤(rùn)；t21菌落為乳白色，粘稠狀，易流動(dòng)Note:A: strain t16; B: strain t21. In YMA culture plate, t16 colonies were round, white, translucent, and moist, while t21 colonies were milky white, sticky, and easy flow.

圖2　菌株t16的染色特性(100×)Fig.2　Dying properties of strain t16　　注：A：革蘭氏染色,結(jié)果顯示菌株t16為革蘭氏陰性桿菌；B：孔雀綠染色呈陰性，提示菌株t16細(xì)胞內(nèi)不含有芽胞Note:A: The results of gram staining show that strain t16 is a gram-negative bacillus. B: The results of malachite green straining are negative, suggesting that strain t16 does not contain endospore

圖3　菌株t21的染色特性(100×)Fig.3　Dying properties of strain t21　　注：A：革蘭氏染色,結(jié)果顯示菌株t21為革蘭氏陰性桿菌；B：孔雀綠染色呈陰性，提示菌株t21細(xì)胞內(nèi)不含有芽胞；C：蘇丹黑B染色呈陽(yáng)性，菌體內(nèi)有黑色著色點(diǎn)，為菌體內(nèi)的PHB顆粒Note:A: The results of gram staining show that strain t21 is a gram-negative bacillus. B: The results of malachite green straining are negative, suggesting that strain t21 do not contain endospore. C: The results of sultan black B staining show that lots of black points in bacteria, which means that PHB particles in vivo

Table1Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstraint16andt21

測(cè)定指標(biāo)Testitemst16t21淀粉水解試驗(yàn)--氧化酶試驗(yàn)++VP試驗(yàn)--接觸酶試驗(yàn)++石蕊牛奶試驗(yàn)暫無(wú)反應(yīng)暫無(wú)反應(yīng)甲基紅試驗(yàn)--耐鹽性試驗(yàn)++

注：“+”表示呈陽(yáng)性反應(yīng)，“-”表示呈陰性反應(yīng)。

Note: “+”meanspositivereaction， “-”meansnegativereaction.

2.1.2菌株的分類鑒定

提取黃芪固氮菌t16和t21菌株的基因組DNA，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增其16SrRNA部分序列，得到一條長(zhǎng)度約為1 500bp的DNA片段(圖4)。測(cè)序后獲得序列長(zhǎng)度為1 311bp，序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為KP735940和KP7395941。使用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，新菌株t16與Rhizobium fabae的16SrRNA基因序列同源性為100%(KF465964.1)，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，將新菌株t16確定為Rhizobiumsp.。而t21菌株與Sinorhizobiumsp.SCAUS141的16SrRNA基因序列同源性為99%(KF836038)，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，將新菌株t21確定為Sinorhizobiumsp.。

圖4　菌株t16和t21的16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.4　The fragments of 16S rRNA amplified by PCR　　注：A：t16；B：t21。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在1 500 bp附近有擴(kuò)增條帶Note:A: strain t16; B: strain t21. The results of agarose gel electrophoresis show that there are fragments about 1 500 bp in PCR products

2.2固氮菌活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1黃芪幼苗生長(zhǎng)情況

種植于無(wú)氮基質(zhì)中的黃芪，接種道地黃芪分離出的固氮菌30d后將其植株完整取出，測(cè)量黃芪幼苗連根的長(zhǎng)度，并計(jì)數(shù)黃芪的葉片數(shù)，見圖5、圖6和表2、表3。

圖5　菌株t16發(fā)酵液處理黃芪種子后培養(yǎng)30 d黃芪幼苗的生長(zhǎng)情況Fig.5　The growth of AMB seedlings after being treated by strain t16 and cultured for 30 days

試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，用菌液處理后的幼苗長(zhǎng)度和葉片數(shù)都要明顯高于對(duì)照，其中106個(gè)·mL-1濃度處理后的效果更佳。

圖6　菌株t21發(fā)酵液處理黃芪種子后培養(yǎng)30 d黃芪幼苗的生長(zhǎng)情況Fig.6　The growth of AMB seedlings cultured for 30 days, which were come from the seeds treated by strain t21

試驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明，用菌液處理后的幼苗長(zhǎng)度和葉片數(shù)都顯著高于對(duì)照，其中108個(gè)·mL-1濃度處理后的效果更佳。

表2黃芪固氮新菌株t16發(fā)酵液處理黃芪種子后對(duì)黃芪苗的影響

Table2TheseedlinglengthandnumberofleavesofAMBseedlingstreatedwithstraint16

組別Group平均苗高/cmAveragehighofplants平均每株葉片數(shù)AveragenumberleaveseachplantCK11.8±1.835.7±1.42106個(gè)·mL-113.9±0.83**7.2±0.87**107個(gè)·mL-113.3±0.90*6.2±1.90108個(gè)·mL-113.1±1.04*6.9±1.51*

注：*跟CK相比較P<0.05； **跟CK相比較P<0.01

Note: *:comparedwithCK,P<0.05; **:comparedwithCK, P<0.01.

表3黃芪固氮新菌株t21發(fā)酵液處理黃芪種子后對(duì)黃芪苗的影響

Table3TheseedlinglengthandnumberofleavesofAMBseedlingstreatedwithstraint21

組別Group平均苗高/cmAveragehighofplants平均每株葉片數(shù)AveragenumberleaveseachplantCK11.8±1.835.7±1.42106個(gè)·mL-118±2.72**10.2±1.08**107個(gè)·mL-116.5±1.2**9.9±1.5**108個(gè)·mL-119.4±2.97**10.2±2.04**

注： **與CK相比較P<0.01

Note: **meanscomparedwithCK, P<0.01.

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用固氮新菌株t16和t21的發(fā)酵液處理黃芪種子，以及對(duì)幼苗澆灌后，對(duì)黃芪幼苗生長(zhǎng)速度和葉片發(fā)育速度均有顯著的促進(jìn)作用，培養(yǎng)30d后黃芪的苗高和葉片數(shù)均顯著高于對(duì)照。菌株t16的發(fā)酵液在106個(gè)·mL-1這一濃度處理后的效果要優(yōu)于另外兩個(gè)較高濃度的效果，而菌株t21則是在108個(gè)·mL-1這一濃度的處理效果最佳。這也提示，在用菌液處理種子時(shí)，不是濃度越大越好，不同菌株要采用適當(dāng)?shù)臐舛炔拍苓_(dá)到最好的效果。

2.2.2黃芪幼苗含氮量測(cè)定

對(duì)收集到的黃芪幼苗，洗凈后置于烤箱內(nèi)烘干，測(cè)定其含氮量，結(jié)果見表4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用固氮新菌株t16和t21的發(fā)酵液處理后，培養(yǎng)30d后黃芪苗含氮量極顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步說明了t16和t21都具有顯著的固氮活性。其中t16對(duì)每株黃芪苗的固氮量平均為8.16～10.70mg左右，而t21對(duì)每株黃芪苗的固氮量為平均7.5～10.7mg左右。根據(jù)實(shí)際種植情況，每畝地種植15 000株幼苗，每公頃的固氮量為0.01×15 000×15≈2 250g，即2種菌劑在30d的固氮值均約為2.25kg·hm-2左右。折算為在黃芪栽培地里，每公頃每個(gè)月可以減少尿素用量4.9kg(按照尿素含氮量46%計(jì)算)。而本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是根據(jù)黃芪幼苗而得的，隨著黃芪根莖的延長(zhǎng)，根瘤數(shù)量也會(huì)更多，固氮量還會(huì)增加。

3討論與結(jié)論

黃芪作為一種藥用的豆科植物，在自然狀態(tài)下根際也會(huì)存在固氮菌，但是相對(duì)于龐大的根際微生物系統(tǒng)來說，固氮菌的種群數(shù)量相對(duì)較少，與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)力有限，固氮量很小。因此，將來源于黃芪根際的高效固氮菌株進(jìn)行分離后擴(kuò)大培養(yǎng)，再以微生物菌肥的形式施入根際，能夠提高黃芪根際固氮菌種群數(shù)量，增強(qiáng)種群競(jìng)爭(zhēng)力，增加生物固氮總量。該研究所獲得的固氮菌株來源于黃芪道地產(chǎn)區(qū)的根際土壤，其生長(zhǎng)速度快，固氮能力強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)室條件下，針對(duì)黃芪幼苗，施用30d的固氮量折合每公頃就達(dá)到了2.25kg?？紤]到該研究從黃芪種子播種到檢測(cè)總N含量的時(shí)間間隔只有30d，這期間黃芪幼苗根系還不發(fā)達(dá)，固氮菌發(fā)揮的效率還很低，可以推測(cè)隨著黃芪根系完善后，固氮量應(yīng)該還會(huì)有很大的提高。因此，該研究分離到的2種菌株都具有較強(qiáng)的推廣價(jià)值。關(guān)于這些菌株在黃芪生長(zhǎng)過程中的最佳使用時(shí)間和劑量、施用方式、實(shí)際促生效能和生態(tài)安全性等方面還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]BurrisRH.Biologicalnitrogenfixation[J].PlantPhysiology, 1974,54(4): 443-449.

[2]喬有明,王振群,段中華.青海湖北岸土地利用方式對(duì)土壤碳氮含量的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(6): 105-112.

[3]SprentJI,RParsons.Nitrogenfixationinlegumeandnon-legumetrees[J].FieldCropsResearch, 2000, 65(2-3): 183-196.

[4]BaldaniJ,LeonardoC,BaldaniVLD,etal.RecentadvancesinBNFwithnon-legumeplants[J].SoilBiologyandBiochemistry, 1997,29(5-6): 911-922.

[5]D?bereinerJ. Azotobacter paspalisp.n.,umabacteriafixadoradenitrogênionarizosgeradePaspalum[J].PesquidaAgropecuariaBrasileira, 1966,1: 357-365.

[6]陳阿琴,楊志剛,俞頌東,等.黃芪多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志, 2005,39(9): 33-36.

[7]SenM,SPSen,InterspecifictransformationinAzotobacter[J].JournalofGeneralMicrobiology, 1965，41(1): 1-6.

[8]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京: 科學(xué)出版社,2001：353-398.

[9]郭立忠,畢建水,祝丕業(yè).微生物菌肥中三類菌株的分離、純化與部分性質(zhì)鑒定[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 19(4): 248-250.

[10]潘明洪,凌瑤,景文,等. 四川白三葉根瘤菌遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào), 2014,23(5): 143-152.

[11]譚志遠(yuǎn),牛天貴,陳文新.天山根瘤菌(R. tianshanense)模式菌株16SrDNA全序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育[J].高技術(shù)通訊, 1997(1): 5-8.

[12]王紹華,劉勝環(huán),王勝?gòu)?qiáng),等. 水稻產(chǎn)量形成與葉片含氮量及葉色的關(guān)系[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002, 25(4): 1-5.

(編輯：武英耀)

Isolationandapplicationofnitrogen-fixingbacteriainrhizosphereofAstragalus membranaceusBungeinShanxi

XueZhiquan1,TangZhongwei1,LiHao1,ZhouRan2,LiangJianping1*

(1．College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2．Shanxi University of Traditional Chinese medicine, Taiyuan 030024, China)

Abstract:[Objective]Astragalus membranaceus Bunge (AMB) is an important herb that has been used in traditional Chinese medicine for centuries, and Hunyuan County of Shanxi province is one of the most important planting bases for AMB. Nitrogen fertilizer input for AMB production in China is very high．It is essential to reduce nitrogen fertilizer input and thus cultivation cost while achieving a high yield for sustainable and environmentally friendly AMB production．Research on biological nitrogen fixation has increased significantly because of its potential importance to the economy and the environment．AMB plants can obtain nitrogen from biological nitrogen fixation via diazotrophs. The aim of this work was to screen and identify nitrogen-fixing bacteria from the rhizosphere of AMB cultivated in Hunyuan County, Shanxi province, and to demonstrate their potential for nitrogen fixation with AMB as well as plant growth promotion．[Methods] 120 nitrogen fixing strains were isolated from soil samples using Ashby nitrogen free medium．Two strains of them, t16 and t21, with strong ability of nitrogen fixation were screened out according to the ability of nitrogen fixation, growth speed and other characteristics in further screening with nitrogen fixing medium. To demonstrate their potential for nitrogen fixation with AMB and growth promotion activities，the bacterial liquid of the two isolates were used to soak AMB seeds and inoculate into AMB seedlings for 30 d at 28°C in a growth cabinet．[Results] Based on morphological detection, physiological and biochemical detection and 16S rRNA gene sequence analysis, the two strains of t16 and t21 were identified as Rhizobium sp. and Sinorhizobium sp., respectively. Both of the two strains significantly promoted the growth of AMB seedlings. They also increased the nitrogen contents of dry weight by 14.23% to 18.67% and 13.10% to 18.77%, respectively, compared with the uninoculated controls. The bacterial liquids of T16 with 106 mL-1and T21 with 108 mL-1have the best effect. The conversion amount of nitrogen fixing in 30 days is about 2.25 kilograms per hectare. [Conclusion] These promising nitrogen fixation bacteria isolates from the rhizosphere of AMB showed potential to promote AMB production via nitrogen fixation and other plant growth promoting functions．This will improve AMB production efficiency and reduce the environmental pollution that results from AMB production．

Key words:Nitrogen-fixing bacteria； Astragalus membranaceus； Rhizosphere; Isolation； Identification

收稿日期：2016-04-07 修回日期：2016-04-18

作者簡(jiǎn)介：薛智權(quán)(1976-)，男(漢)，四川儀隴人，講師，博士后，研究方向：環(huán)境微生物 *通訊作者：梁建萍，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel: 18503547979; E-mail: liangjp@sxau.edu.cn

基金項(xiàng)目：科技部“十二五”國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20110313002-2)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20110313002-2)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士項(xiàng)目(XB2008022)

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)07-0483-06