沈 劍， 史玉倉(cāng)， 吳志賢， 莫自增， 申福定， 梁 杰

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腺病毒介導(dǎo)IL-24基因?qū)︸：鄹泶癖磉_(dá)PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的影響

沈 劍， 史玉倉(cāng)， 吳志賢， 莫自增， 申福定， 梁 杰

目的 探討腺病毒介導(dǎo)白細(xì)胞介素-24基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞中纖溶酶原激活物抑制劑-1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建白細(xì)胞介素-24腺病毒載體，感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，并設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)纖溶酶原激活物抑制劑-1及Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白mRNA表達(dá)的變化，Western Blot檢測(cè)纖溶酶原激活物抑制劑-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平表達(dá)的變化。結(jié)果 白細(xì)胞介素-24腺病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組相比，感染組纖溶酶原激活物抑制劑-1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 白細(xì)胞介素-24腺病毒載體可能通過(guò)調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物抑制劑-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)，減少瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。

白細(xì)胞介素-24基因； 瘢痕疙瘩； 纖溶酶原激活物抑制劑-1； Ⅰ型膠原蛋白； Ⅲ型膠原蛋白

白細(xì)胞介素24(interleukin-24, IL-24)基因是定位于1號(hào)染色體的1q32.2-1q41位點(diǎn)的一個(gè)單拷貝基因，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，由7025個(gè)pb組成[1]，能選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞的生物活性，且不影響正常細(xì)胞[2]。Liang等[3]發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，IL-24在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)。提示IL-24可能參與了瘢痕疙瘩的形成，并通過(guò)IL-24腺病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示IL-24腺病毒載體能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但I(xiàn)L-24基因能否抑制細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積尚不清楚。自2014年1月至2015年9月，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科采用體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts, KF)，并用已構(gòu)建好的IL-24腺病毒載體感染目的細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達(dá)的變化。

1 標(biāo)本來(lái)源

瘢痕疙瘩標(biāo)本取自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診及住院手術(shù)患者15例。男性6例，女性9例；年齡15～39歲。所有患者均排除了其他器質(zhì)性疾病，在手術(shù)切除前未接受其他任何治療。經(jīng)臨床及病理診斷后，均獲患者知情同意。

2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM低糖培養(yǎng)基、10g/L牛血清白蛋白BSA、胰酶、雙抗(鏈霉素-青霉素)、TRIZOL (美國(guó)GIBCO公司)； Real-time PCR 試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)PROMEGA公司)；潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)；BCA試劑盒(上海碧云天公司)，PAI-1、COL Ⅰ、COL Ⅲ抗體(英國(guó)ABCAM公司)；含重組IL-24腺病毒載體的293A細(xì)胞由本課題組前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建保存。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 重組腺病毒載體的純化及病毒滴度測(cè)定 取凍存的含重組腺病毒載體(Ad-IL-24)的293A細(xì)胞復(fù)蘇，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。采用氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行純化。將生長(zhǎng)良好的293A細(xì)胞，經(jīng)0.5%胰酶消化后于顯微鏡下計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞終濃度為1×104/ml，按100 μl/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h。采用逐孔稀釋法測(cè)定腺病毒滴度。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 將切取的瘢痕疙瘩標(biāo)本剪去表皮和皮下組織，切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm～1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的組織塊，在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml 的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2，飽和濕度下，以組織貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)。選擇3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為3組。AD-IL-24組(感染AD- IL-24-GFP腺病毒的細(xì)胞)，KF-NC組(陰性對(duì)照組即感染AD-GFP腺病毒的細(xì)胞)，KF-CON組(空白對(duì)照組即未感染腺病毒的細(xì)胞)。

3.3 腺病毒轉(zhuǎn)染及效率的測(cè)定 將100 μl含病毒液的無(wú)血清培養(yǎng)液加入KF中，腺病毒以感染復(fù)數(shù)為10感染KF，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，置于含15%胎牛血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀計(jì)算感染效率。

3.4 引物設(shè)計(jì)與合成 檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)出PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白基因以及內(nèi)參β-actin基因的上下游引物序列(表1)，由上海生工合成。3.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá) 棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，每孔加入200 μl Trizol,按照常規(guī)方法用氯仿和異丙醇提取KF的總RNA,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)。采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較基因的表達(dá)差異。設(shè)定空白對(duì)照組目的基因mRNA的表達(dá)量為1。

△Ct值=目的基因組Ct值-β-actin組Ct值

△△Ct值=實(shí)驗(yàn)組△Ct值-對(duì)照組△Ct值

表1 PCR的引物序列和產(chǎn)物的預(yù)期長(zhǎng)度

3.6 Western Blot檢測(cè)PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá) 抽提KF總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶TBST溶液封閉，分別按推薦稀釋比例加入相應(yīng)的一抗，4℃搖床上過(guò)夜，次日洗膜3次，再分別加入相應(yīng)的二抗，ECL法顯色后化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影，并保存圖像。

3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用q檢驗(yàn)及方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

4 結(jié)果

4.1 瘢痕疙瘩組織標(biāo)本病理學(xué)診斷 對(duì)標(biāo)本行病理切片檢測(cè)，結(jié)果顯示，鏡下均見(jiàn)粗大稠密的膠原纖維和大量包裹在一起的未成熟原纖維(圖1)。

4.2 腺病毒載體滴度測(cè)定 含Ad-IL-24的293A細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后，可在熒光顯微鏡下觀察到已表達(dá)的綠色熒光蛋白(圖2)，采用氯化銫密度梯度離心法純化，繼續(xù)培養(yǎng)，以GFP陽(yáng)性計(jì)數(shù)法測(cè)得重組腺病毒Ad-IL-24滴度為102pfu/ml。

4.3 重組腺病毒的感染效率 腺病毒以感染復(fù)數(shù)為10感染KF細(xì)胞96 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的比例，結(jié)果IL-24腺病毒載體感染KF達(dá)到80%以上，符合基因治療對(duì)載體的要求。

4.4 PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá) 腺病毒以感染復(fù)數(shù)為10感染KF 96 h后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)情況，β-actin為內(nèi)參。KF-IL-24組細(xì)胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)量明顯下降，與KF-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；KF-NC組與KF-CON組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

4.5PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白蛋白水平表達(dá) 腺病毒以感染復(fù)數(shù)為10感染KF96h后，Westernblot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的蛋白水平表達(dá)情況，β-actin為內(nèi)參。KF-IL-24組細(xì)胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白蛋白表達(dá)量較KF-NC組明顯下降(P<0.05)，KF-NC組與KF-CON組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4。

5 討論

病理性癱痕分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩是組織創(chuàng)傷后的異常修復(fù)[4]，組織學(xué)上表現(xiàn)為以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞增殖、活性增強(qiáng)，以及以Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，真皮組織過(guò)度增生[5]。Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白主要由成纖維細(xì)胞合成，是細(xì)胞外基質(zhì)中最活躍的成分之一，是瘢痕形成的關(guān)鍵因素。范東良等[6]發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿作用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞時(shí)，能夠明顯抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白水平的表達(dá)，從而抑制瘢痕疙瘩生長(zhǎng)。Lin等[7]研究表明，Ⅰ型膠原蛋白在瘢痕疙瘩的表達(dá)量明顯高于正常皮膚，并隨著瘢痕疙瘩的生長(zhǎng)不斷增加，Ⅲ型膠原蛋白在瘢痕疙瘩生長(zhǎng)初期的表達(dá)量明顯增高，而在后期有所下降，主要分布在組織外周及靠近基底部。因此，在瘢痕疙瘩組織中粗大僵硬的Ⅰ型膠原比例增加，Ⅲ型膠原纖維(網(wǎng)狀纖維)的相對(duì)減少和分布的改變，使皮膚的正常結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，因而瘢痕疙瘩既保存了增生性瘢痕的性質(zhì)又有其獨(dú)特的性質(zhì)，即侵襲性及復(fù)發(fā)性。提示改變瘢痕疙瘩中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量和比例，有可能達(dá)到治療目的。

圖1 瘢痕疙瘩組織病理切片(HE染色) a.×10 b.×400 圖2 復(fù)蘇24 h后表達(dá)綠色熒光蛋白的293A細(xì)胞(×40) 圖3 IL-24腺病毒載體對(duì)KF細(xì)胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響(注：*表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05) 圖4IL-24腺病毒載體對(duì)KF細(xì)胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

Fig 1 Pathological slices of keloid tissue (HE). a.×10. b.×400. Fig 2 Expression of 293A cells with green fluorescent protein at 24 h after recovery (×40). Fig 3 Effect of IL-24 cells adenovirus vector on expression of PAI-1 and type I and Ⅲ collagen mRNA.Fig 4 Effect of IL-24 cells adenovirus vector on expression of PAI-1 and type I and Ⅲ collagen protein.

纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1， PAl-1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，是最主要的纖溶酶源激活物抑制劑。研究表明，PAI-1在多種組織的纖維化過(guò)程中起著主要作用[8]，在培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞內(nèi)，其主要通過(guò)滅活尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)及組織型纖溶酶原激活物(tPA)，促進(jìn)ECM沉積而參與瘢痕疙瘩的形成。通過(guò)沉默技術(shù)降低PAl-1在瘢痕疙瘩細(xì)胞中表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖及瘢痕疙瘩組織生長(zhǎng)[9]。

IL-24基因在腫瘤基因治療方面的研究比較多，具有廣泛的抗腫瘤作用。研究表明,通過(guò)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤[10-11]、黑色素瘤[12]等多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)IL-24水平均可以起到抗腫瘤作用。其作用主要是通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)的[13]。我們前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)IL-24病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn),IL-24可抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡[14]。但其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的作用尚不清楚，因此,我們用IL-24腺病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，探討IL-24腺病毒載體對(duì)PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot結(jié)果顯示,IL-24腺病毒載體可抑制PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA和蛋白水平的表達(dá)，PAI-1基因的抑制，可使uPA及tPA活性增強(qiáng)，從而避免ECM過(guò)度沉積。Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)均受到抑制，但Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)抑制更加明顯，與邢幫榮等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相似之處，表明IL-24可以抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的產(chǎn)生，改善Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比例失衡，從而抑制瘢痕疙瘩的生長(zhǎng)發(fā)展。瘢痕疙瘩的形成過(guò)程中,不但細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，而且還受到缺氧環(huán)境等復(fù)雜微環(huán)境的影響，因此，其與缺氧環(huán)境及其他細(xì)胞因子之間的相互作用還待進(jìn)一步研究闡明。

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Effects of adenovirus mediated interleukin-24 gene on the expression of PAI-1, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen of keloids

SHENJian,SHIYu-cang,WUZhi-xian,MOZi-zeng,SHENFu-ding,LIANGJie.

(DepartmentofPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

LIANGJie,Email:liangjieplastic@163.com

Objective To investigate the effect of IL-24 gene on expression on mRNA and protein level of Plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1), type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen of human keloid fibroblasts (KFs). Methods Interleukin 24 (IL-24) gene was cloned into adenovirus vector, then the adenovirus particles expressing IL-24 were infected into keloid fibroblasts (KF cells), KF-IL-24; KF-NC and KF-CON were used as the control groups. Real time PCR and Western blot were performed to examine the expression of IL-24 in adenovirus infected cells. Results Compared with KF-CON group and KF-NC group, the expression levels of IL-24 mRNA and protein were both significantly upregulated in KF-IL-24 group after KF cells were infected (P>0.05).ThedifferencebetweentheKF-CONgroupandKF-NCgroupwasnotstatisticallysignificant(P>0.05). Conclusion Adenovirus-mediated IL-24 gene may inhibit deposition of extracellular matrix of KF through controlling the expressions of PAI-1, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen mRNA and protein.

Interleukin-24 gene; Keloid; Plasminogen activator inhibitor-1; Type Ⅰ collagen; Type Ⅲ collagen

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800063) 作者單位：524001 廣東 湛江，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 整形外科 第一作者：沈 劍(1989-)，男，河南信陽(yáng)人，碩士研究生. 通信作者：梁 杰，524001，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 整形外科，電子信箱：liangjieplastic@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.03.019

R

A

1673-7040(2016)03-0177-04

2016-01-10)