張尚雄，尼瑪平措，徐雅梅，苗彥軍，包賽很那，張衛(wèi)紅

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000； 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000)

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3個(gè)披堿草屬牧草對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及苗期抗寒性評(píng)價(jià)

張尚雄1，尼瑪平措2，徐雅梅1，苗彥軍1，包賽很那1，張衛(wèi)紅1

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000； 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000)

摘要：探討低溫脅迫下西藏野生披堿草(Elymus)苗期抗寒性及其生理變化，可為優(yōu)良牧草選育提供理論依據(jù)。以披堿草屬3個(gè)牧草為試驗(yàn)材料，出苗21 d后在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行低溫脅迫，設(shè)18、10、5和0 ℃共4個(gè)低溫處理，其中以18 ℃為對(duì)照。結(jié)果表明，隨著低溫脅迫的加劇，相對(duì)膜透性，同德老芒麥(E. sibiricus cv. Tong De)的增幅最大，巴青垂穗披堿草(E. nutans)增幅最小。葉綠素含量，巴青垂穗披堿草先升高后降低，同德老芒麥與那曲垂穗披堿草顯著升高(P<0.05)。巴青垂穗披堿草可溶性蛋白(SP)含量增加幅度最小，為對(duì)照的2.59倍；同德老芒麥與那曲垂穗披堿草SP含量顯著上升(P<0.05)，均為對(duì)照的5.31倍。巴青垂穗披堿草與同德老芒麥的可溶性糖(SS)含量先升高后降低，而那曲垂穗披堿草SS含量顯著增大(P<0.05)，為對(duì)照的2.14倍。同德老芒麥的丙二醛(MDA)含量增幅最大，巴青垂穗披堿草MDA含量0 ℃較5 ℃時(shí)顯著降低(P<0.05)。3種供試材料游離脯氨酸(Pro)含量均升高，同德老芒麥增幅最大，為對(duì)照的2.58倍；巴青垂穗披堿草最小，為對(duì)照的1.44倍。巴青垂穗披堿草超氧化物歧化酶(SOD)活性先增強(qiáng)后減弱，那曲垂穗披堿草SOD活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，為對(duì)照的1.65倍。那曲垂穗披堿草過(guò)氧化物酶(POD)活性上升幅度最大，為對(duì)照的4.13倍；同德老芒麥最小，為對(duì)照的2.91倍。隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)表明，3種野生披堿草的抗寒性依次為巴青縣野生垂穗披堿草>同德老芒麥>那曲縣野生垂穗披堿草。

關(guān)鍵詞：披堿草；低溫脅迫；生理特性；抗寒性評(píng)價(jià)；西藏

西藏是青藏高原的主要組成部分，平均海拔4 000 m以上，氣溫年較差小，日較差大，夏季氣溫不高，冬季干燥少雨，具有獨(dú)特的高原氣候[1]。溫度是西藏植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因子之一，其影響范圍包括植物的新陳代謝、酶促反應(yīng)、休眠等[2]。西藏植物往往會(huì)遭受極端氣溫從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。目前低溫是制約西藏披堿草(Elymusspp.)生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵因素。因此，如何提高披堿草的抗寒性，最大限度地提高披堿草的經(jīng)濟(jì)價(jià)值成為西藏草產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的一大難題。

披堿草屬植物在西藏分布極廣，甚至在5 200 m以上的喜馬拉雅山區(qū)也有生長(zhǎng)[3]。西藏披堿草屬牧草種類極為豐富，但原始生境不同的披堿草，其抗寒性能也有差異。西藏當(dāng)雄縣野生垂穗披堿草(E.nutans)和甘南垂穗披堿草在低溫脅迫下，兩種垂穗披堿草的細(xì)胞膜受損傷程度與抗氧化酶活性負(fù)相關(guān)，當(dāng)雄縣野生垂穗披堿草的抗寒能力較強(qiáng)，由于其抗氧化酶活性在冷脅迫時(shí)顯著增強(qiáng)，減輕了細(xì)胞膜系統(tǒng)受損傷的程度[4]。早熟禾(Poa)在低溫脅迫下，可溶性蛋白、可溶性糖、抗氧化酶活性、海拔與其耐寒能力正相關(guān)[5]。因?yàn)橹参矬w內(nèi)膜的透性、可溶性物質(zhì)、丙二醛、葉綠素以及抗氧化酶等指標(biāo)是評(píng)價(jià)植物抗寒性強(qiáng)弱的優(yōu)良指標(biāo)，所以在前人的研究基礎(chǔ)上，本研究以同德老芒麥(E.sibiricus)、巴青縣披堿草、那曲縣披堿草為材料，其中以同德老芒麥為對(duì)照，通過(guò)低溫脅迫觀察材料的相對(duì)電導(dǎo)率，葉綠素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及抗氧化酶的活性等生理指標(biāo)，來(lái)比較評(píng)價(jià)西藏當(dāng)?shù)匾吧麎A草的抗寒性能。本研究對(duì)西藏本地采集的野生披堿草進(jìn)行抗寒性強(qiáng)弱的相關(guān)性分析，指出西藏本地野生披堿草的抗寒性強(qiáng)弱，旨為西藏披堿草抗寒種質(zhì)篩選和抗寒新品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

同德老芒麥由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草原所提供，其它兩份材料分別采集于西藏的巴青縣和那曲縣(表1)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)低溫處理設(shè)有3個(gè)處理水平(10、5、0 ℃)，并以室溫18 ℃為對(duì)照(CK)。試驗(yàn)采用盆栽供試材料，播種量為15 g·m-2，花盆直徑為20 cm、深15 cm，混合栽培基質(zhì)為農(nóng)田土∶羊糞=9∶1(質(zhì)量比)，花盆內(nèi)裝等量混合栽培基質(zhì)[5]。2014年11月22日將全部盆栽材料置于25 ℃(白天)/18 ℃(晚上)的人工物候箱內(nèi)培養(yǎng)，2014年12月1日全部出苗，經(jīng)過(guò)21 d的培養(yǎng)，2014年12月22日開始進(jìn)行低溫脅迫處理。處理時(shí)對(duì)照組直接放入18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其它處理組先在15 ℃的培養(yǎng)箱中預(yù)冷24 h，然后，每隔2 h降5 ℃，直至試驗(yàn)處理溫度，再持續(xù)低溫脅迫8 h，試驗(yàn)處理結(jié)束后，立刻剪取葉片，將其混勻，根據(jù)試驗(yàn)指標(biāo)中的鮮樣稱重，錫紙包裹，并用液氮迅速冷凍，放入-84 ℃低溫冰箱保存，備用[5]。

1.2.2試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)的測(cè)定以《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》為指導(dǎo)[6]。其中細(xì)胞膜透性測(cè)量方法如下：將去離子水洗凈的材料葉片剪成1cm長(zhǎng)的條段120段，分為6組，對(duì)照與試驗(yàn)組各3個(gè)重復(fù)，相對(duì)電導(dǎo)率=(處理電導(dǎo)率-對(duì)照電導(dǎo)率)/(煮沸電導(dǎo)率-對(duì)照電導(dǎo)率)×100%。可溶性糖測(cè)定時(shí)取樣均在0.10～0.12 g，3次重復(fù)，可溶性糖含量=C×V×n/1 000×a×W，C為標(biāo)準(zhǔn)方程求得糖量(μg)，a為吸取樣品液體積(mL)，V為提取液量(mL)，n為稀釋倍數(shù)，W為組織重量(g)?？扇苄缘鞍诇y(cè)定時(shí)取樣均在0.25～0.30 g，3次重復(fù)，樣品中蛋白質(zhì)含量=C×VT/(VS×WF×1 000)。式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg)，VT為提取液總體積(mL)，VS為測(cè)定時(shí)加樣量(mL)，WF為樣品鮮重(g)。

表1　供試的3個(gè)牧草

注：下文中圖和表中材料名稱均以編號(hào)表示。

Note: The codes of material names will be used in the following figures and tables.

丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定[7]。丙二醛測(cè)定時(shí)取樣均在1.00～1.10 g，3次重復(fù)。

葉綠素、游離脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》測(cè)定[8]。葉綠素測(cè)定時(shí)采樣量均在2.00～2.10 g，3次重復(fù)，CT=20.29A645+8.05A663，葉綠體色素含量=CT×V×n/W。式中：CT為色素的質(zhì)量濃度(mg·L-1)，A645和A663分別為645和663 nm處的吸光度，V為提取液體積(L)，n為稀釋倍數(shù)，W為樣品鮮重(g)。游離脯氨酸測(cè)定時(shí)采樣量均在2.00～2.10 g，3次重復(fù)，脯氨酸含量=c×VT/W×V1。式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸含量，VT為提取液總體積(mL)，W為樣品鮮重(g)，V1為測(cè)定系統(tǒng)中提取液的加入量(mL)。超氧化物歧化酶活性U·(g·min)-1測(cè)定時(shí)取樣量均在0.50～0.51 g，3次重復(fù)，NBT光還原的抑制率=1-(A1-A2)/A1×100%，超氧化物歧化酶=1 000×60×V/B×W×t。式中：A1為對(duì)照杯在560 nm的吸光度，A2為加酶杯在560 nm的吸光度，B為一個(gè)酶活單位的酶液量(μL)，V為酶提取液總量(mL)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)，W為樣品鮮重(g)。過(guò)氧化物酶活性U·(g·min)-1測(cè)定時(shí)采樣量均在1.00～1.10 g，3次重復(fù)，過(guò)氧化物酶活性=ΔA470×V/0.01×W×Vt×t。式中：ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，W為材料鮮重(g)，V為酶提取液總量(mL)，Vt為反應(yīng)系統(tǒng)中加入酶液量(mL)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)。其中，超氧化物歧化酶活性與過(guò)氧化物酶活性的單位中的U表示一個(gè)酶活性單位，即反應(yīng)體系NBT的光化還原率為對(duì)照的50%時(shí)所用的酶液量。

1.3供試材料苗期抗寒性綜合評(píng)價(jià)

1.3.1抗寒性評(píng)價(jià)方法試驗(yàn)材料的抗寒性評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)法[9-10]。供試牧草各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值：

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin).

式中：Xj表示第j個(gè)指標(biāo)值，Xmin表示第j個(gè)指標(biāo)的最小值，Xmax表示第j個(gè)指標(biāo)的最大值，如某一指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，可用反隸屬函數(shù)計(jì)算其抗寒隸屬函數(shù)值[9]。

μ(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin).

標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)Vj：

各指標(biāo)的權(quán)重Wj：

式中：Wj表示第j個(gè)指標(biāo)的權(quán)重[9]。

綜合評(píng)價(jià)值：

式中:D表示各材料抗寒性綜合評(píng)價(jià)值，D值越大表明抗寒性越強(qiáng)[9]。

1.3.2抗寒性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)植物綜合抗寒性D值可以分為3級(jí)，Ⅰ級(jí)：D值0.7以上，為抗寒性強(qiáng)；Ⅱ級(jí)：D值在0.5～0.7，抗寒性中等； Ⅲ級(jí)：D值在0.5以下，抗寒性較弱[5,9]。

1.4數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0，采用DUNCAN法多重比較；Excel 2013制作圖表。

2結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫對(duì)披堿草葉片膜透性的影響

3種供試牧草隨低溫脅迫加劇，相對(duì)膜透性整體呈增加的趨勢(shì)，但變化規(guī)律不盡相同(圖1)。10 ℃時(shí)，所有供試牧草的相對(duì)膜透性顯著增大，顯著高于對(duì)照(P<0.05)。其中TD相對(duì)膜透性上升最快，約為對(duì)照的5.71倍。BQ相對(duì)膜透性上升最慢，約為對(duì)照的2.37倍。溫度降至5 ℃時(shí)，所有供試材料的相對(duì)膜透性仍與對(duì)照差異顯著，其中TD與NQ的相對(duì)膜透性較10 ℃處理有所減小，而BQ的相對(duì)膜透性顯著升高，是對(duì)照的8.18倍。溫度降至0 ℃時(shí)，TD與那NQ的相對(duì)膜透性較5 ℃時(shí)顯著升高(P<0.05)，并且TD相對(duì)膜透性高于10 ℃處理組，達(dá)到所有處理水平的最大值，約為對(duì)照的7.52倍，受到的傷害也最大。BQ相對(duì)膜透性與10 ℃的處理比較顯著減小，受到的傷害也最小。

十一點(diǎn)鐘的時(shí)候，敦禮已經(jīng)坐在他上次坐的那個(gè)位子了。他記得她當(dāng)時(shí)對(duì)服務(wù)生說(shuō)的是老位子。他也要把這個(gè)位子變成屬于自己的老位子嗎？很快，他又覺得自己這個(gè)想法很荒謬，很可笑。點(diǎn)了一杯藍(lán)山后，他就閉上眼睛靠在沙發(fā)靠背上。

圖1　3種供試牧草葉片相對(duì)膜透性的變化

注：不同小寫字母同一供試材料不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lower case letters for the same germplasm indicate significant difference among different temperatures at 0.05 level. The same below.

2.2低溫脅迫對(duì)披堿草葉綠素含量的影響

供試材料葉綠素的含量隨低溫脅迫加劇，葉綠素含量均呈上升趨勢(shì)(圖2)。10 ℃處理下，除BQ葉綠素含量與對(duì)照顯著差異外(P<0.05)，其它供試牧草的葉綠素含量與對(duì)照差異均不顯著(P>0.05)。5 ℃處理下，各供試材料葉綠素含量與對(duì)照顯著差異。其中NQ葉綠素含量上升最快，為對(duì)照的1.86倍;TD葉綠素含量上升的最慢，為對(duì)照的1.46倍。0 ℃處理下，各供試材料葉綠素含量與對(duì)照顯著差異(P<0.05),其中BQ葉綠素含量低于5和10 ℃時(shí)的含量，但顯著低于5 ℃處理下的葉綠素含量，與10 ℃下的葉綠素含量差異不顯著(P>0.05)。NQ葉綠素含量上升最快，為對(duì)照的2.13倍，BQ葉綠素含量上升最慢，為對(duì)照的1.32倍。

圖2　3種供試牧草葉片葉綠素含量的變化

2.3低溫脅迫對(duì)披堿草葉片可溶性蛋白(SP)含量的影響

各供試材料隨低溫脅迫的加劇，可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢(shì)(圖3)。10 ℃處理下，除NQ以外，其余供試材料SP含量與對(duì)照顯著差異(P<0.05)。5℃處理下，所有供試材料可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)；其中NQ的SP含量上升最快，為對(duì)照的2.59倍。0 ℃處理下，NQ的SP含量增加最多，為對(duì)照的5.31倍；BQ的SP含量增加最少，是對(duì)照的1.68倍。

圖3　3種供試牧草葉片可溶性蛋白(SP)含量的變化

2.4低溫脅迫對(duì)披堿草葉片可溶性糖(SS)含量的影響

3個(gè)材料隨低溫脅迫加劇，SS含量均呈升高趨勢(shì)(圖4)。10 ℃處理下，3個(gè)材料SS含量與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，其中BQ的SS含量上升最快，是對(duì)照的1.24倍，TD的SS含量上升最慢，是對(duì)照的1.04倍。5 ℃處理下，所有供試材料SS含量顯著高于對(duì)照，TD上升幅度最大，為73.40%，BQ上升幅度最小，為53.5%。0 ℃處理下，除NQ的SS含量顯著增加以外，其余材料SS含量較5 ℃處理有所下降，但3種供試材料SS含量均與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，其中NQ的SS含量達(dá)到最高，為對(duì)照的2.14倍。

圖4　3種供試牧草葉片可溶性糖(SS)含量的變化

2.5低溫脅迫對(duì)披堿草葉片丙二醛(MDA)含量的影響

3個(gè)供試材料隨著溫度降低，MDA含量均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，但變化規(guī)律不一(圖5)。10 ℃處理下，所有供試材料MDA顯著升高，其中TD的MDA含量上升最快，并且達(dá)到3個(gè)處理水平的最大值，是對(duì)照的2.14倍；NQ的MDA上升最慢，為對(duì)照的1.11倍。5 ℃處理下，TD的MDA含量較10 ℃時(shí)下降，而BQ與NQ的MDA含量都顯著升高，并且達(dá)到3個(gè)處理水平的最高值，BQ的MDA含量為19.75 μmol·g-1，是對(duì)照的1.81倍；NQ的MDA含量為20.63 μmol·g-1，是對(duì)照的1.58倍。0 ℃處理下，TD的MDA含量較5 ℃時(shí)有所回升，達(dá)到對(duì)照的1.65倍;其余材料MDA含量反而較5 ℃時(shí)降低，尤其是BQ，其MDA含量降低幅度較大，為19.74%。

圖5　3種供試牧草葉片丙二醛(MDA)含量的變化

2.6低溫脅迫對(duì)披堿草葉片游離脯氨酸(Pro)含量的影響

3個(gè)材料隨溫度的降低，Pro含量逐漸升高(圖6)。10 ℃處理下，所有供試材料Pro含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，18 ℃到10 ℃所有供試材料Pro含量增長(zhǎng)緩慢，增幅在2.29%～23.12%，平均增幅為11.29%。當(dāng)溫度降至5 ℃，所有材料Pro含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，10 ℃到5 ℃之間供試材料Pro含量增長(zhǎng)迅速，其中TD的Pro含量增幅最大，為102.77%，其余材料增幅均低于50%，平均增幅為55.36%。溫度降至0 ℃，3個(gè)材料Pro含量繼續(xù)上升，但增加幅度較小，其中TD的Pro含量增幅最大，為17.28%，達(dá)到對(duì)照的2.58倍；BQ的Pro含量增幅最小，為1.28%，達(dá)到對(duì)照的1.44倍。

圖6　3種供試牧草葉片游離脯氨酸(Pro)含量的變化

2.7低溫脅迫對(duì)披堿草葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

供試牧草葉片的超氧化物歧化酶活性隨溫度的降低呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，但是整體呈上升的趨勢(shì)(圖7)。10 ℃時(shí)，所有供試材料SOD活性較對(duì)照顯著增強(qiáng)(P<0.05)。溫度下降到5 ℃時(shí)，TD的SOD活性相對(duì)10 ℃有所減弱，且差異不顯著(P>0.05)；BQ的SOD活性明顯增強(qiáng)，并達(dá)到所有處理水平的最大值，為271.47 U·(g·min)-1；NQ的SOD活性較10 ℃顯著降低(P<0.05)。溫度降低到0 ℃時(shí)，除BQ的SOD活性減弱外，其余材料的SOD活性顯著增強(qiáng)，其中NQ的SOD活性增強(qiáng)最快，達(dá)對(duì)照的1.65倍。

圖7　3種供試牧草葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

2.8低溫脅迫對(duì)披堿草葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響

3個(gè)材料葉片的POD活性隨溫度的降低而逐漸增強(qiáng)(圖8)。10 ℃處理下，各供試材料POD活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)，TD的POD活性增幅最大，為97.2%。溫度降至5 ℃，TD的POD活性達(dá)到對(duì)照組的2.31倍；BQ的POD活性較10 ℃差異不顯著(P>0.05)，增幅為1.6%；NQ的POD活性較10 ℃時(shí)顯著升高，增幅為151.91%。溫度降至0 ℃，BQ的POD活性較10 ℃顯著增大，增幅為204.15%，是對(duì)照的3.18倍，TD與NQ的POD活性分別是對(duì)照的2.91、4.13倍。

圖8　3種供試牧草葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性的變化

2.93個(gè)披堿草屬牧草苗期抗寒性綜合評(píng)價(jià)

植物的抗寒性不能用單一指標(biāo)來(lái)判定，本研究中5 ℃時(shí)3種供試牧草受冷害較小并且各指標(biāo)變異系數(shù)較大，故采用5 ℃時(shí)3種牧草的各項(xiàng)指標(biāo)作為其苗期抗寒能力綜合評(píng)價(jià)的實(shí)測(cè)值，并通過(guò)權(quán)重值衡量比較。結(jié)果表明：BQ抗寒綜合評(píng)價(jià)值最大，為0.71，抗寒性最強(qiáng)；TD抗寒綜合評(píng)價(jià)值為0.52，抗寒性中等；NQ抗寒綜合評(píng)價(jià)值為0.48，抗寒性弱(表2)。

2.103個(gè)材料各生理指標(biāo)與苗期抗寒相關(guān)性分析

將5 ℃時(shí)3種供試牧草各指標(biāo)的相對(duì)值與綜合評(píng)價(jià)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示(表3)， 3種供試牧草在低溫脅迫下可溶性蛋白含量的相對(duì)值與綜合評(píng)價(jià)值顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為-1.00。相對(duì)膜透性、丙二醛、超氧化物歧化酶、可溶性糖、游離脯氨酸、過(guò)氧化物酶的相對(duì)值與抗寒綜合評(píng)價(jià)值差異不顯著(P>0.05)。本研究還對(duì)葉綠素含量相對(duì)值與抗寒綜合評(píng)價(jià)值間進(jìn)行了相關(guān)性分析，葉綠素含量相對(duì)值與抗寒綜合評(píng)價(jià)值間呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)。

表2　3個(gè)供試牧草苗期葉片抗寒性各指標(biāo)隸屬函數(shù)值、權(quán)重及評(píng)價(jià)值

表3　3個(gè)供試披堿草各生理指標(biāo)與苗期抗寒相關(guān)性分析結(jié)果

3討論

3.1質(zhì)膜透性與披堿草抗寒性的關(guān)系

植物耐寒性的強(qiáng)弱與質(zhì)膜透性的變化息息相關(guān)。有研究表明，質(zhì)膜透性與細(xì)胞受損程度呈正比，植物質(zhì)膜透性越強(qiáng)，其細(xì)胞與組織就越容易受到損害，故而其抗逆性就越差[11]。本研究表明，3個(gè)供試牧草葉片的相對(duì)膜透性隨溫度的降低呈先增大后減小的趨勢(shì)，其中同德老芒麥相對(duì)膜透性最大，受到的傷害也最大；巴青垂穗披堿草在5 ℃時(shí)，相對(duì)膜透性顯著升高，但溫度降到0 ℃時(shí)，相對(duì)膜透性顯著減小，降幅遠(yuǎn)大于其余兩種材料，表明巴青垂穗披堿草有很強(qiáng)的抗寒調(diào)節(jié)能力；那曲垂穗披堿草相對(duì)膜透性0 ℃較5 ℃時(shí)顯著升高，但幅度比同德老芒麥小。僅從相對(duì)膜透性這一指標(biāo)來(lái)看，巴青垂穗披堿草的抗寒性最強(qiáng)，西藏當(dāng)?shù)仄贩N巴青垂穗披堿草和那曲垂穗披堿草的抗寒性要強(qiáng)于青海同德老芒麥。

3.2可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸與3種牧草抗寒性的關(guān)系

細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)其抗寒性有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其中可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸對(duì)細(xì)胞的保水能力以及保護(hù)生物膜起關(guān)鍵作用[12]。正常狀態(tài)下，植物體內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量較少，當(dāng)遇到逆境時(shí)游離脯氨酸含量會(huì)急速增加，同時(shí)植物中的淀粉可轉(zhuǎn)化為可溶性糖、可溶性蛋白也相對(duì)增多以抵御冷害，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量積累到一定量的時(shí)候會(huì)維持相對(duì)穩(wěn)定[13-16]。本研究中，隨著低溫脅迫的加劇，那曲垂穗披堿草和同德老芒麥的可溶性糖與可溶性蛋白含量急劇增加，以適應(yīng)寒冷脅迫；巴青垂穗披堿草可溶性糖含量與可溶性蛋白含量也有增加，但增加幅度很小，表明巴青垂穗披堿草自身耐受寒冷脅迫的能力較強(qiáng)。本研究中，3個(gè)材料的葉片游離脯氨酸含量隨溫度的降低而顯著升高，這與呂優(yōu)偉等[5]在低溫脅迫下9個(gè)早熟禾葉片游離脯氨酸含量變化規(guī)律基本一致，其中同德老芒麥的游離脯氨酸含量隨低溫脅迫的加劇急劇升高，巴青垂穗披堿草與那曲垂穗披堿草游離脯氨酸含量也有升高，但升高幅度遠(yuǎn)不如同德老芒麥，表明巴青垂穗披堿草與那曲垂穗披堿草具有較強(qiáng)的抗寒能力，同德老芒麥抗寒能力較弱。僅從這3個(gè)指標(biāo)來(lái)看，3種供試材料的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量隨著寒冷脅迫的加劇而不斷增加，同時(shí)說(shuō)明巴青垂穗披堿草對(duì)寒冷的耐受能力很強(qiáng)。

3.3丙二醛與披堿草抗寒性的關(guān)系

植物體內(nèi)膜脂的過(guò)氧化會(huì)導(dǎo)致冷害，這種冷害最明顯的變化就是MDA的大量積累，所以，MDA成為鑒別植物抗逆性的重要指標(biāo)之一[17-18]。本研究中，3種供試材料的MDA含量隨著低溫脅迫的加劇都有一個(gè)急劇積累的過(guò)程，10 ℃時(shí)，同德老芒麥MDA含量急劇增加，增加幅度遠(yuǎn)大于另外兩種供試材料，說(shuō)明同德老芒麥的抗寒能力相對(duì)較弱，10 ℃的寒冷脅迫足以讓其MDA大量增加以抵御寒冷，同時(shí)也說(shuō)明另外兩種材料的抗寒能力較強(qiáng)。隨著溫度降低到5 ℃時(shí)，同德老芒麥MDA含量顯著降低，表明同德老芒麥的抵御外界寒冷調(diào)節(jié)機(jī)制起了保護(hù)作用，但不能說(shuō)明其抗寒性能強(qiáng)，因?yàn)闇囟冉档? ℃時(shí)MDA含量又顯著升高且葉片受到的傷害程度最大。然而另外兩種材料在0 ℃時(shí)MDA含量顯著降低，并且巴青垂穗披堿草含量降低幅度最大，所以僅從MDA這項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看，寒冷脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)MDA的積累，同時(shí)也說(shuō)明巴青垂穗披堿草抗寒能力最強(qiáng)，同德老芒麥最弱。

3.4超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶與披堿草抗寒性的關(guān)系

植物受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧自由基，而過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶可以清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，進(jìn)而減少逆境對(duì)植物的傷害[19-20]。本研究中，3種供試材料的葉片SOD活性隨低溫脅迫的加劇都出現(xiàn)了急劇增加的過(guò)程，表明供試材料受到寒冷脅迫時(shí)產(chǎn)生了氧自由基以抵御寒冷。從變化規(guī)律來(lái)看，那曲垂穗披堿草活性氧產(chǎn)生的最多，葉片受到的傷害也越大，巴青垂穗披堿草次之，同德老芒麥最小，說(shuō)明那曲垂穗披堿草抵御寒冷的能力較弱，試驗(yàn)給予的溫度迫使其產(chǎn)生大量的氧自由基來(lái)消除體內(nèi)活性氧，進(jìn)而抵御寒冷；同時(shí)也說(shuō)明巴青垂穗披堿草與同德老芒麥對(duì)試驗(yàn)低溫耐受力強(qiáng)，無(wú)需產(chǎn)生大量的氧自由基來(lái)抵御寒冷。 3種供試材料葉片POD活性隨著低溫脅迫的加劇而急劇增加，處理溫度在10和5 ℃時(shí)，巴青垂穗披堿草POD活性變化不大，而且受傷害程度最?。煌吕厦Ⅺ溑c那曲垂穗披堿草POD活性顯著增加，其中那曲垂穗披堿草POD活性增加幅度最大，受傷害程度也最大。當(dāng)溫度繼續(xù)降低到0 ℃時(shí)，巴青垂穗披堿草POD活性急劇增加，為對(duì)照的3.18倍，但受傷害程度較小，而那曲垂穗披堿草POD活性達(dá)到對(duì)照的4.13倍，受傷害程度最大。僅從這兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看，植物受到寒冷脅迫時(shí)過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)說(shuō)明巴青垂穗披堿草具有較強(qiáng)的抗寒性，那曲垂穗披堿草的抗寒性在三者中最弱。

3.5葉綠素與披堿草抗寒性的關(guān)系

葉綠素是植物光合作用的主要器官，逆境脅迫下，部分光合機(jī)構(gòu)失活或者遭到破壞，為了適應(yīng)逆境，植物體內(nèi)的葉綠素含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[21]。有研究表明，隨著植物受到的寒冷脅迫加劇，葉綠素含量呈下降趨勢(shì)[22-23]。本研究表明，葉綠素含量隨著低溫脅迫的加劇，各材料葉綠素含量呈上升趨勢(shì)，這與前人研究的結(jié)果相反。本研究中，溫度是逐步降低到目標(biāo)溫度，并且到達(dá)目標(biāo)溫度后，各處理僅有8 h，只是模擬了一個(gè)冷脅迫環(huán)境，而植物在逆境脅迫下葉綠素部分光合機(jī)構(gòu)失活或者遭到破壞需要一個(gè)很長(zhǎng)的過(guò)程，加之前人的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中不是逐步降低溫度，而是直接冷凍，這樣植物失去了一個(gè)適應(yīng)的過(guò)程，可能導(dǎo)致葉綠素不可逆的破壞，故而前人試驗(yàn)中葉綠素含量降低了，而本研究中葉綠素含量反而升高了。僅從本研究可以看出，隨著寒冷脅迫的加劇，葉綠素含量升高了，同時(shí)結(jié)合前人的研究結(jié)果，也能說(shuō)明低溫脅迫的方式不同，植物體內(nèi)的葉綠素含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。所以，葉綠素與抗寒性的關(guān)系還需要進(jìn)一步跟蹤研究。

3.6披堿草抗寒性與衡量指標(biāo)的關(guān)系

植物的抗寒性與多種生理因素有關(guān)，因此不能用單一的指標(biāo)來(lái)衡量[24]。本研究經(jīng)過(guò)綜合分析，不同程度的寒冷脅迫影響了3種披堿草屬牧草的生理特性，巴青垂穗披堿草抗寒性優(yōu)于同德老芒麥和那曲垂穗披堿草。巴青垂穗披堿草抗寒性指標(biāo)主要在相對(duì)膜透性、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛和超氧化物歧化酶活性方面優(yōu)于另外兩種材料，而過(guò)氧化物酶活性衡量指標(biāo)明顯低于同德老芒麥與那曲垂穗披堿草，故而巴青垂穗披堿草在各個(gè)指標(biāo)的相互影響、綜合調(diào)控下具有較強(qiáng)的抗寒性。同德老芒麥過(guò)氧化物酶活性衡量指標(biāo)占主要優(yōu)勢(shì)，可溶性蛋白含量高于其它材料，可溶性糖、超氧化物歧化酶活性衡量指標(biāo)強(qiáng)于那曲垂穗披堿草。那曲垂穗披堿草的相對(duì)膜透性、游離脯氨酸、丙二醛衡量指標(biāo)強(qiáng)于同德老芒麥，但弱于巴青垂穗披堿草。綜合衡量，同德老芒麥的抗寒性大于那曲縣垂穗披堿草，所以僅從本研究的結(jié)果可以反映出：可溶性糖、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性是衡量植物抗寒性強(qiáng)弱的主要因素。因?yàn)榭扇苄蕴?、可溶性蛋白在植物?xì)胞中起滲透調(diào)節(jié)作用，提高細(xì)胞的保水能力；超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶能有效清除植物體內(nèi)積累的氧自由基，從而減輕質(zhì)膜的受傷程度，所以本研究認(rèn)為這4個(gè)指標(biāo)是衡量植物抗寒性強(qiáng)弱的主要因素。

4結(jié)論

低溫影響了3份供試材料的生理特性，經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià)得出巴青縣披堿草抗寒性最強(qiáng)，同德老芒麥次之，那曲縣披堿草抗寒性最弱。

參考文獻(xiàn)References：

[1]徐宗學(xué),孟翠玲,鞏同梁,隋彩虹.西藏自治區(qū)氣溫變化趨勢(shì)分析.自然資源學(xué)報(bào),2009,24(1):162-170.

Xu Z X,Meng C L,Gong T L,Sui C H.Long-term trend analysis for air temperature in the Tibetan region.Journal of Natural Resources，2009,24(1):162-170.(in Chinese)

[2]王代軍,溫洋.溫度脅迫下幾種冷季型草坪草抗性機(jī)制的研究.草業(yè)學(xué)報(bào),1988,7(1):75-80.

Wang D J,Wen Y.Effects of temperature on growth of cold-season turfgrasses.Acta Prataculturae Sinica，1988,7(1):75-80.(in Chinese)

[3]盧寶榮.披堿草屬與大麥屬系統(tǒng)關(guān)系的研究.植物分類學(xué)報(bào),1997,35(3):193-207.

Lu B R.A study on systematic relationships betweenElymusandHordeum(Poaceae).Acta Phytotaxonomica Sinica,1997,35(3):193-207.(in Chinese)

[4]付娟娟,劉建,孫永芳,褚希彤,苗彥軍,呼天明,許岳飛.冷脅迫對(duì)2種垂穗披堿草生長(zhǎng)和生理特性的影響.草地學(xué)報(bào),2014,22(4):789-795.

Fu J J,Liu J,Sun Y F,Chu S T,Miao Y J,Hu T M,Xu Y F.Effects of cold stress on the growths and physiological characteristics of twoElymusnutansvarieties.Acta Agrestia Sinica,2014,22(4):789-795.(in Chinese)

[5]呂優(yōu)偉,賀佳圓,白小明,董沁,雷婭偉.9個(gè)野生早熟禾對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及苗期抗寒性評(píng)價(jià).草地學(xué)報(bào),2014,22(2):326-333.

Lyu Y W,He J Y,Bai X M,Dong Q,Lei Y W.Evaluation of physiological responses and resistances of nine wildPoato low temperature.Acta Agrestia Sinica,2014,22(2):326-333.(in Chinese)

[6]孔祥生,易現(xiàn)峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008:132-250.

Kong X S,Yi X F.Experiment Technology of Plant Physiology.Beijing:China Agriculture Press,2008:132-250.(in Chinese)

[7]中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所,上海市植物生理學(xué)會(huì).現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.北京:科學(xué)出版社1999:305-306.

[8]張立軍.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2012:32-104.

Zhang L J.The Tutorial of Plant Physiology Experiment.Beijing:China Agricultural University Press,2012:32-104.(in Chinese)

[9]王贊,李源,吳欣明,高洪文,孫桂芝.PEG滲透脅迫下鴨茅種子萌發(fā)特性及抗旱性鑒定.中國(guó)草地學(xué)報(bào),2008,30(1):50-54.

Wang Z,Li Y,Wu X M,Gao H W,Sun G Z.Study on germination characteristics and drought-resistance evaluation ofDactylisglomerataL. under osmotic stress.Chinese Journal of Grassland,2008,30(1):50-54.(in Chinese)

[10]賀佳圓.9個(gè)野生早熟禾種質(zhì)材料抗寒性研究.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012.

He J Y.Studies on cold-resistance of nine varieties of wildPoaL.Master Thesis.Lanzhou:Gansu Agricultural University,2012.(in Chinese)

[11]魏臻武,王槐三.2種草坪草抗寒特性及其超氧化物酶的作用.草業(yè)科學(xué),1998,15(2):62-66.

Wei Z W,Wang H S.Cold acclimation and cold hardiness property of various types of turfgrasses.Pratuacultural Science,1998,15(2):62-66.(in Chinese)

[12]Jian L C,Sun L H,Shi G S.Acytochemical study on the glycoprotein satcellular membranes in different cold resistant winter wheat cultivars during cold acclimation.Acta Biologiae Experimentalis Sinica,1991,24(3):249-257.

[13]劉香萍,崔國(guó)文,李國(guó)良,杜廣明.紫花苜蓿主根內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物累積及其與抗寒性的關(guān)系.中國(guó)草地學(xué)報(bào),2010,32(2):113-116.

Liu X P,Cui G W,Li G L,Du G M.Relationships between non-structure carbohydrates accumulation in taproot of alfalfa and coldhardiness.Chinese Journal of Grassland,2010,32(2):113-116.(in Chinese)

[14]陶雅,孫啟忠.不同紫花苜蓿品種可溶性糖、全氮、丙二醛含量動(dòng)態(tài)變化及其與抗寒性關(guān)系研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2008,10(S1):56-60.

Tao Y,Sun Q Z.Dynamic variation of soluble sugar,total nitrogen and malondialdehydein different alfalfa varieties and their effect on alfalfa’s cold resistance.Journal of Agricultural Science and Technology,2008,10(S1):56-60.(in Chinese)

[15]張小英,衛(wèi)智軍,陳立波,劉磊,褚文彬.四個(gè)紫花苜蓿品種對(duì)低溫條件的生理適應(yīng)性.中國(guó)草地學(xué)報(bào),2008,30(3):48-51.

Zhang X Y,Wei Z J,Chen L B,Liu L,Chu W B.The physiological adaptability of four alfalfa cultivars to lower temperature in autumn and winter.Chinese Journal of Grassland,2008,30(3):48-51.(in Chinese)

[16]李軼冰,楊順強(qiáng),任廣鑫,馮永忠,張強(qiáng),李鵬.低溫處理不同禾本科牧草的生理變化及其抗寒性比較.生態(tài)學(xué)報(bào),2009,29(3):1341-1347.

Li Y B,Yang S Q,Ren G X,Feng Y Z,Zhang Q,Li P.Changes analysis in physiological properties of several gramineous grass species and cold-resistance comparison on under cold stress.Acta Ecologica Sinica,2009,29(3):1341-1347.(in Chinese)

[17]Wise R R,Naylar A W.Chilling-enhanced photooxidation：Evidence for the role of singlet oxygen and superoxide in the breakdown of pigments and endogenous antioxidants.Plant Physiology,1987,83(2):278-282.

[18]Pan X Y,Cao Q D,Wang G X.Evaluation of lipid peroxidation for use in selection of cold hardiness cultivars of almond.Acta Ecologica Sinica,2002,22(11):1902-1911.

[19]張新蘭.不同品種紫花苜蓿葉片離體干旱脅迫過(guò)程中抗氧化酶活性動(dòng)態(tài).草業(yè)科學(xué),2008,25(2):77-83.

Zhang X L.Study on activity of antioxidative enzymes and drought resistance of alfalfa leaf under drought stress.Pratuacultural Science,2008,25(2):77-83.(in Chinese)

[20]周瑞蓮,張承烈.水分脅迫下紫花苜蓿葉片含水量質(zhì)膜透性、活性變化與抗旱性關(guān)系研究.中國(guó)草地,1991,13(2):20-24.

Zhou R L,Zhang C L.Alfalfa drought resistance:Correlated with changes of relative water content,membrane permeability and activities of superoxide dismutase and catalase in different water stress.Grassland of China,1991,13(2):20-24.(in Chinese)

[21]周蘊(yùn)薇,劉艷萍,戴思蘭.用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)鑒定植物抗寒性的剖析.植物生理學(xué)通訊,2006,42(5):945-950.

Zhou Y W,Liu Y P,Dai S L.Identification of cold resistant plants by chlorophyll fluorescence analysis technique.Plant Physiology Communications,2006,42(5):945-950.(in Chinese)

[22]劉琳.四川野生假儉草的抗寒性研究.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2004.

Liu L.Study on cold resistance of Sichuan wild Centipedegrass.Master Thesis.Ya’an:Sichuan Agricultural University,2004.(in Chinese)

[23]蕭洪東,王惠珍,喻敏.草坪抗逆增綠劑對(duì)細(xì)葉結(jié)縷草抗寒性的影響.草業(yè)科學(xué),2013,30(9):1344-1348.

Xiao H D,Wang H Z,Yu M.Influence of turfass stress resistance and green enhancer on chilling resistance ofZoysiatenuifolia.Pratuacultural Science,2013,30(9):1344-1348.(in Chinese)

[24]南麗麗,師尚禮,陳建綱,朱新強(qiáng),郭全恩,趙文翰.不同根型苜蓿根系對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)及其杭寒性評(píng)價(jià).中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,19(3):619-625.

Nan L L,Shi S L,Chen J G,Zhu X Q,Guo Q E,Zhao W H.Field evaluation of the response and resistance to low temperature of alfalfa root with different root types during over-wintering.Chinese Journal of Eco-Agriculture,2011,19(3):619-625.(in Chinese)

(責(zé)任編輯張瑾)

Physiological responses to low temperature stress and cold tolerance evaluation in threeElymusspecies

Zhang Shang-xiong1, Nimapingcuo2, Xu Ya-mei1,Miao Yan-jun1, Baosaihenna1, Zhang Wei-hong1

(1.College of Agriculture and Animal Husbandry of Tibet University, Linzhi 860000, China；2. Tibet Academy of Agricultural and Animal Science, Lhasa 850000, China)

Abstract:In order to screencold tolerant Elymus germplasm, the 21 days aged seedlings of three Elymus species from Tibet were used to investigate the physiological, biochemical responses and resistanceunder different low temperature treatments(18, 10, 5, 0 ℃) with 18 ℃ as check.With the increase of low temperature stress Elymus sibiricus cv. Tongde had maximum relative membrane permeability, but Baqing (E. nutans) is the minimum. The contents of chlorophyll in Baqing showed a trend of rising first then falling, but the content of Chlorophyll in Tongde and Naqu (E. nutans) increased significantly (P<0.05). The soluble protein content in Baqing had the smallest increase and it only increased 2.59 times when compared with control; The soluble protein content in Tongde and Naqu increased significantly (P<0.05), and they increased 5.31 times than the control. The soluble sugar content in Baqing and Tongde showed a trend of rising first and then falling, but the soluble sugar content in Naqu increased significantly (P<0.05) and it is 2.14 times of the control. The MDA content in Tongde had the biggest increase; the MDA content in Baqing decreased significantly at 0 ℃ when compared with that at 5 ℃(P<0.05). The free proline in all materials tested increased.Tongde had the maximum Pro content, and it increased 2.58 times when compared with control; Baqing had the minimum Pro content, it only increased 1.44 times when compared with control. The superoxide dismutase activities of Baqing showed a trend of rising first then falling. But the superoxide dismutase activities of Naqu increased significantly (P<0.05) and it is 1.65 times of control. The peroxidase activities in Naqu is the maximum and it increased 4.13 times when compared with control; The peroxidase activities in Tongde is the maximum and it is 2.19 times of control. Membership function analysis showed the order of cold resistance of three Elymus species: Baqing>Tongde>Naqu.

Key words：Elymus; cold stress; physiological characteristics; cold tolerance evaluation; Tibetan

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0489

*收稿日期：2015-08-28接受日期：2015-10-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD17B05-4)；西藏自治區(qū)科技廳基金項(xiàng)目(2013NM016)；西藏自治區(qū)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(Z2013C02N02_04)；西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院高原作物栽培與耕作學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

通信作者：苗彥軍(1971-)，男，內(nèi)蒙古四子王旗人，副教授，碩士，主要從事西藏野生牧草馴化、選育及植被恢復(fù)的教學(xué)與科研工作。

中圖分類號(hào)：S543+.903.4;Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0629(2016)6-1154-10*

Corresponding author:Miao Yan-junE-mail:myj666@126.com

張尚雄,尼瑪平措,徐雅梅,苗彥軍,包賽很那,張衛(wèi)紅.3個(gè)披堿草屬牧草對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及苗期抗寒性評(píng)價(jià).草業(yè)科學(xué),2016,33(6)：1154-1163.

Zhang S X,Nimapingcuo,Xu Y M,Miao Y J,Baosaihenna,Zhang W H.Physiological responses to low temperature stress and cold tolerance evaluation in threeElymusspecies.Pratacultural Science，2016,33(6)：1154-1163.

第一作者：張尚雄(1988-)，男，甘肅古浪人，在讀碩士生，主要從事西藏野生牧草方面的研究。E-mail：zhangshangx@126.com

E-mail：myj666@126.com