李金博，高麗華，周美亮，李詩剛，彭昭良，吳燕民

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東 深圳 523000)

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15個(gè)白三葉品種的ISSR和ITS遺傳多樣性分析

李金博1,2,3，高麗華2，周美亮2，李詩剛3，彭昭良3，吳燕民2

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東 深圳 523000)

摘要：利用ISSR標(biāo)記和ITS序列分析在我國大面積推廣應(yīng)用的15個(gè)白三葉(Trifolium repens)品種的遺傳多樣性與地理來源關(guān)系，試圖為我國白三葉新品種的選育提供遺傳理論支持。結(jié)果表明，15個(gè)白三葉品種明顯分為兩大類，第Ⅰ類有10個(gè)白三葉品種，主要來源于丹麥、澳大利亞、新西蘭和荷蘭；第Ⅱ類有5個(gè)白三葉品種，主要來源于美國、中國和阿根廷。白三葉品種聚類具有一定的地域性分布規(guī)律，ISSR和ITS均能有效地對(duì)白三葉品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，且ISSR可以更加細(xì)致地對(duì)其進(jìn)行分類。

關(guān)鍵詞：白三葉；ISSR；ITS；遺傳多樣性

白三葉(Trifoliumrepens)是豆科(Leguminosae)三葉草屬多年生草本植物，目前在溫帶、亞熱帶地區(qū)廣為種植[1-2]。白三葉具有莖葉豐富、草質(zhì)細(xì)軟、營養(yǎng)價(jià)值高、適口性好和產(chǎn)量高的特點(diǎn)，是優(yōu)良的豆科牧草，覆蓋的白三葉降解也可以提高果園土壤肥力[3]。同時(shí)，白三葉作為園林地被植物具有觀賞價(jià)值高、再生能力強(qiáng)、栽植成本低等特點(diǎn)，在園林綠化上應(yīng)用越來越多。白三葉在我國大體分布于22°-51° N，80°-130° E地區(qū)，主要為四川、云南、貴州等省，在其它省(區(qū))也有分布[4-5]。白三葉是異花授粉、自交不親和植物，自然選擇及人工育種得到的品種均具有很強(qiáng)的基因雜合性[6]，而白三葉的遺傳多樣性和多倍性也影響了白三葉的遺傳研究及新品種的培育[2]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記是由Zietkiewicz等提出的一種新型分子標(biāo)記，是在SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種通過半隨機(jī)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)，可用于檢測重復(fù)序列之間區(qū)域的DNA序列差異[7]，已廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物、果樹以及部分草資源的遺傳多樣性分析、品種鑒定等研究中[8]。利用ISSR分子標(biāo)記可以對(duì)白三葉進(jìn)行鑒定，明確其遺傳差異和親緣關(guān)系[9]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)位于18S和26S rRNA基因之間，被5.8S rRNA基因分為兩段(ITS1和ITS2)。ITS序列變異較快，可以提供豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，是許多植物類群系統(tǒng)分類與進(jìn)化分析的重要分子標(biāo)記[10]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者通過形態(tài)學(xué)分類、同工酶生化標(biāo)記、DNA分子標(biāo)記等對(duì)白三葉遺傳多樣性研究已經(jīng)有一定報(bào)道。如，利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和聚類分析方法探究白三葉的起源關(guān)系[11]；利用過氧化物酶與酯酶同工酶檢測勒代諾白三葉和其它白三葉品種的同源性[12]；利用RAPD分子標(biāo)記分析近緣雜交的白三葉的遺傳多樣性[13]；利用AFLP對(duì)52個(gè)野生及栽培種白三葉種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析[14]。通過形態(tài)學(xué)指標(biāo)和聚類分析13份新疆野生白三葉的遺傳多樣性進(jìn)行分析[15]。國內(nèi)遺傳多樣性研究大多采用形態(tài)學(xué)指標(biāo)或者同工酶法等，研究對(duì)象也往往是收集的多個(gè)野生材料，而目前生產(chǎn)上常用的白三葉品種相關(guān)研究相對(duì)較少，急需科研工作者對(duì)其進(jìn)行研究，為我國白三葉的生產(chǎn)應(yīng)用及培育提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。鑒于此，本研究利用ISSR和ITS分子標(biāo)記相互驗(yàn)證，對(duì)目前在我國大面積推廣應(yīng)用的白三葉品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期闡明白三葉遺傳多樣性與地理來源之間的關(guān)系，同時(shí)為我國白三葉新品種選育提供遺傳理論支持。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料及DNA的提取

本研究共選用常用白三葉品種15個(gè)(表1)，均于2012年從種子公司購買，全部種植在北京市順義區(qū)中國農(nóng)科院試驗(yàn)基地。試驗(yàn)地地處40°13′ N，116°38′ E，海拔35 m，年均降水量約625 mm。土壤為砂壤土，有機(jī)質(zhì)含量為1.35%，全氮含量為0.9%，速效磷含量26.16 mg·kg-1，速效鉀含量42.35 mg·kg-1，屬微堿性土壤，pH為8.3。播種3個(gè)月后對(duì)植株幼嫩葉片進(jìn)行取樣。

DNA提取利用全式金試劑盒(Transgen, China)，每個(gè)材料取15株幼嫩葉片混合取樣。PCR所需引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司(AuGCT. Biotech Co., Ltd.)合成。

1.2ISSR引物及擴(kuò)增

根據(jù)哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR序列合成100條ISSR引物。ISSR體系為25 μL，其中DNA(40 ng·μL-1)1 μL ，引物(5 mmol·L-1)1 μL，10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2 μL，Taq DNA polymerase (1 U)1 μL，dNTP(10 mmol·L-1)2 μL和無核酸酶水15.5 μL。PCR程序?yàn)?94 ℃ 5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度 55～59 ℃，1 min，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物保存在4 ℃冰箱。

電泳檢測：1.5%的瓊脂糖凝膠，指示劑為北京原平皓公司生產(chǎn)的gelsafe(10 000×)。采用北京六一廠DYY-7C型電泳儀和DYC-34A型電泳槽在90 V的電壓下進(jìn)行1 h電泳，電泳液為TAE buffer，100 bp的DNA Marker。利用伯樂公司凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行紫外觀測，記錄多態(tài)性條帶。

1.3ITS引物及擴(kuò)增測序

利用通用引物T4(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)和T5(TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，DNA(40 ng·μL-1)1 μL，上下游引物各(5 mmol·L-1)1 μL，10× buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2 μL，Taq DNA polymerase (1 U)1 μL，dNTP (10 mmol·L-1) 2 μL和無核酸酶水14.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物檢測：PCR產(chǎn)物5 μL用gelsafe染色，125 V的電壓下進(jìn)行25 min電泳，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀照相。

測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(全式金試劑盒，Transgen，China)純化后送由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程樓進(jìn)行正反向測序。

表1　供試白三葉品種名稱及來源

1.4數(shù)據(jù)分析

ISSR分析根據(jù)條帶的有無分別標(biāo)記為1或0。材料間遺傳相似系數(shù)(GS)根據(jù)公式GS=2Nij(Ni+Nj)計(jì)算，其中:Nij為材料Ni和Nj共有的擴(kuò)增片段數(shù)目，Ni為材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)目，Nj為材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)目。將GS值按不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行遺傳相似性聚類。統(tǒng)計(jì)分析在NTSYS 2.1軟件下進(jìn)行。

將所有測得的序列登錄到Genbank，獲取序列登錄號(hào)。ITS分析用DNAStar分析各序列同源性，用CLustalX 2.0完成DNA序列的完全對(duì)比，保存為.aln格式，然后運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)育軟件MEGA 4.1軟件轉(zhuǎn)換成.meg格式，系統(tǒng)樹以苜蓿(Medicagosativa)(AF053142.1)為外群采用鄰接距離矩陣法(neighbor-joining)構(gòu)建，應(yīng)用自展法(bootstrap)進(jìn)行可信度檢測，重復(fù)1 000次。

此外，首創(chuàng)經(jīng)常項(xiàng)下人民幣與緬幣特許兌換業(yè)務(wù)，兌換量已突破4億元人民幣；德宏、紅河、文山成功對(duì)外發(fā)布人民幣兌緬幣“瑞麗指數(shù)”、人民幣兌越南盾“YD指數(shù)”，匯率定價(jià)話語權(quán)有所增強(qiáng)；銀行柜臺(tái)掛牌幣種已涵蓋周邊國家貨幣。截至6月，全省銀行累計(jì)辦理人民幣對(duì)泰銖、基普、越南盾柜臺(tái)兌換交易合計(jì)2．26億元人民幣。今年5月18日，富滇銀行磨憨支行與老中銀行磨丁分行分別將500萬元人民幣通過中國磨憨口岸調(diào)入老撾、5億元老撾基普通過磨丁口岸調(diào)入中國，標(biāo)志著中老雙邊首條本外幣現(xiàn)鈔陸路調(diào)運(yùn)通道正式建立。以銀行間市場區(qū)域交易為支撐、銀行柜臺(tái)交易為基礎(chǔ)、特許兌換為補(bǔ)充的全方位、多層次區(qū)域性貨幣交易“云南模式”已經(jīng)成型。

2結(jié)果與分析

2.1利用ISSR引物對(duì)15個(gè)白三葉品種的擴(kuò)增結(jié)果

利用兩個(gè)白三葉品種海法和胡以阿對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，從中篩選出條帶清晰、重復(fù)性高、表達(dá)穩(wěn)定的5條ISSR引物，即810、816、822、826和836(表2)。

利用所選的5條引物對(duì)15個(gè)白三葉品種進(jìn)行PCR正式擴(kuò)增，共得到DNA條帶41條，擴(kuò)增條帶變幅為7～10條，平均每個(gè)引物可以擴(kuò)增出8.2條(表2)。在41條帶中，多態(tài)性條帶為38條，擴(kuò)增多態(tài)性條帶變幅為6～9條，平均占比為92.68%，平均每個(gè)引物可以擴(kuò)增出多態(tài)性條帶7.6條。這說明ISSR標(biāo)記能夠揭示出白三葉品種之間較高的多態(tài)性。

基于遺傳相似系數(shù)，對(duì)白三葉進(jìn)行UPGMA聚類分析，將15個(gè)白三葉品種聚為兩大類(圖1)。第Ⅰ類中，丹麥的百事和米爾卡親緣關(guān)系較近，且這兩個(gè)品種均為中葉型白三葉；與小葉型的瑞文德和大葉型的克朗德共同構(gòu)成了第1亞類；澳大利亞的荷蘭白和考拉親緣關(guān)系較近，新西蘭的胡以阿和鋪地關(guān)系較近，以上4個(gè)與澳大利亞的海發(fā)聚在一起為第2亞類，其中除鋪地為小葉型外，其它3個(gè)品種都為中葉型；而來自荷蘭的雷托單獨(dú)為第3亞類。說明這些白三葉品種的親緣遠(yuǎn)近主要還是與地理區(qū)域及引種歷史相關(guān)。

表2　ISSR引物序列和特異性條帶數(shù)目

圖1　基于ISSR的15個(gè)白三葉品種聚類結(jié)果

來自美國的瑞加與來自中國的鄂牧一號(hào)聚在一起后，再與來自美國的拉迪諾、路易斯安那，以及來自阿根廷的碧盛聚在一起形成第Ⅱ大類。而鄂牧一號(hào)是以瑞加為原始材料選育而來，聚類分析也證明這兩個(gè)品種親緣關(guān)系較近。美國與阿根廷均處于美洲大陸，親緣關(guān)系相對(duì)較近。

基于遺傳相似系數(shù)，對(duì)15個(gè)白三葉品種進(jìn)行主成分分析，位置相靠近者遺傳距離較近(圖2)。結(jié)果表明，主成分分析結(jié)果和遺傳聚類結(jié)果類似，主成分分析結(jié)果更直觀表明了15個(gè)白三葉品種之間的遺傳關(guān)系。

2.2利用ITS引物對(duì)15個(gè)白三葉品種的擴(kuò)增結(jié)果

利用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(圖3)，可以將15個(gè)白三葉品種和苜蓿明顯分為三大類。第Ⅰ類有10個(gè)白三葉品種，包含有來自丹麥的克朗德、米爾卡、百事和瑞文德，同時(shí)也包含了澳大利亞的荷蘭白、海法和考拉，以及新西蘭的胡以阿和鋪地，荷蘭的雷托，其中荷蘭白和考拉親緣關(guān)系較近；第Ⅱ類有5個(gè)白三葉品種，包含有美國的拉迪諾、路易斯安那和瑞加，同時(shí)也包含了中國的鄂牧一號(hào)和阿根廷的碧盛。苜蓿單獨(dú)聚為第Ⅲ類，說明本研究結(jié)果可靠。ITS聚類分析結(jié)果與ISSR聚類分析結(jié)果類似。

圖2　基于ISSR的15個(gè)白三葉品種主成分分析

圖3　基于ITS序列的15個(gè)白三葉品種系統(tǒng)發(fā)育樹

3討論

3.1ISSR分子標(biāo)記和ITS序列遺傳多樣性分析

ISSR分子標(biāo)記與ITS均將15個(gè)白三葉品種分為兩大類，且每一類包含的白三葉品種相似，說明本研究結(jié)果可靠。而ISSR分子標(biāo)記在分為兩大類的基礎(chǔ)上，又將第Ⅰ大類分為3個(gè)亞類，分類更為具體。由于ISSR是一個(gè)高度可變的DNA區(qū)域，可能產(chǎn)生更多的多態(tài)性條帶[16]，而白三葉ITS序列變異小，造成了其品種間最小遺傳距離偏小，因此，可以驗(yàn)證ISSR遺傳分析結(jié)果的可靠性，ITS更適于研究科屬的區(qū)分。ISSR標(biāo)記能有效揭示核桃(Juglansregia)品種間的遺傳多樣性，為核桃品種資源的種質(zhì)鑒定和遺傳親本的選配提供了可靠的技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)[17]。劉崢和張漢堯[18]利用ITS序列分析成功構(gòu)建了旋花科14個(gè)屬的的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3.2白三葉品種遺傳聚類與地理距離的相關(guān)及引種歷史相關(guān)分析

ISSR和ITS聚類分析表明，選擇的白三葉品種具有一定的地域性分布規(guī)律，并與引種歷史具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。據(jù)記載，白三葉的種植歷史悠久，16世紀(jì)后期，荷蘭開始用種子種植。17世紀(jì)傳入英國，隨后傳入美國、新西蘭等國[19]。來自丹麥、澳大利亞、新西蘭和荷蘭的白三葉品種聚在一起，澳大利亞和新西蘭都屬于大洋洲，由于地理關(guān)系聚在一起，而后再與新西蘭和丹麥聚在一起。而美國、阿根廷和中國的聚為一類，推測是由于育種學(xué)家在育種過程中首先選擇當(dāng)?shù)鼗蛘呦嘟貐^(qū)引進(jìn)的白三葉種質(zhì)材料進(jìn)行白三葉新品種的選育，但同時(shí)美國的瑞加和中國的鄂牧一號(hào)聚在一起，則是由于鄂牧一號(hào)是在瑞加的基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合選育的，而且鄂牧一號(hào)在國內(nèi)推廣面積不大，變異較小，還和原種保持著一定的親緣關(guān)系。由于供試白三葉品種有限，可以推測，隨著選擇白三葉品種的增多，將會(huì)有不同地區(qū)的白三葉因不同地區(qū)原種的選擇而聚在一起。研究表明，利用形態(tài)特征、SRAP、同工酶、ISSR進(jìn)行遺傳多樣性分析能夠?qū)⒋蟛糠值乩韰^(qū)域臨近的種質(zhì)材料聚在一起[19-21]。

在ISSR分類中，首先是根據(jù)地理位置將白三葉品種聚為一類，小葉型的瑞文德和大葉型的克朗德單獨(dú)與中葉型白三葉百事和米爾卡共同構(gòu)成了第1亞類，說明親緣關(guān)系與葉形大小相關(guān)性不是很強(qiáng)。

本研究表明，白三葉品種的遺傳關(guān)系與地理分布具有較大的相關(guān)性，同時(shí)也與白三葉引種歷史具有較強(qiáng)的相關(guān)性，尤其栽培品種間的平均相似系數(shù)相對(duì)較大[22]，在新品種選育過程中首先要考慮品種來源，其次考慮白三葉的葉形等相關(guān)形態(tài)性狀，對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇育種。而同時(shí)ISSR和ITS均能有效地對(duì)白三葉品種遺傳多樣性進(jìn)行分析，且ISSR可以更加細(xì)致地對(duì)其進(jìn)行分類，以后可以在更多白三葉的相關(guān)研究中加以應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯武艷培)

ISSR and ITS analysis on genetic diversity of 15 white clover cultivars

Li Jin-bo1,2,3, Gao Li-hua2, Zhou Mei-liang2, Li Shi-gang3, Peng Zhao-liang3, Wu Yan-min2

(1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China;2.Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3.Shenzhen Tech and Landscape Co.,Ltd., Shenzhen 518034, China)

Abstract:The relationship of genetic diversity with geographical origin between 15 white clover cultivars on the popularization and application of the large area in China, which provides genetic theory support the white clover breeding. The results showed that 15 white clover cultivars were divided into two categories, the class Ⅰ has 10 cultivars of white clover, mainly comes from Denmark, Australia, New Zealand and the Netherlands; There are five white clover cultivars in the class Ⅱ, mainly comes from USA, China and Argentina. White clover cultivars clustering has certain regional distribution, the genetic diversity of white clover cultivars could be studied by using ISSR and ITS analyzing , and ISSR can be more detailed on the classification.

Key words:white clover; ISSR; ITS; genetic diversity

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0093李金博,高麗華,周美亮,李詩剛,彭昭良,吳燕民.15個(gè)白三葉品種的ISSR和ITS遺傳多樣性分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(6)：1147-1153.

*收稿日期：2016-02-29接受日期：2016-03-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31572457)；鐵漢生態(tài)研究院建設(shè)(2014B090903015)；鐵漢生態(tài)院士工作站建設(shè)(2015B090904008)

通信作者：吳燕民(1955-)，男，陜西子長人，研究員，博士，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)與基因工程。E-mail：wuym65@sina.com

中圖分類號(hào)：S541+.203;Q943

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0629(2016)6-1147-07*

Corresponding author:Wu Yan-minE-mail：wuym65@sina.com

Li J B,Gao L H,Zhou M L,Li S G,Peng Z L,Wu Y M.ISSR and ITS analysis on genetic diversity of 15 white clover cultivars.Pratacultural Science，2016,33(6)：1147-1153.

第一作者：李金博(1985-)，男，河南宜陽人，在讀博士生，研究方向?yàn)椴輼I(yè)科學(xué)。 E-mail：jinbo406@126.com