武玉祥，王小平，王 虹，秦華軍，萬合峰，賈 強(qiáng)*

(1.貴州科學(xué)院貝科生物資源研究開發(fā)中心，貴州貴陽 550009；2.貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009；3.黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州凱里 556000)

?

HPLC法檢測光枝勾兒茶內(nèi)蘆丁和槲皮素方法的建立

武玉祥1，2，王小平3，王 虹2，秦華軍1，2，萬合峰1，2，賈 強(qiáng)1，2*

(1.貴州科學(xué)院貝科生物資源研究開發(fā)中心，貴州貴陽 550009；2.貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009；3.黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州凱里 556000)

摘要[目的]建立一種同時測定光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素的含量的方法。[方法]采用HPLC法對光枝勾兒茶內(nèi)的蘆丁和槲皮素進(jìn)行測定，色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1 %磷酸水溶液，檢測波長360 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。[結(jié)果]蘆丁和槲皮素分別在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。蘆丁平均回收率為98.84%，RSD為2.34%；槲皮素平均回收率為99.65%，RSD為2.51%。[結(jié)論]該方法簡便、準(zhǔn)確、精密度高、重復(fù)性好，可用于該藥材的質(zhì)量檢測。

關(guān)鍵詞光枝勾兒茶；蘆?。婚纹に?；HPLC法；含量

目前，市場上治療豬、牛、羊腹瀉的主要藥物是抗生素類，抗生素使用后在動物體內(nèi)存在殘留和抗藥性問題，食用后影響人體健康。中獸藥能有效避免藥物殘留和抗藥性的問題，成為目前研究的熱點(diǎn)[1]，如止痢散，其主要成分是光枝勾兒茶[2]。光枝勾兒茶(BerchemiapolyphyllaWall.ex.Lawson)是鼠李科勾兒茶屬的一個變種，具有清熱利濕、止咳等功效[3]，同時可治療豬、牛、羊的腹瀉[4-8]。

中獸藥進(jìn)入市場前需對藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，為此需對止痢散藥效進(jìn)行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，止痢散主要藥效源于光之勾兒茶內(nèi)的黃酮類化合物蘆丁和槲皮素[9]，測定蘆丁和槲皮素的主要方法有分光光度法和HPLC法[10-11]。檢測光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素報(bào)道較少且一般均分開檢測這2種物質(zhì)[12-13]，忽略了兩者在一起的藥效作用，對評價光之勾兒茶內(nèi)蘆丁和槲皮素的聯(lián)合藥效不夠精確，該研究采用HPLC法同時測定光枝勾兒茶內(nèi)蘆丁和槲皮素的含量，以期為評價光枝勾兒茶藥效提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器Agilent 1263LC色譜儀(美國Agilent公司)；SB2200型超聲波清洗機(jī)(上海卓越儀器有限公司)；AE200電子天平(中國梅特勒托利多公司)；優(yōu)普超純水機(jī)(成都優(yōu)普儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器公司)；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-循環(huán)水式多真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試料光枝勾兒茶采自貴州省貴陽修文、安順鎮(zhèn)寧、興義貞豐、安順關(guān)嶺、安順紫云、廣西桂林、四川成都、黔東南丹寨、畢節(jié)納雍、銅仁德江等不同地區(qū)，每個地區(qū)均采集根、藤、葉。蘆丁對照品購于中國藥品生物制品檢定所，批號10080-200707，含量90.5%；槲皮素對照品購于中國生物制品檢定所，批號10081-200406，含量97.3%。乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；水為去離子水。

1.3方法

1.3.1溶液的配置。

1.3.1.1對照品溶液的制備。精密稱取真空干燥蘆丁對照品10.9 mg，用甲醇使其充分溶解，定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為0.109 mg/mL，備用。精密稱取真空干燥槲皮素對照品10.4 mg，用甲醇使其充分溶解，并定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為0.104 mg/mL，備用。

1.3.1.2供試品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取光枝勾兒茶粉末10.00 mg，用100 mL甲醇回流提取3次，每次提取1 h，過濾，合并濾液，濾液揮發(fā)干燥，用甲醇定容至100 mL，再用0.45 μm濾膜過濾，濾液作為供試品備用。

1.3.2方法學(xué)考察。

1.3.2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-磷酸水溶液，流速1.0 mL/min，柱溫28 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長360 nm。在選定條件下，蘆丁、槲皮素色譜峰與其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，分離度(R)>1.5，蘆丁、槲皮素踏板數(shù)>3 000。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

(1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取質(zhì)量濃度為0.109 mg/mL的蘆丁對照品供試液1、2、4、6、8、10 μL進(jìn)樣，按照“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

(2)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取質(zhì)量濃度為0.104 mg/mL的槲皮素對照品供試液1、2、4、6、8、10 μL進(jìn)樣，按照“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.3.2.3精密度試驗(yàn)。取對照品溶液10 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，以峰面積計(jì)算精密度，要求RSD<3%。

1.3.2.4重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取光枝勾兒茶藥材6份樣品，按“1.3.1.2”方法操作，每份進(jìn)樣5次，每次10 μL，要求蘆丁、槲皮素的RSD<3%。

1.3.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)。取對照品、供試品各1份，室溫下分別放置0、2、4、12、24、48 h后，測定峰面積。

1.3.2.6加樣回收率試驗(yàn)。根據(jù)線性范圍設(shè)計(jì)蘆丁和槲皮素含量高、中、低3種水平，精密吸取已測知蘆丁和槲皮素含量的光枝勾兒茶藥材適量，每個水平3份，再分別按要求精密加入一定量的對照品，按“1.3.1.2”方法操作，用HPLC方法測定，計(jì)算回收率。

1.3.3樣品中蘆丁、槲皮素含量的測定。過0.45 μm濾膜后，按照“1.3.2.1”色譜條件和“1.3.1.2”供試品溶液配制方法測定蘆丁和槲皮素的含量。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。由圖1可見，在6.105 min，蘆丁對照品出現(xiàn)最大吸收峰，主峰尖銳且無雜峰；槲皮素對照品在19.375 min出現(xiàn)最大吸收峰，主峰尖銳無雜峰。樣品中蘆丁和槲皮素的最大吸收峰主峰尖銳無雜峰，最大吸收峰出現(xiàn)的時間分別在6.069和19.206 min，與對照品最大吸收峰時間十分接近。

圖1　蘆丁對照品(a)、槲皮素對照品(b)和安順紫云樣品(c)HPLC圖譜Fig. 1　HPLC value of rutin(a), quercetin(b) and Anshun Ziyun sample(c)

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按照“1.3.2.1”方法操作，得到蘆丁和槲皮素的回歸曲線分別為Y=269.9X+9.689 9(r=0.999 5)、Y=818.71X(r=0.999 9)，表明蘆丁和槲皮素的濃度分別在0.109～1.090、0.104～1.040 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗(yàn)。按照“1.3.2.3”方法操作，得到蘆丁和槲皮素RSD分別為0.32%、0.29%(n=5)，表明操作過程中儀器精密度良好。

2.1.4重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.3.2.4”方法操作，得到蘆丁、槲皮素RSD分別為2.48%、2.94%，表明方法具有較好的重復(fù)性。

2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.3.2.5”方法，得到蘆丁和槲皮素的峰面積RSD分別為1.86%、2.87%，表明樣品供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6加樣回收率試驗(yàn)。由表1可見，蘆丁平均回收率為98.84%，RSD值為2.34%，槲皮素平均回收率為99.65%，RSD值為2.51%，表明加樣回收率均符合要求。

2.2樣品中蘆丁、槲皮素含量的測定分別對采集于我國不同地區(qū)的10個光之勾兒茶樣品內(nèi)的蘆丁和槲皮素進(jìn)行同時測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，黔東南丹寨的光之勾兒茶內(nèi)蘆丁、槲皮素含量最高。

3討論與結(jié)論

該試驗(yàn)在制備供試品溶液時分別采用50%、95%的乙醇、無水乙醇、甲醇作為溶劑，經(jīng)過HPLC試驗(yàn)分析，得出甲醇溶解所得的供試品峰形、分離度均好。因此，選取甲醇為提取液。預(yù)試驗(yàn)分別采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈- 水、乙腈-0.1%磷酸為流動相系統(tǒng)，通過出峰數(shù)目、峰面積、分離度等的對比，選擇最優(yōu)的流動相為乙腈-0.1%磷酸，在此流動相系統(tǒng)時出峰的數(shù)目多，分離效果好，漂移現(xiàn)象弱，峰形好。在預(yù)試驗(yàn)過程中分別選用280、354、360 nm，其中蘆丁最大吸收波長分別為280、360 nm，槲皮素吸收最大波長分別為254、360 nm，兼顧蘆丁、槲皮素檢測靈敏度，確定最佳檢測波長為360 nm。蘆丁和槲皮素在360 nm處有最大的紫外吸收值。

該研究采用HPLC法同時測定光枝勾兒茶內(nèi)蘆丁和槲皮素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆丁和槲皮素分別在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；蘆丁平均回收率為98.84%，RSD為2.34%；槲皮素平均回收率為99.65%，RSD為2.51%。該方法簡便、準(zhǔn)確、精密度高、重復(fù)性好，可用于該藥材的質(zhì)量檢測，為光枝勾兒茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要的方法依據(jù)。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2　樣品中蘆丁及槲皮素含量測定結(jié)果

參考文獻(xiàn)

[1] 滕紅麗，陳科力，陳士林.壯藥鐵包金及其藥材商品的物種基礎(chǔ)[J].中藥材，2010(5)：675-677.

[2] 廣西藥用植物園.廣西藥用植物園藥用植物名錄[Z].2006:139-141.

[3] 湖北省中藥資源普查辦公室.中藥資源名錄[M].北京：科學(xué)出版社，1990:212.

[4] 陳德明.消炎止痢散[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1976(3):37.

[5] 措毛加.特效止痢散在仔豬腹瀉預(yù)防中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2015(1):204.

[6] 路衛(wèi)星.中藥止痢散防治仔豬腹瀉病的試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015(6):111-112.

[7] 孟慶大.藥典方劑止痢散的藥效與毒理學(xué)研究[D].長春：吉林大學(xué)，2010.

[8] 楊娟，潘琪，魏東法，等.光枝勾兒茶化學(xué)成分研究(II)[J].中國藥學(xué)雜志，2006(4):255-257.

[9] 楊娟，段文峰，彭英,等.光枝勾兒茶化學(xué)成分研究(Ⅰ)[J].中草藥，2006(6)：836-837.

[10] 吳玉強(qiáng)，鄧家剛，鐘正,等.鐵包金提取物鎮(zhèn)痛作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(4):854-855.

[11] 金越，呂勇，韓國柱，等.槲皮素及異槲皮素、蘆丁抗自由基活性的比較研究[J].中草藥，2007(3)：408-4011.

[12] 尚永輝，李華，孫家娟，等.偏最小二乘-分光光度法同時測定蘆丁與槲皮素的方法研究[J].分析測試學(xué)報(bào)，2011(4)：457-460.

[13] 滕紅麗，郭力城，李鑫.光枝勾兒茶高效液相色譜指紋圖譜研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011(5)：1233-1235.

基金項(xiàng)目貴州省科技廳重大專項(xiàng)[黔科合重大專項(xiàng)(2013)6041]。

作者簡介武玉祥(1985- )，男，山東臨沂人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事微生物學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事生物資源開發(fā)與利用研究。

收稿日期2016-03-23

中圖分類號R 284

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-164-03

Establishment of the Testing Method of Rutin and Quercetin inBerchemiapolyphyllaWall.ex.Lawson with HPLC

WU Yu-xiang1,2， WANG Xiao-ping3，WANG Hong2, JIA Qiang1,2*et al

(1.Academy of Sciences Beike Biological Resource Research and Development Center，Guiyang，Guizhou 550009；2.Guizhou Institute of Biology，Guiyang，Guizhou 550009；3.Qiandongnan National Vocational and Technical College, Kaili，Guizhou 556000)

Abstract[Objective] The determination method of rutin and quercetin in Berchemia polyphylla Wall was established at same time. [Method]The contain of rutin and quercetin in Berchemia polyphylla Wall was tested with HPLC method, in which, the column was ZORBAX SB-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); the mobile phase of acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution; the detection wavelength, 360 nm; the flow rate, 1.0 mL / min; the column temperature, 25 ℃ and the injection volume, 10 μL. [Result] There was good linear relationship between the content of rutin and quercetin and the value of testing peak area when the contain of rutin and quercetinin was in the range of 0.109～1.090 and 0.104-1.040 μg respectively. Average recovery ratio of rutin was 98.84% and RSD was 2.34%; average recovery ratio of quercetin was 99.65% and RSD 2.51%. [Conclusion] The method is simple, accurate, high precision and good repeatability that could be used in the measurement of the Chinese medicine quality.

Key wordsBerchemia polyphylla Wall；Rutin；Quercetin；HPLC；Content